Regulation von Acetat und Acetyl-.CoA umwandelnden Enzyme während des Wachstums auf Acetat und/oder Glukose in dem halophilen Archaeon Haloarcula marismortui

Abstract

Haloarcula marismortui bildete Acetat während des aeroben Wachstums auf Glukose und nutzte Acetat als Wachstumssubstrat. Bei Glucose/Acetat-Gemischen wurde diauxisches Wachstum beobachtet, wobei Glucose das bevorzugte Substrat war. Die Regulierung der Enzymaktivitäten im Zusammenhang mit dem Glukose- und Acetatstoffwechsel wurde analysiert. Es wurde festgestellt, dass sowohl die Glukose-Dehydrogenase (GDH) als auch die ADP-bildende Acetyl-CoA-Synthetase (ACD) während der Perioden des Glukoseverbrauchs und der Acetatbildung hochreguliert wurden, während sowohl die AMP-bildende Acetyl-CoA-Synthetase (ACS) als auch die Malatsynthase (MS) herunterreguliert wurden. Umgekehrt wurde in Zeiten des Acetatverbrauchs eine Hochregulierung von ACS und MS und eine Herunterregulierung von ACD und GDH beobachtet. MS wurde auch während des Wachstums auf Peptiden in Abwesenheit von Acetat hochreguliert. Aus den Daten schließen wir, dass eine Glukose-induzierbare ACD die Acetatbildung katalysiert, während die Acetataktivierung durch eine Acetat-induzierbare ACS katalysiert wird; sowohl ACS als auch MS werden offenbar durch Acetat induziert und durch Glukose unterdrückt.

1 Einleitung

Verschiedene halophile Archaeen, darunter Haloarcula marismortui, wachsen auf Glukose, die über einen modifizierten, semiphosphorylierten Entner-Doudoroff (ED)-Weg abgebaut wird. Es wurde gezeigt, dass während des exponentiellen Wachstums auf Glukose erhebliche Mengen an Acetat gebildet wurden. Neuere Studien deuten darauf hin, dass die Bildung von Acetat aus Acetyl-CoA in halophilen Archaeen durch eine ADP-bildende Acetyl-CoA-Synthetase (ACD) katalysiert wird (Acetyl-CoA + ADP + Pi⇆ Acetat + ATP + CoA). Diese ungewöhnliche Synthetase wurde in allen acetatbildenden Archaeen, einschließlich anaerober Hyperthermophiler, gefunden und stellt einen neuen Mechanismus der Acetatbildung und ATP-Synthese bei Prokaryoten dar. In anaeroben hyperthermophilen Archaeen, z. B. Pyrococcus furiosus, stellt ACD die wichtigste energiesparende Reaktion während des Zucker-, Pyruvat- und Peptidstoffwechsels dar. Im Gegensatz zum Ein-Enzym-Mechanismus der Archaeen verwenden alle Bakterien den „klassischen“ Zwei-Enzym-Mechanismus für die Umwandlung von Acetyl-CoA in Acetat, an dem die Phosphat-Acetyltransferase (PTA) und die Acetat-Kinase (AK) beteiligt sind.

Einige Haloarchaeen, darunter H. marismortui, Haloferax volcanii und Halorubrum saccharovorum, wachsen auf Acetat als Substrat. Der Metabolismus von Acetat wird durch seine Aktivierung zu Acetyl-CoA eingeleitet. Vor kurzem haben wir erstmals nachgewiesen, dass die Aktivierung von Acetat zu Acetyl-CoA in Haloarchaea durch eine AMP-bildende Acetyl-CoA-Synthetase (ACS) katalysiert wird (Acetat + ATP + CoA → Acetyl-CoA + AMP + PPi). ACS ist das wichtigste Enzym der Acetataktivierung für die meisten Acetat verwertenden Organismen aus allen drei Lebensbereichen. Nur wenige Bakterien, z. B. Corynebacterium glutamicum, und auch das acetoklastische methanogene Archaeon Methanosarcina ssp. aktivieren Acetat über das AK/PTA-Paar zu Acetyl-CoA. Der AK/PTA-Weg kann also in vivo reversibel arbeiten, d.h. sowohl in Richtung der Acetatbildung als auch in Richtung der Acetataktivierung. Im Gegensatz dazu deuten erste Analysen darauf hin, dass in Haloarchaea ACD, das archaeische Gegenstück zum AK/PTA-Paar, in vivo in Richtung Acetatbildung arbeitet, obwohl das Enzym in vitro eine reversible Reaktion katalysiert.

Um die physiologische Rolle weiter aufzuklären und erste Einblicke in die substratabhängige Regulation von Acetat- und Acetyl-CoA-umwandelnden Enzymen in Haloarchaea zu erhalten, führten wir Substratverschiebungsexperimente mit H. marismortui durch und analysierten das Wachstum mit Glukose, Acetat, Glukose/Acetat-Gemischen und Peptiden. Während des Wachstums wurden die Aktivitätsprofile der Acetat- und Acetyl-CoA-umwandelnden Enzyme ACD und ACS sowie der Glukosedehydrogenase, des ersten Enzyms beim Glukoseabbau über den modifizierten ED-Weg, analysiert. Darüber hinaus wurden die Aktivitäten der Malat-Synthase, eines Schlüsselenzyms des Glyoxylatzyklus, das in Haloarchaea aktiv sein soll, bestimmt.

2 Materialien und Methoden

2.1 Wachstum von H. marismortui auf Glukose, Acetat, Glukose/Acetat-Mischungen und auf Peptiden

Haloarcula marismortui wurde aerob bei 37 °C auf einem komplexen Medium gezüchtet, das Hefeextrakt, Casaminosäuren und zusätzlich Glukose und/oder Acetat enthält, wie zuvor beschrieben. Für das Wachstum auf einer Glukose/Acetat-Mischung wurde dieses Medium mit 12,5 mM Glukose und 30 mM Acetat angereichert. Das Wachstum auf Peptiden wurde auf dem komplexen Medium in Abwesenheit von Acetat und Glukose durchgeführt. Die Wachstumsexperimente wurden in 2-Liter-Fermentern (fairmen tec, Deutschland) mit einer Rührergeschwindigkeit von 500 U/min und einem Druckluftdurchsatz von 600 ml pro Minute durchgeführt. Das Wachstum wurde durch Messung der optischen Dichte bei 578 nm (ΔOD578) verfolgt. ΔOD578 von 1 entsprach einem Proteingehalt von 0,5-0,6 mg/ml. Glucose und Acetat wurden enzymatisch bestimmt wie in

2.2 Herstellung von Zellextrakten

In verschiedenen Wachstumsphasen wurden Zellen von H. marismortui (100-200 ml der Kultur) geerntet und Zellextrakte hergestellt wie in beschrieben. Die Proteine wurden nach der Bradford-Methode mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt.

2.3 Bestimmung der Enzymaktivitäten

Alle Enzymtests wurden unter aeroben Bedingungen bei 37 °C in Küvetten durchgeführt, die mit 1 ml Testmischung gefüllt waren. Die Hilfsenzyme wurden in der Regel kurz vor Beginn der Reaktion zugegeben und es wurde sichergestellt, dass diese Enzyme nicht geschwindigkeitslimitierend sind. Eine Einheit (1 U) der Enzymaktivität ist definiert als 1 μmol verbrauchtes Substrat oder gebildetes Produkt pro Minute.

• Acetyl-CoA-Synthetase (ADP-bildend) (ACD) (E.C. 6.2.1.13) wurde gemessen wie in

• Acetyl-CoA-Synthetase (AMP-bildend) (ACS) (E.C. 6.2.1.1.) wurde die PPi- und AMP-abhängige HSCoA-Freisetzung aus Acetyl-CoA nach Srere et al. mit Ellmans Thiol-Reagenz, 5′5-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB), durch Messung der Bildung des Thiophenolat-Anions bei 412 nm (ε412= 13,6 mM-1 cm-1) überwacht. Die Testmischung enthielt 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,25 M KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1 mM Acetyl-CoA, 2 mM AMP, 2 mM PPi und Extrakt.

• Malat-Synthase (E.C. 4.1.3.2.) wurde in einem modifizierten Assay nach Serrano et al. mit DTNB überwacht. Die Testmischung enthielt 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 0,2 mM Acetyl-CoA, 0,5 mM Glyoxylat und Extrakt.

• Glucose-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.47) wurde nach Johnsen et al. gemessen.

• Acetatkinase (E.C. 2.7.2.1.) wurde gemessen wie in .

• Phosphotransacetylase (E.C. 2.3.1.8.) wurde als Pi abhängige HSCoA-Freisetzung aus Acetyl-CoA mit DTNB überwacht. Die Testmischung enthielt 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1,5 mM Acetyl-CoA, 5 mM KH2PO4 und Extrakt.

3 Ergebnisse

Um die physiologische Funktion und Regulierung von Enzymen im Zusammenhang mit dem Acetat- und Acetyl-CoA-Stoffwechsel zu untersuchen, wurden Zellen von H. marismortui, die auf verschiedenen Substraten vorgewachsen waren, auf acetat- und/oder glukose- bzw. peptidhaltiges Medium umgestellt und die Aktivitätsprofile von ACD, ACS, GDH und MS analysiert.

3.1 Wachstum von acetatadaptierten Zellen auf Glukose

Nach einer Verzögerungsphase wuchsen die Zellen exponentiell und Glukose wurde vollständig verbraucht. Parallel zum Glukoseverbrauch wurden erhebliche Mengen an Acetat gebildet. In dieser Zeit nahmen die Aktivitäten von GDH und ACD zu, während die Aktivitäten von ACS und MS, die in acetatadaptierten Zellen aktiv waren, vollständig herunterreguliert wurden. In der stationären Phase wurde das ausgeschiedene Acetat vollständig wieder aufgenommen und die Aktivitäten von ACS und MS stiegen an, während die Aktivitäten von GDH und ACD abnahmen (Abb. 1).

3.2 Wachstum glukoseadaptierter Zellen auf Acetat

Glukoseadaptierte Zellen wuchsen auf acetathaltigem Medium zunächst (ca. 30 h) mit einer Verdopplungszeit von 10 h bis zu einer optischen Dichte (ΔOD578) von 1. In dieser Wachstumsphase wurde kein Acetatverbrauch beobachtet und die Zellen wuchsen auf den im Medium vorhandenen Peptiden. Nach diesem Zeitraum wuchsen die Zellen mit einer reduzierten Wachstumsrate bis zu einem ΔOD578 von 1,8, und Acetat wurde vollständig verbraucht. Während des Acetatverbrauchs nahmen die ACD- und GDH-Aktivitäten ab, während die ACS- und MS-Aktivitäten, die in glukoseadaptierten Zellen nicht nachgewiesen werden konnten, zunahmen. Der Anstieg der MS-Aktivität begann während des Wachstums auf Peptiden, während der Anstieg der ACS-Aktivität parallel zum Acetatverbrauch verlief (Abb. 2).

3.3 Wachstum auf Glucose/Acetat-Gemischen

Zellen von H. marismortui, die an Hefeextrakt und Casaminosäuren adaptiert waren, wurden in ein Medium überführt, das sowohl Glucose als auch Acetat enthielt. Die Zellen zeigten ein diauxisches Wachstum mit sequentieller Nutzung von Glukose und Acetat. In der ersten Wachstumsphase wuchsen die Zellen bis zu einem ΔOD578 von 4,0 und verbrauchten Glukose. Nach dem Glukoseverbrauch und einer kurzen Verzögerungsphase traten die Zellen in die zweite Wachstumsphase ein, in der Acetat verstoffwechselt wurde und die Zellen auf ein endgültiges ΔOD578 von 5,2 wuchsen. In der ersten Wachstumsphase nahmen parallel zum Glukoseverbrauch die ACD- und GDH-Aktivitäten zu, während die ACS-Aktivität nicht nachgewiesen werden konnte und die MS-Aktivität vollständig herunterreguliert wurde. In der zweiten Wachstumsphase parallel zur Acetatverwertung nahmen die ACS- und MS-Aktivitäten zu und die ACD- und GDH-Aktivitäten ab (Abb. 3).

3.4 Glukose-adaptierte Zellen auf Peptiden

Glukose-adaptierte Zellen wurden in Abwesenheit von Glukose und Acetat in ein Medium mit 0,25 % Hefeextrakt und 0,5 % Casaminosäuren überführt. Die Zellen wuchsen mit einer Verdopplungszeit von 13 Stunden bis zu einem ΔOD578 von 2,5. Eine Acetatbildung konnte nicht nachgewiesen werden. Während des exponentiellen Wachstums nahmen ACD (von 60 auf 20 mU/mg) und GDH (von 80 auf 40 mU/mg) ab, und die MS-Aktivität, die zunächst nicht nachgewiesen werden konnte, stieg auf bis zu 20 mU/mg an. Die ACS-Aktivität konnte während der exponentiellen Wachstumsphase nicht nachgewiesen werden, stieg aber während der stationären Phase an (13 mU/mg).

4 Diskussion

In dieser Arbeit haben wir die physiologische Rolle der Acetat- und Acetyl-CoA-umwandelnden Enzyme (ACD, ACS) in H. marismortui analysiert und erste Hinweise auf eine substratspezifische Regulation dieser Enzyme sowie von GDH und MS gegeben. Die Daten werden im Vergleich mit bekannten bakteriellen Systemen diskutiert.

4.1 Die Acetatbildung in H. marismortui wird durch ACD als Teil des „Überlauf“-Stoffwechsels katalysiert

Während des Wachstums auf Glukose und auf Glukose/Acetat-Gemischen nahmen sowohl die ACD- als auch die GDH-Aktivitäten parallel zu den Phasen des Glukoseverbrauchs und der Acetatbildung zu (Abb. 1 und 3). Umgekehrt nahmen beide Aktivitäten während des Wachstums mit Acetat oder Peptiden ab. Diese Daten und das Fehlen von AK/PTA deuten darauf hin, dass die Bildung von Acetat in Haloarcula durch ACD katalysiert wird. Die physiologische Rolle der Acetatbildung in H. marismortui und ihre Regulierung während des aeroben Wachstums mit Glukose ist nicht bekannt; die Acetatbildung könnte Teil eines „Überlauf“-Stoffwechsels sein, der bei verschiedenen Bakterien, z. B. Escherichia coli und Bacillus subtilis, eingehend untersucht wurde. Wie bei H. marismortui scheiden beide Bakterien während des aeroben Wachstums bei überschüssiger Glukose Acetat aus und verwerten es in der stationären Phase wieder. Es wurde vermutet, dass die Acetatausscheidung unter Bedingungen erfolgt, bei denen die Glykolyse schneller abläuft als die nachfolgenden Stoffwechselwege, z. B. der Zitronensäurezyklus und die für die vollständige Oxidation der Glukose erforderliche Atmung. Unter diesen Bedingungen wird Acetyl-CoA in Acetat umgewandelt und ausgeschieden. Transkriptionsanalysen sowohl mit E. coli als auch mit B. subtilis deuten auf eine glucosespezifische Induktion glykolytischer Gene und eine Unterdrückung von Genen des Zitronensäurezyklus und der Atmung hin. Eine ähnliche glukosespezifische Transkriptionsregulierung, d. h. Hochregulierung von glykolytischen Genen des modifizierten Entner-Doudoroff-Stoffwechsels und Herunterregulierung einiger Gene des Zitronensäurezyklus und der Atmung, wurde kürzlich für das halophile Archaeon H. volcanii berichtet. Daher ist in Haloarchaea ein glucosespezifischer Überlaufstoffwechsel wahrscheinlich, der zur Acetatbildung führt. Die Acetatbildung in E. coli und B. subtilis erfolgt durch den bakteriellen Zwei-Enzym-Mechanismus über PTA und AK, während die Acetatbildung in Haloarchaea durch ACD, den archäischen Ein-Enzym-Mechanismus, katalysiert wird. Sowohl in E. coli als auch in B. subtilis wurde festgestellt, dass Glukose die kodierenden pta- und ack-Gene induziert, was auf eine koordinierte Regulierung von Glykolyse und Acetatbildung hinweist. Bisher wurde die transkriptionelle Regulierung der acetatbildenden ACD im Archaeon H. marismortui noch nicht untersucht. Die koordinierte Regulierung der GDH- und der ACD-Aktivität deutet jedoch auf eine ähnliche glukosespezifische transkriptionelle Regulierung sowohl der Glykolyse durch den modifizierten Entner-Doudoroff-Weg als auch der Acetatbildung durch ACD hin.

Während des aeroben Wachstums auf Peptiden bildete H. marismortui kein Acetat und die ACD-Aktivität war herunterreguliert. In dieser Hinsicht unterscheidet sich Haloarcula von dem Bakterium E. coli, das während des aeroben Wachstums auf Peptiden im Zuge eines „Überlauf“-Stoffwechsels erhebliche Mengen an Acetat bildet. H. marismortui unterscheidet sich auch von dem anaeroben hyperthermophilen Archaeon P. furiosus und anderen anaeroben, hyperthermophilen Archaeen, die während des anaeroben Wachstums sowohl auf Zucker als auch auf Peptide mittels ACD große Mengen an Acetat bilden. Während der anaeroben Peptid- und Zuckergärung von P. furiosus stellt die Acetatbildung durch ACD den Hauptort der ATP-Bildung durch Phosphorylierung auf Substratebene dar; im Gegensatz dazu wird während des aeroben Abbaus von Zuckern und Peptiden durch H. marismortui die meiste Energie durch Elektronentransportphosphorylierung in der Atmungskette konserviert, so dass die Acetatbildung durch ACD weniger wichtig oder überflüssig ist. Somit scheint die Acetatbildung durch ACD in Haloarcula auf den Zuckerstoffwechsel im Rahmen eines „Überlauf“-Stoffwechsels beschränkt zu sein.

4.2 Die Aktivierung von Acetat zu Acetyl-CoA in H. marismortui wird durch ACS katalysiert

Dies wurde aus der Hochregulierung der ACS-Aktivität parallel zum Acetatverbrauch geschlossen (Abb. 1, 2, 3). Eine Rolle der ACD bei der Acetataktivierung konnte ausgeschlossen werden, da die ACD in Zeiten des Acetatverbrauchs herunterreguliert wurde. Somit funktioniert ACD in Haloarcula in vivo nur in Richtung der Acetatbildung. ACS ist auch der häufigste Mechanismus der Acetataktivierung in Bakterien, wo er streng reguliert wird; z. B. wird in E. coli und B. subtilis das acs-Gen durch Acetat induziert und durch Glukose unterdrückt. Bei Haloarcula deutet die Hochregulierung der ACS-Aktivität durch Acetat und die Herabregulierung durch Glukose auf eine ähnliche Regulierung auf Transkriptionsebene hin, wie sie für Bakterien berichtet wurde. Es sei darauf hingewiesen, dass das Bakterium C. glutamicum im Gegensatz zu E. coli und B. subtilis Acetat durch einen Acetat-induzierten AK/PTA-Weg aktiviert.

Die Aktivität von MS, einem Schlüsselenzym des Glyoxylatzyklus, wurde in Zeiten des Acetatverbrauchs in H. marismortui zusammen mit ACS hochreguliert, was auf eine Acetat-spezifische koordinierte Regulierung von ACS und dem anaplerotischen Glyoxylatzyklus schließen lässt. Sowohl die MS- als auch die ACS-Aktivität wurden durch Glukose herunterreguliert. Eine koordinierte acetatspezifische Induktion von Genen der Enzyme der Acetataktivierung (siehe oben) und des Glyoxylatwegs wurde für mehrere Bakterien, darunter E. coli und C. glutamicum, berichtet. Kürzlich wurden für das halophile Archaeon H. volcanii erste Hinweise auf eine Induktion sowohl der Malat-Synthase- als auch der Isocitrat-Lyase-Gene durch Acetat gegeben.

Allerdings wurde die MS-Aktivität und nicht die ACS-Aktivität auch während des exponentiellen Wachstums auf Peptiden in Abwesenheit von Acetat hochreguliert, was darauf hindeutet, dass die Regulierung der MS komplexer und nicht auf Acetat beschränkt ist. Eine Rolle der MS (und des Glyoxylatzyklus) im Peptidstoffwechsel könnte dadurch erklärt werden, dass viele Aminosäuren zu Acetyl-CoA abgebaut werden, was einen funktionierenden Glyoxylatweg für den Anabolismus erfordern würde. Die Zunahme der ACS-Aktivität, die in der stationären Phase während des Wachstums auf Peptiden beobachtet wird, kann bisher nicht erklärt werden, sie könnte auf eine allgemeine Stressreaktion der Zellen in der stationären Phase zurückzuführen sein.

4.3 Glukosespezifische Katabolitenunterdrückung in H. marismortui

Haloarcula marismortui zeigte diauxisches Wachstum auf Glukose/Acetat-Gemischen mit Glukose als bevorzugtem Substrat, was auf eine Art katabolische Unterdrückung der Acetatverwertung durch Glukose hinweist. Die glucosespezifische Katabolitunterdrückung wurde bei Archaeen bisher nicht untersucht. Bei Bakterien wurde die molekulare Grundlage der Unterdrückung des Kohlenstoffkatabolismus durch Glukose eingehend untersucht, z. B. bei E. coli und B. subtilis. Beim Wachstum von C. glutamicum auf Glucose/Acetat-Gemischen wurde ein monophasisches Wachstum mit gleichzeitigem Verbrauch von Acetat und Glucose beschrieben, während bei Azotobacter vinelandii Acetat das bevorzugte Substrat ist. Die Regulationsprinzipien hinter diesen Merkmalen werden derzeit untersucht.

Weitere Studien sind notwendig, um die vorgeschlagene substratspezifische Regulation der acetatbildenden und acetataktivierenden Enzyme, ACD und ACS, in Bezug auf den Acetat- und Glukosestoffwechsel auf der Transkriptionsebene zu untermauern. Diese Studien, die die Reinigung und Identifizierung der kodierenden Gene von ACD und ACS aus H. marismortui erfordern, sind in Arbeit.