Eine wichtige posttranslationale Modifikation von Histonen ist die Acetylierung von ɛ-Aminogruppen an konservierten Lysinresten in den aminoterminalen Schwänzen dieser Proteine. Durch die Acetylierung werden die positiv geladenen Lysine neutralisiert, was die Wechselwirkungen der Histone mit anderen Proteinen und/oder mit der DNA beeinflusst. Die Histonacetylierung wird seit langem mit transkriptionell aktivem Chromatin in Verbindung gebracht und ist auch an der Histonablagerung während der DNA-Replikation beteiligt (1, 2). Die erste Klonierung eines Histon-Acetyltransferase (HAT)-Gens, des Hefe-HAT1-Gens, wurde 1995 gemeldet (3). In der Folge wurde vermutet, dass das HAT1-Protein zytoplasmatisch ist und an der Histonablagerung beteiligt ist (4), obwohl das Fehlen von Phänotypen von Hefe-HAT1-Mutanten sowie jüngste Beweise dafür, dass sowohl die menschlichen als auch die Hefe-Enzyme nukleär sind (siehe 5; S. Tafrov und R.S.,
Ein wichtiger Durchbruch auf diesem Gebiet war die Reinigung und Klonierung von HAT A, einem HAT aus dem Makronucleus des Ciliaten Tetrahymena (6). Die Sequenz von HAT A zeigte, dass es einem bekannten Transkriptions-Coaktivator der Hefe, GCN5, ähnlich ist. Seitdem haben zahlreiche Studien gezeigt, dass GCN5 (und das verwandte P/CAF) konservierte HATs sind, deren Aktivität auf Nukleosomen die Initiierung der Transkription erleichtert (siehe Ref. 7). Interessanterweise kann GCN5 selbst freie Histone (insbesondere Lys-14 von H3) acetylieren, nicht aber Nukleosomen. Die Acetylierung von Nukleosomen durch GCN5 setzt voraus, dass es sich in einem der beiden großen Proteinkomplexe Ada und SAGA in Hefe befindet (8). In den letzten Jahren wurde nachgewiesen, dass mehrere Säugetierproteine, die nicht mit GCN5 verwandt sind, aber ebenfalls an der Transkriptionsaktivierung beteiligt sind, eine HAT-Aktivität besitzen. Dazu gehören CBP/p300, TAF250, ACTR und SRC-1 (9-12). Somit wird deutlich, dass die Histon-Acetylierung von Nukleosomen eine wichtige Komponente des mehrstufigen Genaktivierungsprozesses ist.
In dieser Ausgabe der Proceedings berichten Trievel et al. (13) über die Kristallstruktur der katalytischen HAT-Domäne von Hefe GCN5. Diese Domäne umfasst die Reste 99-262 des 439-aa großen Proteins. Ein Teil ihrer Struktur, bestehend aus vier antiparallelen β-Strängen (β1-4), gefolgt von einer α-Helix (α3) und einem weiteren β-Strang (β5), ist in Abb. Abb.1.1 dargestellt. Dieser Teil von GCN5 ist in seiner Struktur dem von Hefe-HAT1 (14) sehr ähnlich, ebenso wie zwei anderen N-Acetyltransferasen, deren Substrate keine Histone sind, nämlich die Aminoglycosid-3-N-Acetyltransferase (AAT; Ref. 15) und die Serotonin-N-Acetyltransferase (16). Alle diese Enzyme gehören zu einer Familie von Proteinen, die durch Sequenzanalyse als solche mit Ähnlichkeit zu bekannten N-Acetyltransferasen wie GCN5 identifiziert und daher als GNAT-Superfamilie bezeichnet wurden (17). Die Mitglieder dieser Superfamilie haben das gemeinsame Merkmal, dass sie eine Acetylgruppe von Acetyl-CoA auf eine primäre Aminogruppe übertragen, wenn auch sehr unterschiedliche Aminogruppen für die verschiedenen Enzyme, d.h., auf ɛ-Aminogruppen an Lysinen im Fall von HATs, auf α-Aminogruppen an den N-Termini von Proteinen im Fall von Enzymen wie ARD1 oder MAK3, auf Zucker im Fall von AAT (15) und GNA1 (18, 19) oder auf Serotonin für Serotonin-N-Acetyltransferase (16). Alle Mitglieder der GNAT-Superfamilie haben ein konserviertes Motiv, das als Motiv A bezeichnet wird (in Abb. 1 rot dargestellt),1) und die meisten von ihnen haben zwei weitere konservierte Motive, die als B und D bezeichnet werden.
Banddiagramm von GCN5, das den konservierten Kern zeigt, der in vier N-Acetyltransferasen und in einer N-Myristoyltransferase zu finden ist. Das Motiv A der GNAT-Superfamilie ist in rot dargestellt. Acetyl-CoA, wie es in HAT1 vorkommt, ist in die GCN5-Struktur modelliert. Der Schwefel in Acetyl-CoA ist gelb dargestellt.
Es wurde vorhergesagt, dass die konservierten Motive in der GNAT-Superfamilie an der Bindung von Acetyl-CoA beteiligt sein würden, da es das einzige Substrat ist, das diese verschiedenen N-Acetyltransferasen gemeinsam haben (17). Tatsächlich bestätigte die Struktur von HAT1 mit gebundenem Acetyl-CoA, dass Motiv A an der CoA-Bindung beteiligt ist (14), ebenso wie die strukturellen Arbeiten mit Aminoglycosid-3-N-Acetyltransferase (15) und Serotonin-N-Acetyltransferase (20). In Abb. 11 wurde Acetyl-CoA in die GCN5-Struktur modelliert, basierend auf seiner Position in HAT1 (13, 14). Das Acetyl-CoA ist in einem V-förmigen Spalt gebunden, der zwischen den β-Strängen 4 und 5 gebildet wird. Das hochkonservierte Motiv A der GNAT-Familie bindet an den Pyrophosphatanteil von Acetyl-CoA. Die Pantothenat- und β-Mercaptoethanolamin-Einheiten von CoA sind entlang β4 ausgerichtet und mit diesem wasserstoffgebunden, wodurch ein β-Strang imitiert wird.
Trievel et al. (13) schlagen einen Mechanismus für die Katalyse durch GCN5 vor. Sie schlagen vor, dass ein Glutamatrest (Glu-173) so positioniert ist, dass er ein Proton von einer NH3+-Gruppe auf dem zu acetylierenden Lysin abstrahiert, so dass die ungeladene Aminogruppe dann einen nukleophilen Angriff auf den Carbonylkohlenstoff der reaktiven Thioestergruppe von Acetyl-CoA durchführen kann. Abb. 22 zeigt eine Überlagerung der mutmaßlichen Active-Site-Bereiche von GCN5 (in gelb) und HAT1 (in rot) mit gebundenem Acetyl-CoA. Auch hier ist zu erkennen, wie ähnlich die beiden Proteine in diesem Bereich strukturell sind. Nach dem Vorschlag von Trievel et al. wäre Glu-173 von GCN5, insbesondere nach einer Umorientierung seiner Seitenkette, nahe genug am ankommenden Lysin, um die Basenkatalyse durchzuführen. In der Tat hebt die Mutation von Glu-173 zu Gln die Aktivität in vivo und in vitro auf (13). An der entsprechenden Stelle in HAT1 befindet sich kein Glu- oder Asp-Rest. Wir stellen jedoch fest, dass Glu-255 oder Asp-256 von HAT1 auf dem benachbarten β-Strang des Spaltes so positioniert sind, dass sie die gleiche katalytische Funktion ausüben könnten (Abb. (Abb.2).2). Diese Reste sind noch nicht mutiert worden.
Überlagerung von β4-α3-β5 von GCN5 (gelb) und der entsprechenden Region von HAT1 (rot). Die Proteine sind als Cα-Spuren mit gebundenem Acetyl-CoA dargestellt. Glu-173 von GCN5, von dem angenommen wird, dass es an der Katalyse beteiligt ist, ist in einer Kugel- und Stabdarstellung gezeigt, ebenso wie die Reste Glu-255 und Asp-256 von HAT1.
Aus den Strukturen von GCN5, HAT1 und zwei anderen Mitgliedern der GNAT-Superfamilie geht hervor, dass sie einen konservierten Kern teilen, einschließlich der Bindungsstelle für Acetyl-CoA (Abb. (Abb.1).1). Interessanterweise hat die N-Myristoyltransferase eine ähnliche Struktur wie die oben beschriebenen N-Acetyltransferasen (21, 22), obwohl dieses Enzym eine viel größere Acylgruppe von Myristoyl-CoA auf α-Aminogruppen von Glycinen an den N-Termini von Substratproteinen überträgt. Die Chloramphenicol-Acetyltransferase hingegen, die eine Hydroxylgruppe acetyliert, weist keine ähnliche Struktur auf. Es scheint, dass die GNAT-Enzyme, die Aminogruppen an verschiedenen Substraten acetylieren, alle auf sehr ähnliche Weise Acetyl-CoA binden und vielleicht einen ähnlichen katalytischen Mechanismus haben. Natürlich unterscheiden sich diese Enzyme in den Regionen, die das zu acetylierende Substrat binden. Was die HATs betrifft, so wird das nächste Ziel darin bestehen, eine Struktur zu bestimmen, bei der ein Histon- oder Peptidsubstrat an das Enzym gebunden ist.