Die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) ist eine Infektionskrankheit, die eine weltweite Pandemie mit mehr als 36 Millionen Infizierten aus rund 200 Ländern oder Gebieten ausgelöst hat, mit bisher mehr als 1 Million Todesfällen (Weltgesundheitsorganisation (WHO), 2020). Es wird angenommen, dass der Erreger von COVID-19, das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), von Fledermäusen stammt, da das von Fledermäusen übertragene Coronavirus RaTG13 der bisher nächste genetische Verwandte ist (Andersen et al., 2020; Zhou et al., 2020). Mehrere Arten wurden untersucht, um ihre mögliche Rolle als Zwischenwirte zu bestimmen (Shi et al., 2020). Darüber hinaus werden Tiermodelle zur Rekapitulation einer COVID-19-ähnlichen Krankheit als wichtige Forschungsrichtung angesehen und für die Entwicklung von therapeutischen und prophylaktischen Wirkstoffen benötigt.
Neben mehreren Modellierungsstudien, in denen potenziell für SARS-CoV-2 empfängliche Tierarten vorgeschlagen wurden (Damas et al., 2020; Qiu et al., 2020; Veljkovic et al., 2020), haben mehrere experimentelle Infektionen bereits ein breites Spektrum an empfänglichen Tieren gezeigt. Insbesondere ägyptische Flughunde, Frettchen, Syrische Goldhamster, Katzen, Mäuse, die humanisiertes Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) exprimieren, BALB/c-Mäuse (unter Verwendung eines mutierten SARS-CoV-2 durch mehrere Zellkulturpassagen) und einige nicht-menschliche Primatenarten sind für eine Virusinfektion empfänglich und entwickeln subklinische bis leichte bis mittelschwere Atemwegserkrankungen (Bao et al., 2020; Halfmann et al., 2020; Kim et al., 2020; Rockx et al., 2020; Shi et al., 2020; Yu et al., 2020). Aus experimenteller Sicht ist die Empfänglichkeit von Hunden für SARS-CoV-2 begrenzt, da geimpfte Tiere teilweise serokonvertieren können (Shi et al., 2020). Im Gegensatz dazu führte die intranasale Inokulation von Huhn, Ente und Schwein zu keinem Nachweis einer Infektion (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020).
Schweine werden in der Forschung häufig verwendet, da sie dem Menschen in Bezug auf Anatomie, Genetik, Physiologie und auch Immunologie sehr ähnlich sind. In der Tat sind Versuche an Schweinen wahrscheinlich aussagekräftiger für therapeutische und präventive Behandlungen beim Menschen als Versuche an Nagern (Meurens et al., 2012). Da Schweine jedoch nicht für eine SARS-CoV-2-Infektion empfänglich sind, wenn sie intranasal geimpft werden (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), sollte die Möglichkeit untersucht werden, ein Modell für die Infektion von Schweinen mit diesem Virus über andere potenzielle Inokulationswege zu entwickeln. Der Hauptgrund, Schweine zu testen, ist, dass der ACE2-Rezeptor dieser Spezies entweder durch Transfektion von Schweine-ACE2 in HeLa-Zellen (die das menschliche ACE2 nicht konstitutiv exprimieren) funktionsfähig ist (Zhou et al., 2020) oder dass Pseudopartikel mit dem S-Protein von SARS-CoV-2 in der Lage sind, Nierenzellen von Schweinen zu infizieren (Letko et al., 2020). Außerdem wird das ACE2-Protein in allen wichtigen Geweben von Schweinen exprimiert, wie durch Immunhistochemie festgestellt wurde (Xiao et al., 2020). Um ein mögliches COVID-19-Schweinemodell zu erstellen, haben wir daher die Auswirkungen verschiedener natürlicher und nicht natürlicher Wege der SARS-CoV-2-Inokulation bei Hausschweinen (Sus scrofa domesticus) untersucht.
Zu diesem Zweck wurden vier Gruppen von fünf 5- bis 6-wöchigen konventionellen Ferkeln (Landrasse × Large White) ausgewählt und über verschiedene Wege geimpft: intranasal (IN, 1,5 ml/Nase; Gesamtvolumen von 3 ml), intratracheal (IT, 3 ml), wie zuvor beschrieben (Garcia-Morante et al, 2016), intramuskulär (IM, 1 ml in jede Seite der Nackenmuskulatur; Gesamtvolumen 2 ml) oder intravenös (IV, 2 ml), mit einer Enddosis von 105,8 Gewebekultur-Infektionsdosen (TCID50) des SARS-CoV-2-Isolats (GISAID ID EPI_ISL_510689) pro Tier. Die IT- und IV-Gruppen wurden vor der Inokulation mit 10 mg/kg Ketamin und 0,8 mg/kg Xylazin narkotisiert. Ein Passage-2-SARS-CoV-2 wurde in Vero E6-Zellen (ATCC CRL-1586) vermehrt und titriert, wobei das gleiche Protokoll wie bei anderen Coronaviren angewandt wurde (Rodon et al., 2019). Zwei weitere Schweine wurden als Negativkontrollen verwendet.
Alle Tiere waren seropositiv gegen das porzine respiratorische Coronavirus, wie mit einem kommerziellen ELISA (INgezim Corona Diferencial 2.0 ) bestimmt. Da keine Antikörper-Kreuzreaktivität zwischen Alpha- und Beta-Coronaviren beschrieben wurde (Okba et al., 2020), wurden die Tiere in der Studie gehalten. Eine anfängliche Reaktivität gegen PRCV wurde erwartet, da dieses Virus in den europäischen Schweinebeständen ubiquitär ist (Saif et al., 2012; Vidal et al., 2019).
Die Tierversuche wurden vom institutionellen Tierschutzausschuss des Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (CEEA-IRTA) und von der Ethikkommission für Tierversuche der Autonomen Regierung von Katalonien genehmigt und von zertifiziertem Personal durchgeführt. Experimente mit SARS-CoV-2 wurden in den Einrichtungen der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) der Biocontainment-Einheit des IRTA-CReSA (Barcelona, Spanien) durchgeführt.
Am 2. und 22. Tag nach der Inokulation (dpi) wurden jeweils zwei bzw. drei Tiere/Gruppe (IT, IM und IV) euthanasiert. Da sich die IN-Inokulation bereits als nicht wirksam für die Auslösung einer SARS-CoV-2-Infektion erwiesen hat (Shi et al., 2020), wurden Schweine, die auf diesem Weg geimpft wurden, an den Tagen 1 und 2 pi euthanasiert, um Anzeichen für eine mögliche vorübergehende frühe Infektion in den Geweben zu ermitteln. Negative Kontrolltiere wurden vor Beginn des Versuchs euthanasiert. Die Proben wurden wie zuvor beschrieben gesammelt und verarbeitet (Vergara-Alert et al., 2017). Kurz gesagt, wurden bei allen Tieren vollständige Nekropsien durchgeführt. Verschiedene Gewebe (frontale, mediale und kaudale Nasenmuscheln, proximale, mediale und distale Luftröhre, großer und kleiner Bronchus, linker kranialer, mediodorsaler und kaudaler Lungenbereich, Niere, Leber, Herz und Milz) wurden entnommen, durch Eintauchen in 10 % neutral gepuffertes Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und in 3 µm große Schnitte geschnitten, um Objektträger herzustellen. Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt, um mögliche mikroskopische Läsionen zu beurteilen. Außerdem wurden dieselben Gewebe sowie Ileum, zervikale Lymphknoten (LN), mediastinale LN, mesenteriale LN, Riechkolben, Mandeln, Thymus, Ohrspeicheldrüse, Nebenniere, Bauchspeicheldrüse, Hirnstamm, Augenlider und Knochenmark in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) in Röhrchen mit Beads entnommen, um den Nachweis des SARS-CoV-2 upE-Gens mittels RT-qPCR durchzuführen (Corman et al., 2020). Außerdem wurden Nasen- und Rektalabstriche entnommen (täglich in der ersten Woche sowie am 14. und 22. Tag), um sie mittels der oben erwähnten RT-qPCR auf das Vorhandensein von viraler RNA zu untersuchen. Serumproben, die an den Tagen 0, 14 und 22 pi entnommen wurden, wurden auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen SARS-CoV-2 Spike S1 + S2 und Nukleokapsid (N)-Proteine mit hausinternen ELISAs (Institut de Recerca de la sida (Irsicaixa), 2020) untersucht. Außerdem wurde ein Virusneutralisierungstest nach einem früheren Protokoll mit einer geringfügigen Änderung durchgeführt (Rodon et al., 2020), wobei die seriellen Verdünnungen von Seren und SARS-CoV-2 vor der Durchführung des Plattentests 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert wurden.
Alle Tiere wurden täglich überwacht, aber keines der Tiere zeigte nach der SARS-CoV-2-Inokulation klinische Anzeichen. Auch wurden bei keinem der untersuchten Tiere aus allen Inokulationsgruppen sowie bei den Kontrolltieren grobe oder mikroskopische Läsionen festgestellt, die auf eine SARS-CoV-2-Infektion zurückzuführen waren (Daten nicht gezeigt).
Keines der Schweine wies nasale oder rektale Ausscheidungen viraler RNA auf. Die proximale Luftröhre eines IN-geimpften Tieres war bei 1 dpi positiv für virale RNA (Cq = 24,36). Die übrigen Gewebe dieses Tieres und der übrigen Schweine waren bei der RT-qPCR negativ (qPCR-Nachweisgrenze von 38,6 Zyklen).
Bei 14 und 22 dpi konnten bei allen Tieren der IM- und IV-Gruppen geringe Mengen an Antikörpern gegen das Spike-Protein nachgewiesen werden (Abbildung 1a). Darüber hinaus zeigten diese Schweine auch neutralisierende Antikörpertiter bei 22 dpi (zwischen 74 und 317 SNT50 reziproker Verdünnungstiter) (Abbildung 1b). Außerdem wurden bei einem von drei IM- und allen IV-geimpften Tieren am Ende des Versuchs geringe Antikörperspiegel gegen das N-Protein festgestellt (Daten nicht gezeigt). Wichtig ist, dass ein einziges Tier aus der IT-Gruppe keine Antikörper gegen das S-, aber Antikörper gegen das N-Protein sowie neutralisierende Titer (SNT50-Reziprokverdünnungstiter von 29) am Tag 0 pi aufwies, was auf eine mögliche Kreuzreaktion mit einem anderen Coronavirus, das Schweine infiziert, hindeuten könnte. Bemerkenswert ist, dass diese Antikörper gegen das N-Protein bis zum Ende des Versuchs abnahmen, was darauf schließen lässt, dass sie mütterlichen Ursprungs waren. Außerdem wies dieses Tier bei 22 dpi keine seroneutralisierenden Antikörper auf (Abbildung 1b).
Die vorliegenden Daten zeigen, dass SARS-CoV-2 auf keinem der getesteten Wege, nämlich IN, IT, IM und IV, Schweine infizieren konnte. Daher bestätigen unsere Bemühungen frühere Experimente, die auf eine fehlende Anfälligkeit für eine Infektion durch das Schwein hinweisen (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), obwohl sie zur Bewertung der Immunogenität der kommenden Impfstoffkandidaten verwendet werden können.
Wichtig ist, dass die aktuelle Studie über andere Studien mit SARS-CoV-2 und Schweinen hinausgeht, da wir eine breitere Anzahl von Inokulationswegen getestet haben. Allerdings führte keine von ihnen zu einer produktiven Infektion bei Ferkeln. Ein wichtiges Ergebnis dieser Studie war der Nachweis einer Serokonversion gegen das Spike-Glykoprotein am 14. und 22. Lebenstag sowie das Vorhandensein neutralisierender Antikörper am 22. In Anbetracht der kurzen Versuchsdauer (22 Tage) unterstreicht eine solche Serokonversion das potenzielle Interesse des Schweins an der Verwendung in Immunogenitätsstudien für SARS-CoV-2. In der Tat ist das Interesse des Schweins als geeignetes Tiermodell für die Immunologie sowie die Physiologie, Pharmakologie und Chirurgie, die in der Humanmedizin Anwendung finden, weithin anerkannt (Rothkötter, 2009).
Abschließend bestätigt die vorliegende Studie, dass Ferkel kein geeignetes Tiermodell für COVID-19 sind, aber ihre potenzielle Nützlichkeit als Modell für die Immunogenität in präklinischen Studien zur Impfstoffentwicklung verdient weitere Untersuchungen.