Strukturelle Implikationen
Das Ergebnis der Modifikation des cysteinhaltigen Mutantenproteins (K41C) mit Bromethylamin ist ein Enzym, das mit der Wildtyp-RNase A recht eng verwandt ist. Dennoch beträgt der Wert von kcat/Km für die Katalyse durch die K41S-Ethylaminocystein-RNase A nur 8 % des Wertes des Wildtyp-Enzyms. Der Unterschied zwischen den beiden Proteinen muss in den Unterschieden zwischen einer Thioethergruppe und einer Methylengruppe liegen. Obwohl die Winkel der C-S-C-Bindungen tendenziell spitzer sind als die der C-CH2-C-Bindungen, wird dieser Unterschied durch die größere Länge der C-S-Bindungen ausgeglichen.3g,14 Molekulare Modellierung zeigt, dass die primären Amingruppen in S-Ethylaminocystein und Lysin mit einer Genauigkeit von 0,1 Å übereinander liegen können. Ein bedeutenderer Unterschied zwischen S-Ethylaminocystein und Lysin ist ihre relative Vorliebe für Gauche- statt Anti-Torsionswinkel.15 Die Antikonformation von CC-CC-Bindungen wird in Modellverbindungen durch etwa 0,8 kcal/mol begünstigt.16 Tatsächlich beträgt der durchschnittliche K41-Torsionswinkel (175 ± 3)° im Komplex von RNase A mit zyklischem 2′,3′-Uridinvanadat (U>v), einem mutmaßlichen Analogon des Übergangszustands (Abbildung 2). Im Gegensatz zu CC-CC-Bindungen ist die Gauche-Konformation von CS-CC-Bindungen um 0,05-0,20 kcal/mol begünstigt.17 Molekulare Modellierung zeigt, dass die CS-CC-Bindung eines S-Ethylaminocystein-Rests an Position 41 in der Gauche-Konformation vorliegen kann, ohne die Struktur des nativen Proteins zu stören. Daher sind die Thioether-Seitenketten an Position 41 wahrscheinlich weniger starr und ausgedehnt als die Alkyl-Seitenketten. Wir vermuten daher, dass die Katalyse durch das S-Ethylaminocystein-Enzym aufgrund der entropischen Kosten der Fixierung eines Thioethers in der Anti-Konformation nicht so effizient ist wie die durch Wildtyp-RNase A.
Struktur des aktiven Zentrums von RNase A, gebunden an Uridin-2′,3′-cyclisches Vanadat. Die Struktur wurde anhand von Röntgen- und Neutronenbeugungsdaten von Kristallen, die bei pH 5,3 gezüchtet wurden, auf 2,0 Å verfeinert. Die Seitenkette von Phenylalanin 120 und die Uracil-Base sind nicht dargestellt.
Die katalytische Effizienz hängt von der Länge der Seitenkette von Rest 41 ab. RNase A-Varianten, die eine Aminogruppe am Ende einer Seitenkette aufweisen, die länger ist als die von Lysin, sind aktivere Katalysatoren als die unmodifizierte K41C RNase A. Somit wird eine zusätzliche Länge im aktiven Zentrum toleriert. Dennoch sind Enzyme, bei denen die Aminogruppe an Position 41 durch 4 Atome von der Hauptkette getrennt ist, aktiver als solche, die durch 5 Atome getrennt sind. Dieses Ergebnis könnte sich aus der zusätzlichen Konformationsentropie oder den ungünstigen Torsionswinkeln längerer Seitenketten ergeben.
Kein signifikanter Vorteil ergibt sich, wenn der Rest 41 eine zweite Wasserstoffbrücke spenden kann. Guanidino- und Acetamidino-Gruppen haben das Potenzial, gleichzeitig mit mehr als einem Sauerstoff einer Phosphorylgruppe zu interagieren. Beispielsweise wird eine Guanidinogruppe vom HIV-1-Tat-Protein18 und von künstlichen Rezeptoren zur Bindung von Phosphorylgruppen verwendet.19 Außerdem scheint in der Staphylokokken-Nuklease und den Ribonukleasen der T1-Familie ein Arginin die Rolle von K41 in der RNase A zu spielen.20 Wir haben K41 durch einen Argininrest und einen S-Acetamidinorest ersetzt, der ein kurzes Analogon von Arginin ist. Die Werte von ΔΔG‡ für diese Enzyme sind geringer als die für die analogen Enzyme mit nur einer primären Aminogruppe in der Seitenkette der Position 41. Somit scheint eine Wasserstoffbrückenbindung für eine effiziente Katalyse auszureichen. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem kristallinen Komplex von RNase A mit U>v (Abbildung 2). Die Vanadylgruppe in U>v ist eine annähernd trigonale Bipyramide mit zwei nicht überbrückenden äquatorialen Sauerstoffatomen, O1V und O3V. Der Sauerstoff O1V nimmt eine Wasserstoffbindung von der Seitenkette von Glutamin 11 an, während O3V eine Wasserstoffbindung von der Hauptkette von Phenylalanin 120 annimmt. Nur O1V ist in der Lage, eine Wasserstoffbrückenbindung von K41 zu akzeptieren.
Mechanistische Implikationen. Die katalytische Rolle, die K41 am häufigsten zugeschrieben wird, besteht darin, die überschüssige negative Ladung zu stabilisieren, die sich während der RNA-Spaltung an den nicht verbrückenden Phosphorylsauerstoffen bildet (Abbildung 2). Der Ladungsaufbau könnte in einem pentakoordinierten Übergangszustand (oder Phosphoran-Zwischenstufe) erfolgen, wenn die 2′-Hydroxylgruppe den Phosphor angreift, um das 5′-Nukleosid zu verdrängen. Es wurde angenommen, dass diese Stabilisierung durch coulombsche Wechselwirkungen erfolgt.12c,21 Kürzlich wurde jedoch auch vorgeschlagen, dass die Stabilisierung durch eine kurze, starke Wasserstoffbindung erfolgt, die den teilweisen Transfer eines Protons von K41 beinhaltet.22
Die hervorstechenden Merkmale eines Lysinrestes sind seine positive Ladung und seine Fähigkeit, Wasserstoffbrücken zu spenden. Drei der 5 halbsynthetischen Enzyme sowie K41R haben diese Eigenschaften gemeinsam. Es ist nicht einfach, zwischen einer Wechselwirkung, die nur auf Coulomb-Kräften beruht, und einer Wechselwirkung, die auf Wasserstoffbrücken zwischen zwei geladenen Spezies beruht, zu unterscheiden. Im Folgenden wird die einfachste Erklärung gegeben, die mit den Daten in Tabelle 1 übereinstimmt.
Die Unterscheidung zwischen Wasserstoffbrücken und Coulombschen Kräften wird nirgendwo deutlicher als bei einem Vergleich zwischen dem S-Ethyltrimethylaminocystein-Enzym, das eine endständige positive Ladung besitzt, aber keine Wasserstoffbrückenbindung spenden kann, und dem S-Acetamidocystein-Enzym, das ein Amid-N-H für eine potenzielle Wasserstoffbrückenbindung besitzt, aber keine positive Ladung. Die geringe katalytische Aktivität des S-Ethyltrimethylaminocystein-Enzyms spricht stark gegen die Wirksamkeit der Coulombschen Kräfte bei der Stabilisierung des Übergangszustands. Unter sonst gleichen Bedingungen nimmt die Energie einer Ladungs-Ladungs-Wechselwirkung nur mit dem Kehrwert des Abstands ab. Der Abstand zwischen der positiven Ladung an der Seitenkette und den Phosphorylsauerstoffen ist im Vergleich zum S-Ethylaminocystein-Enzym durch die Methylgruppen vergrößert. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass dieser Abstand groß genug ist, um die beobachtete >103-fache Verringerung von kcat/Km zu bewirken, zumal die drei Methylgruppen problemlos in der Nähe der Phosphorylsauerstoffatome untergebracht werden konnten (Abbildung 2).
Die Stärke einer Wasserstoffbrückenbindung korreliert erwartungsgemäß umgekehrt mit dem pKa des gespendeten Protons, da Wasserstoffbrückenbindungen einen gewissen Protonentransfer beinhalten.23 Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, entsprechen Erhöhungen des pKa tatsächlich Abnahmen des ΔΔG‡ für halbsynthetische Enzyme mit Seitenketten vergleichbarer Länge. Bei den halbsynthetischen Enzymen, bei denen die Länge der Seitenkette mit der von Lysin vergleichbar ist, ist die Korrelation jedoch nichtlinear. Dieser Mangel an Linearität könnte darauf zurückzuführen sein, dass der pKa-Wert jeder Seitenkette von ihrer jeweiligen Umgebung im nativen Protein abhängt. So wurde der pKa-Wert von Lys41 mit 9,0,24 und nicht mit 10,6 bestimmt, wie er für das Butylammonium-Ion in Tabelle 1 angegeben ist. Verschiedene Seitenketten können in unterschiedlichem Ausmaß betroffen sein. Eine weitere, vielleicht noch bedeutendere Quelle der Nichtlinearität ist die Tatsache, dass geladene Spezies dazu neigen, sich an stärkeren Wasserstoffbrückenbindungen zu beteiligen als ungeladene Spezies. Dieses Phänomen wurde sowohl bei Proteinen25 als auch bei kleinen Molekülen, einschließlich Aminen, beobachtet.26 Der Vergleich halbsynthetischer Enzyme mit Seitenketten, die isosterisch sind, sich aber in der formalen Ladung unterscheiden, sollte eine solche Tendenz aufzeigen. So sind beispielsweise bei den Enzymen S-Acetamidinocystein und S-Acetamidocystein die Seitenketten an Position 41 identisch, mit Ausnahme eines der beiden Heteroatome, die an den terminalen Kohlenstoff gebunden sind. Der Unterschied in der Fähigkeit dieser beiden isologen Seitenketten, sich an den Übergangszustand zu binden, ist jedoch größer, als man allein aufgrund ihrer Säuregehalte erwarten würde. Hier ist die Wasserstoffbrückenbindung, die von einem geladenen Acetamidin abgegeben wird, um 4 kcal/mol stärker als die von einem ungeladenen Amid. Dieser Wert stimmt mit anderen Daten über die relativen Stärken von geladenen und ungeladenen Wasserstoffbrückenbindungen in Protein-Ligand-Wechselwirkungen überein.21 Schließlich ist bemerkenswert, dass die S-Acetamido-Seitenkette zwar keine formale Ladung und einen relativ hohen pKa-Wert aufweist, aber dennoch (wenn auch in bescheidenem Maße) zur Katalyse beiträgt. Dieses Ergebnis ist ein weiterer Beleg für die Bedeutung einer Wasserstoffbrücke, die von Rest 41 gestiftet wird, für die Katalyse.