Rekombinante Pharmazeutika aus mikrobiellen Zellen: ein Update 2015

Zellfabriken

Seit den Anfängen der rekombinanten DNA hat das zunehmende Verständnis der Zellphysiologie und des Zellstresses sowie der Faktoren, die an der heterologen Genexpression und Proteinproduktion beteiligt sind, die Verwendung verschiedener lebender Fabriken ermöglicht, nämlich prokaryotische und eukaryotische Zellen, Pflanzen oder Tiere. Durch den Einsatz dieser Systeme löst die rekombinante Produktion das Problem der Verfügbarkeit von Quellen, gilt als biologisch sicheres und umweltfreundliches Verfahren und bietet die Möglichkeit, Aminosäuresequenzen und damit die Proteinfunktion zu verändern, um das Produkt besser an die gewünschte Funktion anzupassen. Es gibt ein breites und wachsendes Spektrum an Expressionssystemen, die für die Produktion rekombinanter Proteine zur Verfügung stehen. Als der biopharmazeutische Sektor in den 1980er Jahren aufkam, war Escherichia coli die vorherrschende Plattform, gefolgt von der Einführung der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Beide Systeme und die damit verbundenen genetischen Methoden zeichnen sich durch eine ungewöhnlich hohe Vielseitigkeit aus, so dass sie an unterschiedliche Produktionsanforderungen angepasst werden können. Trotz der Erforschung von Insektenzellen als ursprünglich erfolgreiches System, insbesondere für impfstofforientierte Proteine, sind Säugetierzelllinien (vor allem CHO-Zellen) heute das vorherrschende tierische Zellsystem aufgrund ihrer Eignung zur Herstellung bequemer glykosylierter Proteine (Abb. 1). Die Fähigkeit, posttranslationale Modifikationen durchzuführen, steht im Gegensatz zu den komplexen Ernährungsanforderungen, dem langsamen Wachstum und der Empfindlichkeit sowie den relativ hohen Produktionszeiten und -kosten. Unter den vielen konventionellen und neu entstehenden zellbasierten Systemen für die Proteinproduktion sind Bakterien, Hefen und Säugetierzelllinien in der Biopharmazie am weitesten verbreitet, und sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Systeme entwickeln sich ständig weiter und konkurrieren miteinander, um ihre Eigenschaften zu verbessern und sich als bevorzugte Plattformen für die Produktion von Proteinwirkstoffen zu etablieren. Obwohl Bakterien ihre frühere führende Rolle in diesem Bereich verloren haben, werden immer noch etwa 30 % der vermarkteten Biopharmazeutika in diesem System hergestellt, was durch die ungewöhnliche physiologische und genetische Manipulierbarkeit prokaryotischer Zellen unterstützt wird.

Das Hauptziel bei der Entwicklung neuer Proteinproduktionsplattformen besteht darin, die Funktionalität von Arzneimitteln durch erfolgreiche Proteinfaltung und posttranslationale Modifikationen zu verbessern und gleichzeitig die geringe Komplexität und hohe Flexibilität zu erhalten, die mit der prokaryotischen Zellkultur verbunden sind. In diesem Zusammenhang ermöglichen grampositive Bakterien wie Bacillus megaterium und Lactococcus lactis eine effiziente Proteinsekretion in Abwesenheit endotoxischer Zellwandkomponenten, während filamentöse Pilze (wie Trichoderma reesei, ), Moose (Physcomitrella patens, ) und Protozoen (Leishmania tarentolae, ) Glykosylierungsmuster fördern, die denen von Säugetierproteinen ähnlich sind, aber dennoch mit einfacheren Methoden kultiviert werden, als sie für Säugetierzellen erforderlich sind. Ausführliche Beschreibungen neuer (bakterieller und nichtbakterieller) Plattformen, die speziell für die Herstellung hochwertiger Proteinarzneimittel entwickelt wurden, sind an anderer Stelle zu finden. Die jüngste Entwicklung eines endotoxinfreien E. coli-Stammes und seine Anwendung bei der Herstellung von Proteinen und Proteinmaterialien ebnet den Weg für eine kosteneffiziente und vielseitige Produktion von Proteinen für biomedizinische Zwecke, indem die Schritte zur Endotoxinentfernung übersprungen werden, wodurch die biologische Sicherheit erhöht und die Produktionskosten gesenkt werden. Es ist zu hoffen, dass all diese neuen Systeme bald verbesserte Produkte in noch einfachen und vollständig kontrollierten Biofabrikationsverfahren anbieten werden.

Trends bei Protein-Biopharmazeutika

Nahezu 400 Produkte auf der Basis rekombinanter Proteine wurden erfolgreich hergestellt und sind als Biopharmazeutika zugelassen, ein Begriff, der sich auf therapeutische Produkte bezieht, die durch Technologien unter Einbeziehung lebender Organismen erzeugt werden. Weitere 1300 Proteinkandidaten befinden sich in der Entwicklung, von denen sich etwa 50 % in präklinischen Studien und weitere 33 % in klinischen Versuchen befinden (Abb. 2). In diesem Zusammenhang ist ein Anstieg der Zahl der Zulassungen in den nächsten Jahren vorhersehbar. Das von Eli Lilly & Co in den 70er Jahren entwickelte Humulin, ein rekombinantes Humaninsulin, das in dem Bakterium E. coli hergestellt wird, war 1982 das erste (von der FDA) zugelassene Biopharmazeutikum. Andere natürliche Proteine wie Hormone, Zytokine und Antikörper (Orthoclone OKT3) gehörten zu den neun Produkten, die in den 80er Jahren zugelassen wurden (Tabelle 1). Heute sind die Therapiegebiete, die am meisten von rekombinanten Biopharmazeutika profitiert haben, Stoffwechselstörungen (z. B. Diabetes Typ 1, Typ 2, Fettleibigkeit oder Hypoglykämie), hämatologische Erkrankungen (z. B. renale Anämie, Hämophilie A, Blutungs- oder Gerinnungsstörungen) und Onkologie (z. B. Melanom, Brust- oder Darmkrebs) mit 24, 18 bzw. 15 % der Zulassungen (Abb. 3). In dieser Hinsicht ist die Onkologie ein deutlich expandierender Markt. Im Zeitraum 2010-2014 waren 9 von 54 zugelassenen Biopharmazeutika antitumorale Medikamente, wobei Krebs die häufigste Indikation in diesem Zeitraum darstellte. Betrachtet man die molekularen Grundlagen von Biopharmazeutika, so zeigt sich ein klarer Trend zu Produkten auf Antikörperbasis. Im gleichen Zeitraum (2010-2014) waren 17 der 54 zugelassenen Proteinarzneimittel monoklonale Antikörper (31,5 %), verglichen mit 11 % im Zeitraum 1980-1989. Darüber hinaus sind unter den zehn meistverkauften Protein-Biopharmazeutika weltweit im Jahr 2014 (Tabelle 2) sechs Antikörper oder von Antikörpern abgeleitete Proteine (Humira, Remicade, Rituxan, Enbrel, Avastin, Herceptin; http://qz.com/349929/best-selling-drugs-in-the-world/).

Vormals, waren Biopharmazeutika rekombinante Versionen natürlicher Proteine mit der gleichen Aminosäuresequenz wie die jeweiligen nativen Versionen (mit nur geringfügigen Änderungen, die oft auf die Klonierungsstrategie zurückzuführen sind). Seit den 1990er Jahren basiert ein bedeutender Anteil der Zulassungen auf stark veränderten Formen rekombinanter Proteine. Diese neuartige Alternative, die auf der Fusion von Proteinen oder Domänen und auf verkürzten Versionen beruht, bietet ein breites Spektrum an Kombinationsmöglichkeiten, um neuartige Biopharmazeutika mit unterschiedlichen gemeinsamen Aktivitäten zu erhalten, die in der Natur nicht zusammen vorkommen.

Protein-Arzneimittel zur Krebsbehandlung

Die Onkologie ist eine der therapeutischen Indikationen, die den biopharmazeutischen Markt dominieren, da Krebs weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität ist. Chirurgie und Strahlentherapie sind wirksam bei der Heilung von Krebs in frühen Krankheitsstadien; sie können jedoch metastatische Erkrankungen nicht ausrotten. Das Vorhandensein von Mikrometastasen oder klinisch offensichtlichen Metastasen bei der Diagnose erfordert ihren Einsatz in Kombination mit einer genotoxischen Chemotherapie, um die Heilungsraten zu erhöhen. Der Erfolg der Chemotherapie wurde jedoch durch ihre mangelnde Selektivität und Spezifität beeinträchtigt, so dass die Toxizität für das normale Gewebe die Dosis begrenzt, die den Patienten verabreicht werden kann. Die Entwicklung von Biopharmazeutika, die in der Lage sind, spezifische molekulare Ziele, die Krebs auslösen, zu hemmen (z. B. monoklonale Antikörper gegen Her2 – Trastuzumab – oder gegen VEGF – Bevacizumab -), geht in diese Richtung.

Unter den vermarkteten Protein-Biopharmazeutika werden fast 24 % (94 Produkte) in antitumoralen Therapien eingesetzt. Die meisten dieser Produkte werden zu unterstützenden Zwecken eingesetzt, um die Nebenwirkungen der Chemotherapie, in der Regel Neutropenie oder Anämie, zu minimieren (einige repräsentative Beispiele sind in Tabelle 3 aufgeführt). Neunzehn dieser 94 Produkte sind echte antitumorale Medikamente, von denen 69 % in E. coli hergestellt werden (Abb. 4) und auf manipulierten Aminosäuresequenzen, Proteinfusionen und einzelnen Proteindomänen basieren (Tabelle 4).

Klar, sind modifizierte Proteinversionen in Krebstherapien häufiger als natürliche Polypeptide anzutreffen. Einschlägige Beispiele sind Aflibercept von Ziv, ein rekombinantes Fusionsprotein, das in CHO-Zellen hergestellt und gegen Darmkrebs eingesetzt wird. Es besteht aus Teilen der beiden Vascular Endothelial Growth Factor Receptors (VEGFR1 und VEGFR2), die mit der konstanten Fraktion (Fc) eines menschlichen IgG1-Immunglobulins fusioniert sind (Abb. 5). Dieses Konstrukt wirkt als Lockvogel, indem es an VEGF-A, VEGF-B und den Plazenta-Wachstumsfaktor (PlGF) bindet, die den VEGFR aktivieren. Diese Falle verhindert die Interaktion zwischen den Wachstumsfaktoren und den Rezeptoren und hemmt so den VEGF-Signalweg, der am angiogenetischen Prozess beteiligt ist. Denileukin diftitox ist ein rekombinantes Protein, das sich aus zwei Diphtherietoxinfragmenten (A und B) und einem menschlichen Interleukin-2 zusammensetzt (Abb. 5). Diphterietoxin ist ein starkes Exotoxin, das von Corynebacterium diphteriae ausgeschieden wird. Aufgrund seiner besonderen Struktur ist der gesamte Komplex, der in E. coli produziert wird, in der Lage, einen zytotoxischen Wirkstoff direkt an ein spezifisches Ziel abzugeben. Es gibt zwei aktive Hauptblöcke, deren Funktion darin besteht, zum einen das Biopharmazeutikum (IL-2) selektiv freizusetzen und zum anderen Zytotoxizität (Toxin A und B) zu verursachen. Das Fusionsprotein bindet sich an den IL-2-Rezeptor, der in Krebszellen (kutanes T-Zell-Lymphom) exprimiert wird. Sobald der Toxinanteil internalisiert ist, fördert die katalytische Domäne den Zelltod durch Hemmung der Proteinsynthese.

Da die gezielte Verabreichung von Arzneimitteln gegen Krebs ein neuer und expandierender Forschungsbereich ist, sind auch andere nicht rekombinante, proteinbasierte Biopharmazeutika stark vertreten. Dazu gehören vor allem Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) wie Brentuximab vedotin, Trastuzumab emtansine oder Nanopartikel-Wirkstoff-Konjugate wie nab-Paclitaxel . In diesen Fällen fungiert das Proteingegenstück als gezieltes Vehikel für herkömmliche chemische Arzneimittel. Auch bei diesem Ansatz geht es um die selektive Abgabe von Medikamenten an bestimmte Zielzellen, um die antitumorale Aktivität zu erhöhen und gleichzeitig die Toxizität für normale Zellen und die damit verbundenen Nebenwirkungen zu verringern.

Die Produkte gegen Krebs, die 2013 die höchsten Umsätze erzielten, sind in Abb. 6 dargestellt. Sechzig Prozent dieser Produkte sind rekombinante Proteine, was darauf hindeutet, dass die rekombinante Proteinproduktion immer noch eine aufstrebende und vielversprechende Plattform ist, die Raum für wichtige Fortschritte im biopharmazeutischen Sektor bietet.