Neue Techniken zur Isolierung von Mikroorganismen mit Schwerpunkt auf Laserdruck | CDhistory

Neue Isolierungsmethoden

Heutzutage wird eine Vielzahl von Methoden angewandt, um neue, bisher nicht kultivierte Mikroorganismen zu entdecken. Insbesondere werden neue Nährmedien verwendet, die spezifische Substanzen enthalten; die Kultivierung erfolgt unter verschiedenen physikalischen und chemischen Umgebungsbedingungen, wie z.B. atmosphärische Zusammensetzung, Temperatur und pH-Wert. Darüber hinaus wurden Anwendungen verdünnter Nährmedien in Kombination mit langen Inkubationszeiten sowie die gemeinsame Kultivierung von Mikroorganismen verschiedener Arten untersucht. In den letzten Jahren wurden einige grundlegend neue Kultivierungsmethoden entwickelt, die auf der Platzierung von Mikroorganismen in der natürlichen Umgebung ohne die Verwendung von Nährmedien beruhen. Bei diesen Methoden werden Diffusionskammern und Polymerbeschichtungen verwendet, in die mikrobielle Zellen eingebracht werden. In diesem Fall erhalten die Mikroorganismen alle notwendigen Nährstoffe aus der natürlichen Umgebung und bleiben von ihr isoliert. Der Nachweis eines neuen Antibiotikaproduzenten (Teixobactin) mit Hilfe solcher Methoden wird als wichtige Errungenschaft angesehen. Ein anderer Ansatz umfasst die gleichzeitige Kultivierung und das Screening von Zehn- und Hunderttausenden von bakteriellen Mikrokolonien auf porösen Polymer- oder Keramik-Isolationschips. Für die Kultivierung „unkultivierbarer“ Mikroorganismen können auch Methoden verwendet werden, die die Isolierung einzelner Zellen aus der natürlichen Umgebung ermöglichen. Die gängigsten dieser Methoden basieren auf der Verdünnung von Mikroorganismussuspensionen, der Durchflusszytometrie und Zellsortierung, der Lasermikrodissektion, der Kompartimentierung und der Anwendung von Mikromanipulatoren. Neben der Kultivierung bisher nicht kultivierter Arten von Mikroorganismen ist die Isolierung einzelner mikrobieller Zellen für die Untersuchung der Zellphysiologie, der Interaktionen zwischen den Zellen sowie für die Suche nach neuen Stoffwechselprodukten wie Antibiotika und Enzymen notwendig.

Der moderne wissenschaftliche und technologische Fortschritt bietet viele Möglichkeiten für die Entwicklung neuer Methoden zur Kultivierung, Isolierung, Manipulation und Untersuchung einzelner bakterieller Zellen und ihrer Konsortien. Neue Ansätze können den Prozess der Arbeit mit Mikroorganismen erheblich beschleunigen und die Durchführung vollständigerer und umfassenderer Studien ermöglichen. Es muss darauf hingewiesen werden, dass bisher nur sehr wenige Methoden für die Positionierung von Bakterienarrays mit Mikrometergenauigkeit vorgeschlagen wurden. In Akselrod et al. wurden dreidimensionale (3D) Netze lebender Zellen in Hydrogel ohne Verlust ihrer Lebensfähigkeit mit Hilfe von Arrays multiplexer holographischer optischer Fallen (Tweezers) mit bisher unerreichter Genauigkeit (<400 nm) gebildet. Zur Herstellung der optischen Fallen wurden zwei Laser verwendet: Ar+-Laser (20 W, 514 nm Wellenlänge) und Ti:Saphir-Laser mit kontinuierlicher Welle, abstimmbar im Bereich von λ = 850-900 nm, sowie eine Kombination aus zwei Beugungselementen, kombiniert mit verschiedenen Linsen in einem inversen optischen Mikroskop. Es wurden Netzwerke aus 3T3-Fibroblasten gebildet, die von einem Ring aus Bakterien umgeben waren. Die Fähigkeit, Hunderte von Pseudomonas aeruginosa-Bakterien gleichzeitig in zweidimensionalen (2D) und dreidimensionalen Anordnungen zu manipulieren, wurde ebenfalls demonstriert. Die Methode des holografischen optischen Einfangens ist sehr genau, aber technisch schwierig durchzuführen.

In der Studie von Rowan et al. wird die Methode der heterogenen Funktionalisierung von Oberflächen vorgeschlagen, die ein vierstufiger lithografischer Prozess ist, der auf dem Mikrokontaktdruck von organischen Monoschichten, der Implantation eines hyperverzweigten Polymers und dessen weiterer Funktionalisierung beruht. Als Ergebnis erhält man Strukturen, auf denen die gezielte Inokulation von Bakterienzellen erfolgt. Die Untersuchungen des Zellüberlebens haben gezeigt, dass die Zellen auf den erhaltenen strukturierten Oberflächen lebensfähig bleiben. Es wurden große Bakterienisolate mit 18 ± 5 Bakterien und kleine Isolate mit 2 ± 1 Bakterien erhalten. Nach dieser Arbeit kann die demonstrierte Methode für Hochdurchsatz-Screening und Biosensorik verwendet werden. Es ist jedoch schwierig, die heterogene Funktionalisierung von Oberflächen mit dieser Methode mit der biologischen Routineforschung und den Bedingungen für die Kultivierung von Mikroorganismen (Temperatur, pH-Wert, Nährstoffe usw.) zu kombinieren. Die Aufgabe, einfache Wege zu finden, um eine hohe Auflösung von lebenden Bakterienarrays mit der Möglichkeit verschiedener biologischer Studien zu verbinden, wurde in einigen Veröffentlichungen gelöst. Die in diesen Arbeiten vorgeschlagenen Ansätze sind in der Tat die Vorboten des 3D-Drucks.

In einer Studie von Weibel et al. wurde die Technik des Stempelns lebender Bakterien auf Agaroseplatten vorgeschlagen. Es wurden Bakterien-Arrays (Größe eines einzelnen Flecks mit Bakterien >200 µm) auf einer Fläche von bis zu 50 cm2 gedruckt. Die Stempel aus Polydimethylsiloxan (PDMS) wurden mit Hilfe der photolithographischen Technik hergestellt. Die erzielte Mindestgröße des Druckvorsprungs betrug 190 µm bei einer Höhe von 140 µm, was jedoch weit von der Größe entfernt ist, die zur Abtrennung von Bakterien erforderlich ist. Diese Methode ist schnell, reproduzierbar und bequem und kann verwendet werden, um das Muster, den Abstand und die Ausrichtung zwischen Kolonien verschiedener Bakterien zu kontrollieren. In der Studie von Xu et al. wurden lebende Bakterienarrays mit zellulärer Auflösung auf Agarose-Substrat gedruckt, wobei elastomere (PDMS) Stempel mit einem hohen Aspektverhältnis verwendet wurden, die durch die Methode der umgekehrten In-situ-Lithographie (RISL) hergestellt wurden. Abbildung 1 zeigt die Vorteile der RISL-Methode gegenüber der Standard-Ultraviolett-Photolithographie. Die einzige Einschränkung der RISL-Technologie ist der Vorsprungsdurchmesser, der aufgrund der optischen Beugungsgrenze kaum <1 µm betragen kann.

Die Methode des Mikrokontaktdrucks von Bakterienarrays funktioniert wie folgt: Ein Tropfen Escherichia coli im Kulturmedium LB wird auf Agarosegel (3 Gew.-% in LB) aufgebracht und auf dem Agarosesubstrat bildet sich eine Monoschicht von Bakterien (die Flüssigkeit wird vom Agarosegel absorbiert). Dann kommt der PDMS-Stempel mit einer Monoschicht von Bakterien in Kontakt, die das Agarosegel bedeckt. Der Stempel wird entfernt, wobei ein Teil der Bakterien auf ihm verbleibt. Beim Kontakt des Stempels mit der Agarosegelschicht (4 Gew.-% in LB, Dicke 200 µm) werden die Bakterien auf die Agaroseschicht übertragen. So können in wenigen Sekunden Arrays von E. coli-Bakterien direkt auf das Agarose-Substrat gedruckt werden, mit einer Auflösung im Mikrometerbereich, bis hin zu einzelnen Bakterien auf einer großen Fläche (cm2). Es wurde gezeigt, dass die Bakterien nach dem Druck des Musters weiter wachsen und sich teilen, wie unter den Bedingungen einer Massenkultur, d. h. die Bakterien behalten nach dem Druck ihr normales physiologisches Verhalten bei. Es hat sich auch gezeigt, dass die Agarosekonzentration für eine gute Druckleistung entscheidend ist. Eine zu geringe Konzentration führt zu einer Verzerrung des gedruckten Musters, während eine zu hohe Konzentration für die Bakterienkultivierung ungeeignet ist. Um Arrays aus einzelnen Bakterien zu erhalten, wurde die Wirkung einer Verringerung der anfänglichen Bakterienkonzentration in einem Tropfen des Kulturmediums LB untersucht. Für die Ausgangskonzentrationen von 109 und 108 Zellen/ml wurde die durchschnittliche Anzahl der Bakterien pro Spot mit 12,1 bzw. 1,4 gemessen. Bei den niedrigen Bakterienkonzentrationen wurde eine sehr enge Verteilung festgestellt: 44,6 % der Flecken enthielten nur eine E. coli-Zelle und 40,1 % der Flecken hatten 0 oder 2 Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Mikrokontaktdruck die Herstellung regelmäßiger Arrays aus einzelnen Bakterien ermöglicht. Außerdem wurde gezeigt, dass dieser Ansatz zur Trennung von Bakterienarrays die Analyse der Wachstumsraten einzelner Bakterienlinien ermöglicht. Diese Methodik bietet einen einfachen Weg für jede gewünschte räumliche 2D-Verteilung von Bakterien und kann sowohl für Screening als auch für Studien über bakterielle phänotypische Variation, Populationsdynamik und die Evolution von Ökosystemen verwendet werden.

Ein sich schnell entwickelnder Bereich – die Soziomikrobiologie – hat die Mechanismen identifiziert, mit deren Hilfe Bakterien an Kooperations- und Wettbewerbsbeziehungen teilnehmen, indem sie nahe gelegene Nachbarn durch physischen Kontakt und Modifikation der chemischen Zusammensetzung ihrer gemeinsamen Mikroumgebung beeinflussen. Um das Verhalten kleiner mikrobieller Aggregate zu erforschen, wurden verschiedene Technologien der Mikroverarbeitung entwickelt, die Bakterien in mikrofluidischen Geräten, Mikroresonatoren und Flüssigkeitströpfchen mit sehr geringem Volumen begrenzen. Die Fähigkeit, analytische Systeme mit Mikrofluidik zu integrieren, hat diese Isolierungsplattformen für Hochleistungsscreening auf Antibiotikaresistenz und Analyse der enzymatischen Aktivität attraktiv gemacht. So beschreiben Eun et al. eine leistungsstarke Analyse und Isolierung von Bakterienzellen, die in Agarose-Mikropartikel eingekapselt sind, mit Hilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS). Durchflussfokussierende mikrofluidische Systeme wurden verwendet, um monodisperse Mikropartikel mit einem Durchmesser von ≈30 µm zu erzeugen. Die Größe dieser Partikel machte sie kompatibel mit Durchflusszytometrie und FACS, und die Empfindlichkeit dieser Methoden reduzierte die Inkubationszeit für die Zellvermehrung vor der Durchführung der Analysen. Das geringe Volumen der Mikropartikel (≈1-50 Pikoliter) minimierte die Anzahl der für bakterielle Untersuchungen erforderlichen Reagenzien. Diese Plattform ermöglichte eine effiziente Verteilung und Isolierung von Bakterien sowie die Kombination von Methoden zur schnellen Identifizierung von Zielstrukturen für biologisch aktive kleine Moleküle. Zur experimentellen Demonstration dieser Methode wurden E. coli-Zellen in Agarose-Mikropartikel eingekapselt, in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Rifampicin inkubiert und mit Hilfe von FACS analysiert. Die minimale Hemmkonzentration von Rifampicin wurde bestimmt, und spontane Mutanten, die eine Antibiotikaresistenz aufwiesen, wurden mit Hilfe von FACS isoliert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. Mit diesem Ansatz konnten der Zeitaufwand und die Menge an Antibiotika, die zur Isolierung von Mutanten benötigt wurden, im Vergleich zu herkömmlichen mikrobiologischen Methoden mit Nährbodenplatten um das 8- bzw. 150-fache reduziert werden. Daher ist diese Methode wichtig für die chemische Biologie, die Chemie von Naturstoffen sowie für die Entdeckung und Charakterisierung biologisch aktiver Sekundärmetaboliten.

Die oben erwähnten Ansätze waren nützlich, um die Größe, Form und physikalischen Eigenschaften (Mikrohabitat) zu begrenzen; keiner von ihnen bot jedoch die Möglichkeit, die 3D-Geometrie von Bakterienaggregaten oder die Ausrichtung mehrerer Populationen willkürlich zu bestimmen. Darüber hinaus schränkt der Prozess der Verkapselung von Zellen in ultrakleinen Hohlräumen häufig den Massentransport ein, was zu Bedingungen führt, die mit dem Wachstum und der Signalübertragung zwischen physisch isolierten Populationen unvereinbar sind. Eine wachsende Zahl von Belegen unterstreicht die Bedeutung von Mikrokolonien für die bakterielle Reproduktion; es fehlt jedoch an Instrumenten zur systematischen Bewertung des Zellverhaltens in solchen Gemeinschaften. Neue Strategien zur Schaffung einer kulturellen 3D-Umgebung auf mikroskopischer Ebene können eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung der Art und Weise spielen, wie Bakterien Antibiotikaresistenz und andere soziale Verhaltensweisen in kleinen, dichten Aggregaten handhaben.

In Connell et al. und Connell et al. wird die Methode der Laserbildung von mikroskopischen 3D-Kammern auf der Grundlage der Multiphotonenlithographie (MPL) beschrieben. Die MPL-Methode hat eine hohe Durchsatzkapazität und die Fähigkeit, beliebige Muster zu erzeugen. Sie bietet Möglichkeiten für die industrielle Herstellung von 3D-Mikrogeräten wie mikrooptischen Komponenten, Gerüsten für die Gewebezüchtung und mikrofluidischen Chips. In der Studie von Connell et al. wurde Rinderserumalbumin (BSA), ein hochlösliches Protein, das zu porösen, haltbaren und biokompatiblen Hydrogelen vernetzt werden kann, zur Herstellung mikroskopischer 3D-Bakterienkammern verwendet. Einzelne Bakterien wurden in den BSA-Kammern mit einem Volumen von 1 pl eingeschlossen und dann in klonalen Populationen gezüchtet. Aufgrund der Diffusion biologisch bedeutsamer Moleküle und Antibiotika durch die Wände von BSA sowie des Austauschs von quorum-sensitiven Signalen wurde das Sozialverhalten von Bakteriengemeinschaften in Abhängigkeit von der Größe und Dichte der Population, der Form des Behälters und der Strömungsgeschwindigkeit der Umgebung untersucht.

Im menschlichen Körper existieren Bakterien normalerweise in strukturierten 3D-Gemeinschaften, die aus mehreren Bakterienarten bestehen. Um detaillierte Informationen über die Auswirkung der Geometrie auf die Pathogenität zu erhalten, wird in Connell et al. eine 3D-Druckstrategie für bakterielle Gemeinschaften beschrieben, bei der physikalisch unterschiedliche, aber chemisch interagierende Populationen einer bestimmten Größe, Form und Dichte in einer im Wesentlichen beliebigen Form organisiert werden können (Abbildung 2). Mit diesem Ansatz konnte gezeigt werden, dass die Stabilität einer einzelnen pathogenen Bakterienart gegenüber dem Antibiotikum die Resistenz der zweiten Art aufgrund ihrer 3D-Beziehungen verstärken kann. Mit Hilfe der Laserlithographietechnik wurden mikroskopische Behälter von bis zu 1 pl Volumen mit einer Behälterwandstärke von bis zu 2 µm um ausgewählte, in Gelatine suspendierte Bakterien herum gebildet, indem die Polypeptidmoleküle im Brennpunktbereich durch nichtlineare Absorption der Laserstrahlung durch Photosensibilisatormoleküle vernetzt wurden. Das Ergebnis dieser Multiphotonenabsorption ist die Bildung von Singulett-Sauerstoff, der intramolekulare und intermolekulare kovalente Vernetzungsreaktionen zwischen BSA und Gelatine stimuliert. Die einzigartigen physikalischen und chemischen Eigenschaften von Gelatine haben das Interesse an ihrer Verwendung für eine Vielzahl von Anwendungen geweckt, darunter Lagerung, Immobilisierung und 3D-Kultivierung von Bakterien. Nach dem Entfernen des überschüssigen Reagenzes werden die Bakterien in versiegelten Hohlräumen untergebracht, die von vernetzter Gelatine gebildet werden, die ein hochporöses Material ist und ein schnelles Wachstum vollständig eingeschlossener Zellpopulationen unterstützt. Es ist leicht durchlässig für Polypeptide, Antibiotika und für die physikalischen und chemischen Signale, mit deren Hilfe die Interaktion zwischen den Bakterien stattfindet. Die Isolierung von Zellen in Mikrocontainern bietet die Möglichkeit, verschiedene Arten/Dichten von Containern ineinander einzubetten sowie dynamische Änderungen in der Ausrichtung der gesamten Bakterienpopulationen innerhalb der Gemeinschaft vorzunehmen.

Die Autoren haben gezeigt, dass räumlich lokalisierte Wechselwirkungen zwischen dem grampositiven Staphylococcus aureus und dem gramnegativen P. aeruginosa-Bakterium (zwei humanpathogene Keime, die häufig persistierende Koinfektionen in Wunden, Kathetern und der Lunge von Patienten mit Mukoviszidose bilden) das Überleben von Staphylococcus bei der Behandlung mit β-Laktam-Antibiotika erhöhen können.

Der Mikro-3D-Zelldruck erweitert grundlegend die Möglichkeiten zur Untersuchung von Antibiotikaresistenzen, wenn eine einzelne bakterielle Mikrogruppe die Antibiotikaempfindlichkeit von benachbarten, umgebenden oder eingebetteten Populationen beeinflussen kann – eine Angelegenheit von besonderer Bedeutung für In-vivo-Infektionen (z.B., Wunden, Mundhöhle und zystische Fibrose in der Lunge), wo Gewebe oft von mehreren Bakterienarten gleichzeitig besiedelt werden. Die wahre Stärke des 3D-Zelldrucks liegt in der Fähigkeit, die mikrobiellen Gemeinschaften in einer unbegrenzten Anzahl von Geometrien zu organisieren. Der Mikro-3D-Zelldruck kann auch ein wertvolles Instrument für die Untersuchung der Mechanismen und der Dynamik der Anpassungsreaktionen auf Umweltbedingungen sein.