Die Reaktion des Auges auf eine intrakamerale Injektion
Es wurde vermutet, dass die F4/80+ monozytären Zellen, die für die Induktion der ACAID von zentraler Bedeutung sind, Zellen der Iris und des Ziliarkörpers sind, die von der Iris über den Schlemm’schen Kanal1,6,10 in den Blutkreislauf emigrieren. Da das Antigen mindestens 24 Stunden lang im Auge vorhanden ist, könnte das Antigen eine „Depot“-Wirkung haben, obwohl ein Teil des Antigens nach der intrakameralen Injektion des Antigens rasch in den Blutkreislauf gelangt.8 Da die intrakamerale Injektion von Antigen das Auftreten von ACAID-induzierenden PBMC induziert, ist es wahrscheinlich, dass diese monozytären Zellen und nicht das zirkulierende Antigen allein ACAID auslösen.
Eine intravitreale Injektion von Antigen induziert eine Infiltration von monozytären Zellen in die Netzhaut als ein frühes Stadium der Uveitis.11,12 Darüber hinaus induziert eine Augeninfektion ein starkes entzündliches Infiltrat in der hinteren oder vorderen Augenkammer.12-14 Im Einklang mit einer solchen Entzündung kommt es zu einem Anstieg der entzündlichen Zytokine in den Augenflüssigkeiten wie dem Kammerwasser. Dementsprechend führt eine intrakamerale Injektion von partikulärem Antigen zu einem Anstieg der mRNA für TNF-α, was auf eine frühe Entzündungsreaktion in der Vorderkammer hindeutet.14,15 Darüber hinaus wird die systemische Unterdrückung der Hypersensitivität vom verzögerten Typ bei Mäusen, die eine intrakamerale Injektion von Antikörpern gegen TNF-α zusammen mit Antigen erhalten, nicht induziert, was darauf hindeutet, dass TNF-α für die Induktion von ACAID erforderlich ist. Darüber hinaus war die Induktion von ACAID in diesen Untersuchungen abhängig von der Größe der Nadel, die für die intrakamerale Injektion löslicher Proteine verwendet wurde, und davon, ob das Antigen in partikulärer oder löslicher Form vorlag.15 Diese Autoren schlugen vor, dass die intrakamerale Injektion partikulärer Antigene und/oder die Größe der Nadel, die für die intrakamerale Injektion verwendet wurde, ein für die Induktion von ACAID erforderliches Trauma hervorruft. Makrophagen und dendritische Zellen, die den dendritischen Zellmarker CD11c exprimieren, sind in der Iris, dem Ziliarkörper und der Aderhaut des vorderen Augenabschnitts beheimatet.8,10,16,17 In die Vorderkammer injiziertes Antigen wird von diesen Zellen schnell aufgenommen. Darüber hinaus finden sich Makrophagen und dendriforme Zellen in der Nähe des Schlemm’schen Kanals17,18 , von denen man annimmt, dass sie der Ort sind, an dem F4/80+-Zellen aus der Vorderkammer in den Blutkreislauf austreten.1 Der Austritt residenter Iriszellen, die Antigen aufnehmen, in den Blutkreislauf wurde jedoch in Frage gestellt.16 Lösliches Antigen verlässt die Vorderkammer schnell über den Blutkreislauf und verteilt sich ähnlich wie intravenöses Antigen.8 Ein Teil des Antigens, das das Auge verlässt, könnte in einer tolerogenen Form vorliegen.19 Es ist jedoch wahrscheinlich, dass das intrakamerale Antigen im Thymus und in der Milz von sogenannten „tolerogenen antigenpräsentierenden Zellen“ präsentiert wird, die das Auge mit Antigen verlassen haben. Darüber hinaus induziert TGF-β im Kammerwasser oder produziert von F4/80+-Zellen der Iris einen suppressiven Phänotyp in peripheren F4/80+-Zellen10,20,21 , was darauf hindeutet, dass die Induktion eines suppressiven Phänotyps in F4/80+-Zellen in der Vorderkammer stattfindet.
Ähnlich wie bei der Behandlung von peripheren F4/80+-Zellen mit Kammerwasser und Antigen führt die Inkubation von F4/80+-Zellen aus dem Peritonealexsudat mit Antigen und TGF-β in vitro zu einem suppressiven Phänotyp bei den Zellen. Wenn diese Zellen naiven Mäusen iv injiziert werden, induzieren sie antigenspezifische regulatorische T-Zellen in der Milz, ähnlich wie bei der intrakameralen Injektion von Antigen.21 ACAID wird durch sehr wenige F4/80+-Zellen induziert, die auf diese Weise behandelt werden1 , was darauf hindeutet, dass (nicht nachweisbare) Zellen, die aus der Iris und dem Ziliarkörper auswandern, ACAID induzieren können. Darüber hinaus induzieren F4/80+ Iriszellen, die aus Mäusen gewonnen wurden, die eine intrakamerale Injektion von Antigen erhalten haben, die Induktion von ACAID oder verleihen F4/80+ PBMC einen suppressiven Phänotyp, der den zirkulierenden Zellen ähnelt, die aus Mäusen gewonnen wurden, die eine intrakamerale Injektion von Antigen erhalten haben.9,21 Es ist wahrscheinlich, dass das von den Antigen-präsentierenden Zellen der Iris aufgenommene und verarbeitete Antigen auf die PBMC übertragen werden könnte, die die Vorderkammer infiltriert haben, ähnlich wie das Antigen durch TGF-β-behandelte, Antigen-tragende Peritonealexsudatzellen auf ACAID-induzierende B-Zellen in der Milz übertragen wird.22 Zusammengenommen deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass Ereignisse innerhalb der Vorderkammer einen suppressiven Phänotyp bei nicht-ansässigen Entzündungszellen, die die Vorderkammer infiltriert haben, hervorrufen könnten.
Auf der Grundlage der obigen Überlegungen untersuchten wir die Möglichkeit, dass die intrakamerale Injektion von Antigen aufgrund des Injektionstraumas einen Zustrom von zirkulierenden PBMC in die Vorderkammer auslöst. Diese infiltrierten Zellen wären dem immunsuppressiven TGF-β im Kammerwasser und den residenten dendriformen Zellen der Iris/des Ziliarkörpers ausgesetzt, die das injizierte Antigen den infiltrierten PBMC präsentieren könnten. Entsprechend dieser Hypothese werden die Zellen, die aufgrund der durch die Injektion verursachten Schädigung in die Vorderkammer rekrutiert wurden, rezirkulieren und in den Thymus und die Milz wandern, wo sie regulatorische T-Zellen induzieren.
Innerhalb von 3 Stunden nach der intrakameralen Injektion von Ovalbumin (OVA) fanden wir auch einen Anstieg von TNF-α im Kammerwasser, wie von Ferguson et al.15 beschrieben. Außerdem haben wir sechs Stunden nach der intrakameralen Injektion einen Anstieg des Chemokins MCP-1 im Kammerwasser beobachtet (Abb. 1). Ein Nadelstich ohne Injektion von PBS induzierte das Auftreten von TNF-α im Kammerwasser, und die Injektion von PBS erhöhte die TNF-α-Menge nur um das Fünffache im Vergleich zum Nadelstich. TNF-α im Kammerwasser nimmt rasch ab und wird 12 Stunden nach der intrakameralen Injektion von Ovalbumin (OVA) nicht mehr nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). MCP-1 bleibt über einen längeren Zeitraum im Kammerwasser erhalten. Im Gegensatz zu TNF-α werden die Spitzenwerte von MCP-1 im Kammerwasser jedoch bereits 12 Stunden nach der intrakameralen Injektion von OVA erreicht und bleiben bis 16 Stunden nach der Injektion von OVA erhalten (Daten nicht gezeigt). Dieser Anstieg der TNF-α- und MCP-1-Spiegel im Kammerwasser nach der intrakameralen Injektion des Antigens deutet auf den Beginn einer Entzündungsreaktion in der Vorderkammer hin. Darüber hinaus wird weder TNF-α im Kammerwasser erhöht noch ACAID induziert, wenn die für die intrakamerale Injektion verwendete Nadel zu klein ist und/oder das Antigen nicht entzündlich ist.15
Die intrakamerale Injektion von Antigen erhöht TNF-a und MCP-1 im Kammerwasser. Drei bis sechs Stunden, nachdem 6-8 Wochen alte naive weibliche BALB/c-Mäuse iv 5 × 106 – 1 × 107 CFSE-markierte PBMC erhalten hatten, wurden die Mäuse mit einer ip-Injektion von Ketamin/Xlazin7 betäubt und erhielten eine intrakameralen Injektion von PBS, PBS + 50 μg OVA oder einen Nadelstich mit einer 24-g-Nadel. Sechs Stunden nach der intrakameralen Injektion der naiven Mäuse wurde das Kammerwasser von den euthanasierten Mäusen entnommen und 10 μl mittels ELISA auf TNF-α und MCP-1 untersucht. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt +/- S.E.M. pg von 4-6 Wiederholungen/Gruppe in 2-3 Experimenten.
Um festzustellen, ob es nach der intrakameralen Injektion von Antigen einen gleichzeitigen Zustrom von Entzündungszellen in die Vorderkammer gibt, erhielten Mäuse, denen PBMC, die mit dem Fluoreszenzfarbstoff CFSE markiert waren, intrakameral injiziert wurden, ebenfalls eine Injektion. Mit diesem Ansatz beobachteten wir einen signifikanten Zustrom von CFSE-markierten und unmarkierten (Wirts-)F4/80+ monozytären Zellen, die die Chemokinrezeptoren CCR2 und CCR5 exprimieren, wie die Wiedergewinnung dieser Zellen von der Iris der Mäuse 24 Stunden nach der intrakameralen Injektion des Antigens zeigte. Bei den Kontrollmäusen, die iv CFSE-markierte PBMC, aber keine intrakamerale Antigeninjektion erhielten, war kein Anstieg dieser Zellen zu beobachten.23 Etwa 48 Stunden nach der intrakameralen Antigeninjektion nimmt die Zahl der infiltrierten Zellen an der Iris ab und steigt in Thymus und Milz an (Abb. 2). Dieser Anstieg der zirkulierenden monozytären Zellen an der Iris ist wahrscheinlich auf eine Infiltration zirkulierender Monozyten als Reaktion auf das Trauma der intrakameralen Injektion +/- der Reizung durch PBS und/oder Antigen/PBS zurückzuführen, da die Zahl der infiltrierten monozytären Zellen zunahm, wenn die Mäuse intrakamerales Antigen erhielten: Die Infiltration von CFSE-markierten PBMC, die nur durch die Injektion induziert wurde, war <Injektion von PBS <Injektion von TNP-BSA/PBS. Monozytäre Zellen, die nach der intrakameralen Injektion von Antigen in die Iris rekrutiert werden, exprimieren sowohl CCR2 als auch CCR5.23 Die Migration der Zellen in die Iris erfordert die Expression von CCR2, nicht aber von CCR5, da CCR2 -/- PBMC nicht in die Iris wandern, während CCR5 -/- PBMC nach der intrakameralen Injektion von Antigen in die Iris wandern. Darüber hinaus induziert die intrakamerale Injektion von OVA in CCR2 -/- Mäuse keine zirkulierenden monozytären Zellen, die die Unterdrückung der verzögerten Hypersensitivität (DTH) auf OVA übertragen, wenn sie Wildtyp-Empfängern iv injiziert werden.23
Migration von PBMC nach intrakameraler Injektion. Anästhesierte7 BALB/c-Mäuse erhielten eine intrakameralen Injektion von trinitrophenyliertem Rinderalbumin sechs Stunden nachdem die Mäuse iv 5 × 106 -1 × 107 CFSE-markierte PBMC erhalten hatten. Vierundzwanzig Stunden nach der intrakameralen Injektion wurden die Mäuse durch CO2-Inhalation euthanasiert und Iris, Milz und Thymusdrüse entnommen, gepoolt und einzelne Zellsuspensionen hergestellt. Die Zellen wurden dann mit Phycocyanin-anti-F4/80 markiert und durchflusszytometrisch analysiert. Die prozentuale Zunahme der CFSE, F480+-Zellen wurde wie folgt berechnet: