Die Pyrosequenzierung ist eine Methode der DNA-Sequenzierung (Bestimmung der Reihenfolge der Nukleotide in der DNA), die auf dem Prinzip der „Sequenzierung durch Synthese“ beruht, bei der die Sequenzierung durch den Nachweis des von einer DNA-Polymerase eingebauten Nukleotids erfolgt. Die Pyrosequenzierung beruht auf einer Lichtdetektion auf der Grundlage einer Kettenreaktion, wenn Pyrophosphat freigesetzt wird. Daher der Name Pyrosequenzierung.
Das Prinzip der Pyrosequenzierung wurde erstmals 1993 von Bertil Pettersson, Mathias Uhlen und Pål Nyren beschrieben, indem sie die Festphasen-Sequenzierungsmethode unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten magnetischen Beads mit rekombinanter DNA-Polymerase ohne 3′-5′-Exonuklease-Aktivität (proof-reading) und Lumineszenzdetektion unter Verwendung des Enzyms Firefly-Luciferase kombinierten. Ein Gemisch aus drei Enzymen (DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase und Glühwürmchen-Luciferase) und einem Nukleotid (dNTP) wird der zu sequenzierenden einzelsträngigen DNA zugesetzt, und der Einbau des Nukleotids wird durch Messung des emittierten Lichts verfolgt. Die Intensität des Lichts bestimmt, ob 0, 1 oder mehr Nukleotide eingebaut wurden, und zeigt somit an, wie viele komplementäre Nukleotide auf dem Vorlagenstrang vorhanden sind. Die Nukleotidmischung wird entfernt, bevor die nächste Nukleotidmischung hinzugefügt wird. Dieser Vorgang wird mit jedem der vier Nukleotide wiederholt, bis die DNA-Sequenz der einzelsträngigen Vorlage bestimmt ist.
Eine zweite lösungsbasierte Methode für die Pyrosequenzierung wurde 1998 von Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen und Pål Nyren beschrieben. Bei dieser alternativen Methode wird ein zusätzliches Enzym Apyrase eingeführt, um Nukleotide zu entfernen, die von der DNA-Polymerase nicht eingebaut werden. Auf diese Weise konnte die Enzymmischung, die die DNA-Polymerase, die Luziferase und die Apyrase enthält, zu Beginn zugegeben und während des gesamten Verfahrens beibehalten werden, so dass ein einfacher, automatisierbarer Aufbau möglich war. Ein automatisiertes Instrument, das auf diesem Prinzip basiert, wurde im folgenden Jahr von der Firma Pyrosequencing auf den Markt gebracht.
Eine dritte mikrofluidische Variante der Pyrosequencing-Methode wurde 2005 von Jonathan Rothberg und Mitarbeitern der Firma 454 Life Sciences beschrieben. Dieser alternative Ansatz für die Pyrosequenzierung basierte auf dem ursprünglichen Prinzip, die zu sequenzierende DNA auf einem festen Träger zu befestigen, und sie zeigten, dass die Sequenzierung mit Hilfe eines mikrofabrizierten Microarrays hochgradig parallel durchgeführt werden kann. Dies ermöglichte eine DNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz, und ein automatisiertes Gerät wurde auf den Markt gebracht. Dies wurde das erste Sequenzierungsinstrument der nächsten Generation und leitete eine neue Ära in der Genomforschung ein, da die Preise für die DNA-Sequenzierung rapide fielen und die Sequenzierung des gesamten Genoms zu erschwinglichen Preisen möglich wurde.