- Abstract
- 1. Einleitung
- 2. Experimentelles
- 2.1. Chemikalien und Reagenzien
- 2.2. HPTLC-Instrumentierung
- 2.3. Vorbereitung der Standardlösung
- 2.4. Linearitätsstudie
- 2.5. Vorbereitung der Probenlösung
- 2.6. Methodenvalidierung
- 2.6.1. Präzision
- 2.6.2. Nachweisgrenze (LOD) und Bestimmungsgrenze (LOQ)
- 2.6.3. Spezifität
- 2.6.4. Robustheit
- 2.6.5. Genauigkeit
- 2.6.6. Robustheit
- 2.7. Forcierter Abbau von Thiocolchicosid
- 2.7.1. Säure- und Basenhydrolyse
- 2.7.2. Oxidativer Abbau
- 2.7.3. Trockener Hitzeabbau
- 2.7.4. Photoabbau
- 3. Ergebnisse und Diskussion
- 3.1. Entwicklung der optimalen mobilen Phase
- 3.2. Kalibrierungskurve
- 3.3. Validierung der Methode
- 3.4. Analyse der vermarkteten Formulierung
- 3.5. Stabilitätsindikative Eigenschaft
- 3.5.1. Saurer Abbau
- 3.5.2. Basischer Abbau
- 3.5.3. Oxidativer Abbau
- 4. Schlussfolgerung
- Interessenkonflikt
- Dankbarkeit
Abstract
Eine neue stabilitätsindizierende Umkehrphasen-Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (RP-HPTLC) zur densitometrischen Analyse von Thiocolchicosid wurde entwickelt und validiert. Die Chromatogramme wurden mit Aluminiumplatten erstellt, die mit Kieselgel 60 RP-18 F254S als stationäre Phase und Methanol : Wasser (70 : 30) als mobile Phase beschichtet waren. Die kompakte Bande für Thiocolchicosid wurde bei einer Absorptionswellenlänge von 377 nm beobachtet. Die linearen Regressionsdaten für die Kalibrierungsdiagramme () wurden in Bezug auf die Peakfläche im Konzentrationsbereich von 100-600 ng pro Bande ermittelt. Die Nachweisgrenze (LOD) und die Bestimmungsgrenze (LOQ) betrugen 9,77 ng bzw. 29,63 ng. Das Arzneimittel wurde saurer und alkalischer Hydrolyse, Oxidation, Photoabbau und trockener Hitze ausgesetzt. Die Peaks der Abbauprodukte waren gut vom Peak des Standardarzneimittels getrennt und wiesen signifikante Unterschiede auf. Die statistische Analyse bewies, dass die etablierte RP-HPTLC-Methode reproduzierbar, selektiv und genau für die Bestimmung von Thiocolchicosid in seinen Formulierungen ist. Die Methode kann das Medikament effektiv von seinen Abbauprodukten trennen und kann als stabilitätsindizierender Test angesehen werden.
1. Einleitung
Thiocolchicosid ist chemisch gesehen 2-Demethoxy-2-glucosidoxythicolchicin (Abbildung 1) . Thiocolchicosid ist ein halbsynthetisches Schwefelderivat von Colchicosid, einem natürlich vorkommenden Glucosid, das in der Pflanze Gloriosa superba enthalten ist. Klinisch wird Thiocolchicosid wegen seiner muskelentspannenden, entzündungshemmenden und schmerzlindernden Eigenschaften eingesetzt. Nur wenige LC-MS-MS-Methoden wurden für die Bewertung der Bioäquivalenz von Thiocolchicosid als Einzelkomponente und in einer fest dosierten Kombinationstablette mit Lornoxicam etabliert.
Chemische Struktur von Thiocolchicosid.
Einige analytische Methoden, wie LC-ESI-MS RP-HPLC und UV-Spektrophotometrie, wurden für die Bestimmung von Thiocolchicosid allein in Bulkware und pharmazeutischen Formulierungen etabliert.
Thiocolchicosid ist in Kombination mit vielen anderen Arzneimitteln erhältlich; daher wurden mehrere Methoden wie UV-Spektrophotometrie , RP-HPLC und HPTLC-Methoden für die Bestimmung von Thiocolchicosid in kombinierten Darreichungsformen untersucht.
Die Richtlinien der Internationalen Harmonisierungskonferenz (ICH) mit dem Titel „Stability Testing of New Drug Substances and Products“ (Stabilitätsprüfung von neuen Arzneimitteln und Produkten) verlangen, dass Belastungstests durchgeführt werden können, um die inhärenten Stabilitätseigenschaften des Wirkstoffs zu ermitteln. Eine ideale stabilitätsanzeigende Methode ist diejenige, die sowohl den Standardwirkstoff als auch seine Abbauprodukte auflöst. Daher muss eine zuverlässige und schnelle Bestimmungsmethode entwickelt werden, mit der auch eine optimale Trennung der Abbauprodukte von der Ausgangssubstanz erreicht werden kann. Unseres Wissens wurde jedoch in der Literatur noch kein Artikel über die stabilitätsindizierende RP-HPTLC-Bestimmung von Thiocolchicosid veröffentlicht. Ziel der hier beschriebenen Arbeit ist es, Bedingungen für die Identifizierung und quantitative Analyse von Thiocolchicosid in Gegenwart seiner Abbauprodukte festzulegen, um die Reinheit des Bulk-Arzneimittels und die Stabilität seiner Darreichungsformen zu bewerten. Die Eignung der stabilitätsanzeigenden RP-HPTLC-Methode zur quantitativen Bestimmung von Thiocolchicosid wurde durch Validierung gemäß den Anforderungen der ICH-Richtlinien nachgewiesen.
2. Experimentelles
2.1. Chemikalien und Reagenzien
Thiocolchicosid wurde als Geschenkprobe von Ajanta Pharma. Ltd, Mumbai, Indien. Methanol, HCl, NaOH und H2O2 in HPLC-Qualität wurden von Merck Chemicals, Indien, erworben.
2.2. HPTLC-Instrumentierung
Der Arzneimittelstandard und die Proben wurden in Form von 6 mm breiten Banden mit einer CAMAG Linomat Mikroliterspritze (100 μL, Hamilton, Bunaduz, Schweiz) unter Verwendung eines CAMAG Linomat 5-Proben-Applikators (CAMAG Muttenz, Schweiz) mit einer konstanten Applikationsrate von 150 nL pro Sekunde getupft. Die Platten wurden mit Methanol vorgewaschen und vor der Chromatographie 10 Minuten lang bei 100°C aktiviert. Die Chromatographie wurde auf Aluminiumplatten durchgeführt, die mit Kieselgel 60 RP-18 F254S (20 × 10 cm, E. Merck, Deutschland) vorbeschichtet waren. Die lineare aufsteigende Entwicklung mit Methanol: Wasser (70 : 30 v/v) als mobile Phase wurde in einer 20 × 10 cm großen Glas-Doppeltrogkammer (CAMAG Muttenz, Schweiz) durchgeführt. Die optimierte Kammersättigungszeit für die mobile Phase betrug 30 min bei Raumtemperatur (28 ± 2°C). Die Länge des Chromatogrammlaufs betrug etwa 80 mm. Die Entwicklungszeit der Platte betrug 25 min. Nach der Entwicklung wurden die Platten im Luftstrom mit einem Lufttrockner getrocknet. Die Detektion der Spots erfolgte dann bei 377 nm mit einem CAMAG TLC Scanner 3 im Absorptionsmodus, der mit der winCATS Software Version 1.3.0 betrieben wurde. Als Strahlungsquelle diente eine Deuteriumlampe. Die Spaltabmessungen betrugen 6 mm × 0,45 mm, die Scangeschwindigkeit 20 mm pro Sekunde.
2.3. Vorbereitung der Standardlösung
Standardlösung von 1 mg/mL Thiocolchicosid in Methanol.
2.4. Linearitätsstudie
Die Standardlösung im Bereich von 0,2 bis 1,2 mL wurde in sechs separate 10 mL Messkolben überführt und mit Methanol aufgefüllt. Von jeder der oben genannten Lösungen wurden 5 μl auf RP-HPTLC-Platten aufgetragen, um Konzentrationen im Bereich von 100 bis 600 ng pro Bande zu erhalten. Das Kalibrierungsdiagramm für die Methode wurde als Peakfläche gegen Arzneimittelkonzentration erstellt.
2.5. Vorbereitung der Probenlösung
Um den Gehalt an Thiocolchicosid in der Kapsel zu bestimmen, wurden zwanzig Kapseln (MYORIL, Angabe auf dem Etikett: 8 mg Thiocolchicosid pro Kapsel) gewogen, der Inhalt der Kapseln wurde entfernt und das Durchschnittsgewicht bestimmt. Eine Menge, die 8 mg Thiocolchicosid entspricht, wurde in einen 100-mL-Messkolben mit 50 ml Methanol überführt und 10 Minuten lang beschallt; das Volumen wurde auf die Marke eingestellt und mit Whatmann-Filterpapier Nr. 41 filtriert. Ein Volumen von 5 mL wurde mit Methanol auf 10 mL verdünnt; die resultierende Lösung wurde mit 5 μL auf eine RP-HPTLC-Platte zur Bestimmung von Thiocolchicosid aufgetragen. Die Platten wurden wie oben beschrieben entwickelt und gescannt.
2.6. Methodenvalidierung
Die Methode wurde für die folgenden Parameter gemäß den ICH-Richtlinien validiert.
2.6.1. Präzision
Die Wiederholbarkeit des Probenauftrags und die Messung der Peakfläche wurden mit sechs Wiederholungen der Testkonzentration (400 ng Thiocolchicosid pro Bande) durchgeführt. Die Intra- und Inter-Tages-Variation für die Schätzung von Thiocolchicosid wurde mit drei Replikaten bei drei verschiedenen Konzentrationen (200, 300 und 500 ng pro Bande) durchgeführt.
2.6.2. Nachweisgrenze (LOD) und Bestimmungsgrenze (LOQ)
Zur Bestimmung der Nachweis- und Bestimmungsgrenze wurden Thiocolchicosid-Konzentrationen im unteren Teil des linearen Bereichs der Kalibrierkurve verwendet. Von der Standard-Stammlösung wurden 100, 120, 140, 160, 180 und 200 ng Thiocolchicosid pro Bande in dreifacher Ausführung auf die RP-HPTLC-Platte aufgetragen und LOD und LOQ anhand der folgenden Gleichungen berechnet: wobei „“ die Standardabweichung der Peakflächen der Drogen () ist, die als Maß für das Rauschen genommen wird, und „“ die Steigung der entsprechenden Kalibrierungskurve ist.
2.6.3. Spezifität
Die Spezifität der Methode wurde durch Analyse des Drogenstandards und der Probe überprüft. Die Bande für Thiocolchicosid in der Probe wurde bestätigt, indem die Werte und Spektren der Bande mit denen des Arzneimittelstandards verglichen wurden. Die Peak-Reinheit von Thiocolchicosid wurde durch den Vergleich der Spektren auf drei verschiedenen Ebenen bestätigt, d.h. Peak-Start (), Peak-Apex () und Peak-End () Positionen der Bande.
2.6.4. Robustheit
Die Robustheit der Methode wurde durch die Analyse von 400 ng Thiocolchicosid durch zwei verschiedene Analytiker unter gleichen Versuchs- und Umgebungsbedingungen durchgeführt.
2.6.5. Genauigkeit
Neun Banden der Thiocolchicosid-Probenlösung (200 ng pro Bande) wurden auf die Platte aufgetragen, und dann wurde die bekannte Menge Thiocolchicosid in dreifacher Ausführung zu 80, 100 und 120% (160, 200 und 240 ng pro Bande) der Probenkonzentration (200 ng pro Bande) aufgetragen und mit der vorgeschlagenen Methode erneut analysiert. Dies wurde durchgeführt, um die Wiederfindungsstudie des Arzneimittels bei verschiedenen Konzentrationen in den Formulierungen zu bewerten.
2.6.6. Robustheit
Durch kleine Änderungen der Zusammensetzung der mobilen Phase, der Menge der mobilen Phase, der Zeit von der Anwendung bis zur Entwicklung und der Zeit von der Entwicklung bis zum Scannen wurden die Auswirkungen auf die Ergebnisse untersucht. Es wurden mobile Phasen mit unterschiedlichen Zusammensetzungen von Methanol: Wasser (72 : 28 v/v) und Methanol: Wasser (68 : 32 v/v) ausprobiert und Chromatogramme erstellt. Die Platten wurden mit Methanol vorgewaschen und vor der Chromatographie bei 80 ± 5°C für 2, 5 und 8 Minuten aktiviert. Die Robustheit der Methode wurde anhand von sechs Wiederholungen desselben Spots (400 ng Thiocolchicosid pro Bande) überprüft.
2.7. Forcierter Abbau von Thiocolchicosid
2.7.1. Säure- und Basenhydrolyse
Eine genau abgewogene Menge von 10 mg Thiocolchicosid wurde getrennt in 10 mL methanolischer Lösung von 1,0 M HCl bzw. 0,5 M NaOH gelöst und 30 min lang bei 60°C im Dunkeln unter Rückfluss gehalten, um die wahrscheinliche abbauende Wirkung von Licht zu vermeiden. Ein Volumen von 1,0 ml der oben genannten Lösungen wurde separat entnommen, neutralisiert und mit Methanol auf 10 ml verdünnt. Die so erhaltenen Lösungen wurden in dreifacher Ausfertigung auf die RP-HPTLC-Platten aufgetragen (jeweils 5 μL, d. h. 500 ng pro Bande). Die Chromatogramme wurden wie oben beschrieben entwickelt und gescannt.
2.7.2. Oxidativer Abbau
Für den oxidativen Abbau wurden genau abgewogene 10 mg Thioclochicosid separat in 10 mL methanolischer Lösung von 1% v/v H2O2 bzw. 3% v/v H2O2 gelöst und für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln gehalten. Nach 30 Minuten wurden 1,0 ml von jeder der oben genannten Lösungen entnommen und mit Methanol auf 10 ml verdünnt. Die resultierenden Lösungen wurden in dreifacher Ausfertigung auf RP-HPTLC-Platten aufgetragen (jeweils 5 μL, d. h. 500 ng pro Bande). Die Chromatogramme wurden wie oben beschrieben entwickelt und gescannt.
2.7.3. Trockener Hitzeabbau
Eine genau abgewogene Menge von 10 mg Thiocolchicosid wurde bei 70°C für 8 h in einem Ofen gelagert. Sie wurde in einen 10 mL Messkolben mit Methanol überführt und bis zur Marke aufgefüllt. 1,0 mL der obigen Lösung wurden entnommen und mit Methanol auf 10 mL verdünnt. Die resultierende Lösung wurde in dreifacher Ausfertigung (je 5 μl, d. h. 500 ng pro Bande) auf die RP-HPTLC-Platte aufgetragen. Das Chromatogramm wurde wie oben beschrieben entwickelt und gescannt.
2.7.4. Photoabbau
Eine genau abgewogene Menge von 10 mg Thiocolchicosid wurde in 10 mL Methanol gelöst und die Lösungen für 24 h im Licht gehalten. Ein angemessenes Volumen von 1,0 mL der obigen Lösung wurde entnommen und mit Methanol auf 10 mL verdünnt. Die resultierende Lösung wurde in dreifacher Ausführung (je 5 μl, d. h. 500 ng pro Bande) auf die RP-HPTLC-Platte aufgetragen. Das Chromatogramm wurde wie oben beschrieben entwickelt und gescannt.
3. Ergebnisse und Diskussion
3.1. Entwicklung der optimalen mobilen Phase
Für die Auswahl der geeigneten mobilen Phase für die Trennung von Thiocolchicosid wurden mehrere Läufe mit mobilen Phasen durchgeführt, die Lösungsmittel unterschiedlicher Polarität bei verschiedenen Konzentrationen enthielten. Von den verschiedenen verwendeten Kombinationen mobiler Phasen ergab die aus Methanol: Wasser (70 : 30 v/v) bestehende mobile Phase einen scharfen und gut definierten Peak bei einem Wert von 0,60 ± 0,02 (Abbildung 2). Die gut abgegrenzten Banden wurden gefunden, als die Kammer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit der mobilen Phase gesättigt war.
Chromatogramm des Thiocolchicosid-Standards mit ( 0,60 ± 0,02) bei 377 nm in Methanol: Wasser (70 : 30 v/v) als mobile Phase.
3.2. Kalibrierungskurve
Die linearen Regressionsdaten für die Kalibrierungskurven () zeigten eine gute lineare Beziehung über den Konzentrationsbereich von 100-600 ng pro Bande. Die lineare Regressionsgleichung betrug , = 0,9984 (Abbildung 3).
Kalibrierungskurve von Thiocolchicosid (100-600 ng pro Bande).
3.3. Validierung der Methode
Die entwickelte Methode wurde gemäß den ICH-Richtlinien validiert.
Die Präzision der Methode wurde in Form der relativen Standardabweichung (% RSD) der Peakfläche ermittelt. Die Ergebnisse (Tabelle 1) zeigen die Präzision der Methode, die anhand der Steigung des untersten Teils der Kalibrierungskurve bestimmt wurde. Die LOD und LOQ lagen bei 9,77 ng bzw. 29,63 ng, was auf eine angemessene Empfindlichkeit der Methode hinweist.
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Die Wiederfindungsstudien wurden bei 80 %, 100 % und 120 % der Testkonzentration gemäß den ICH-Richtlinien durchgeführt. Die prozentuale Wiederfindung von Thiocolchicosid lag bei allen drei Stufen im Bereich von 99,92-100,04 %. Die zugegebenen und bestimmten Mengen des Arzneimittels sowie die prozentuale Wiederfindung sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Peak-Reinheit von Thiocolchicosid wurde durch Auswertung der Spektrenstudien an den Peak-Start-, Peak-Apex- und Peak-End-Positionen der Bande bestätigt, d. h. (, ) = 0,9995 und (, ) = 0,9986, was die Spezifität der Methode zeigt (Abbildung 4). Eine gute Korrelation ( = 0,9989) wurde zwischen dem Arzneimittelstandard und dem aus der Kapselformulierung extrahierten Arzneimittel erzielt. Die Robustheit der Methode wurde durch gezielte Änderung der chromatographischen Bedingungen getestet, und die Auswirkungen auf das Chromatogramm wurden beobachtet. Die Standardabweichung der Peakflächen wurde für jeden Parameter berechnet, und es wurde festgestellt, dass die prozentuale RSD weniger als 2 % beträgt. Die niedrigen Werte der prozentualen RSD weisen auf die Robustheit der Methode hin; die Ergebnisse sind in (Tabelle 3) dargestellt. Die Robustheit der Methode wurde von verschiedenen Analytikern überprüft, und die %RSD-Werte lagen bei 0,57 und 0,58, was darauf hinweist, dass die Methode robust ist.
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| : Anzahl der Bestimmungen. | |||||||||||||||||||||||||||||||
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| : Anzahl der Bestimmungen. | |||||||||||||||||||||||||||
Peak-Reinheitsspektren von Thiocolchicosid-Standard (a) und aus der Kapsel extrahiertem Thiocolchicosid (b), die an den Peak-Start-, Peak-Apex- und Peak-End-Positionen gescannt wurden.
3.4. Analyse der vermarkteten Formulierung
Thiocolchicosid zeigte bei der Extraktion aus der Kapselformulierung einen einzelnen Fleck mit = 0,60 ± 0,02 im Chromatogramm. Der mittlere prozentuale Wirkstoffgehalt lag bei 100,27% der Angabe auf dem Etikett mit 0,88% RSD.
3.5. Stabilitätsindikative Eigenschaft
3.5.1. Saurer Abbau
Der forcierte Abbau von Thiocolchicosid in 1,0 M HCl (60°C für 30 min) erwies sich als instabil und zeigte zwei zusätzliche Peaks bei den Werten 0,33 und 0,71 (Abbildung 5(a)). Die Spots der Abbauprodukte waren gut von dem Spot des Thiocolchicosids getrennt.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
RP-HPTLC-Chromatogramme von Thiocolchicosid, das durch (a) saure Hydrolyse (1 M HCl) abgebaut wurde, (b) alkalische Hydrolyse (0.5 M NaOH), (c) oxidativem Stress (1% v/v H2O2) und (d) oxidativem Stress (3% v/v H2O2).
3.5.2. Basischer Abbau
Thiocolchicosid erwies sich bei der alkalischen Hydrolyse in 0,5 M NaOH bei 60°C für 30 min als instabil. Die Droge zeigte einen zusätzlichen Peak mit einem Wert von 0,72, während Thiocolchicosid bei 0,60 blieb (Abbildung 5(b)). Die Spots der Abbauprodukte waren gut von den Arzneimittelspots getrennt.
3.5.3. Oxidativer Abbau
Thiocolchicosid besitzt ein Schwefelatom, das für die Oxidation durch H2O2 empfindlicher ist. Nach der Behandlung von Thiocolchicosid mit 1 % v/v H2O2 wurden drei zusätzliche Peaks bei den Werten 0,38, 0,46 und 0,70 beobachtet, während Thiocolchicosid bei 0,60 verblieb (Abbildung 5(c)). Beim oxidativen Abbau mit 3 % v/v H2O2 wurde Thiocolchicosid vollständig abgebaut, was zu zwei Hauptpeaks bei den Werten 0,58 und 0,64 bzw. einem Peak bei 0,70 führte (Abbildung 5(d)). Die Peak-Reinheitsspektren von Thiocolchicosid, das nach dem Abbau in 1 M HCl, 0,5 M NaOH und 1 % v/v H2O2 wiedergewonnen wurde, und von Thiocolchicosid-Standard, der an den Peak-Start-, Peak-Apex- und Peak-End-Positionen des Spots gescannt wurde, sind in (Abbildung 6) dargestellt. Die Ergebnisse der Belastungstests zeigten, dass die Methode für Thiocolchicosid hochspezifisch war. Die Abbauprodukte waren vollständig von der Ausgangsverbindung zu unterscheiden. Es wurde keine Zersetzung festgestellt, wenn die Medikamentenlösung während des Photo- und thermischen Abbaus dem Sonnenlicht ausgesetzt wurde, was auf die Stabilität des Medikaments unter beiden Bedingungen hindeutet. Die Ergebnisse der Studie zum forcierten Abbau von Thiocolchicosid sind in (Tabelle 4) zusammengefasst.
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Peak-Reinheitsspektren von Thiocolchicosid, das nach dem Abbau in 1 M HCl, 0.5 M NaOH, 1% v/v H2O2, Abbauprodukte und Thiocolchicosid-Standard, die an den Peak-Start-, Peak-Apex- und Peak-End-Positionen gescannt wurden.
4. Schlussfolgerung
In der vorliegenden Studie wurde ein forcierter Abbau von Thiocolchicosid durchgeführt, um seine inhärente chemische Stabilität zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde eine RP-HPTLC-Methode entwickelt. Die entwickelte Methode erwies sich als einfach, schnell, selektiv, empfindlich und geeignet für die Bestimmung von Thiocolchicosid in Bulkmaterial und Kapselformulierung. Während der Studie wurde festgestellt, dass Thiocolchicosid anfällig für Säure- und Basenhydrolyse sowie Oxidation ist. Da die Methode stabilitätsanzeigend ist, kann sie zur Bestimmung der Reinheit des aus verschiedenen Quellen erhältlichen Arzneimittels verwendet werden, indem die entsprechenden Verunreinigungen nachgewiesen werden. Außerdem kann festgestellt werden, dass die Verunreinigungen im Arzneimittel auf Hydrolyse oder Oxidation während der Verarbeitung und Lagerung des Arzneimittels zurückzuführen sein könnten.
Interessenkonflikt
Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.
Dankbarkeit
Die Autoren sind dem R. C. Patel Institute of Pharmaceutical Education and Research, Shirpur (M.S.), Indien, für die Bereitstellung der erforderlichen Einrichtungen zur Durchführung dieser Forschungsarbeit dankbar.