Zellüberleben nach Bestrahlung
Untersuchung von strahleninduziertem Zellwachstum und -tod, Die Untersuchung des strahleninduzierten Zellwachstums und -todes, definiert als die Zeitspanne, die für einen vollständigen Verlust der Proliferationsfähigkeit oder eine Erhöhung der Proliferationsfähigkeit erforderlich ist, ist eine der am häufigsten und zuverlässigsten verwendeten Methoden zur Untersuchung der Strahlenwirkung auf Zellen. Für die Bestrahlungsexperimente hat unser Labor überprüft, dass die 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Messwerte proportional zur Anzahl der Zellen in vitro waren, zumindest in der Phase des exponentiellen Wachstums (Daten nicht gezeigt). Die Bestrahlung mit 12C6+-Ionen bei hoher Energie führt in der Regel zum Absterben der überwiegenden Mehrheit der Zellen. Der Anteil des Zelltods in der verzögerten Phase nach der Bestrahlung und die Veränderungen der Verdopplungszeit können durch Tests zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Bestrahlung gemessen werden. Da es sich bei unserem Assay nicht nur um eine Ein-Punkt-Bestimmung des Überlebens handelte, konnten auch Informationen über die Wachstumsleistung leicht gewonnen werden. Die Überlebenskurve wurde auf einer natürlich logarithmischen Skala des Überlebensanteils in Abhängigkeit von verschiedenen physikalischen Parametern aufgezeichnet.
C. tyrobutyricum 25755 Zellen wurden 20 Stunden nach der Aussaat bestrahlt. Die Stämme mit der geringsten Stoffwechselaktivität und der langsamsten Proliferation oder Zellen, die aufhörten zu proliferieren, wurden durch Waschen und Trypsinierung aus dem Test ausgeschlossen, wenn die Ausplattung nach der Bestrahlung erfolgte. Der nach Gleichung (1) ermittelte Überlebensanteil wurde mit einem repräsentativen Satz von Versuchsdaten verglichen. Abbildung 1 zeigt einen Vergleich der Überlebenskurven nach 12C6+-Ionen-Bestrahlung bei verschiedenen Strahlenenergien für die verschiedenen Stämme von C. tyrobutyricum ATCC 25755. Die Ergebnisse des MTT-Tests sind gegen die Bestrahlungsdosis (10 bis 50 Gy) bei einer Energie von 68 AMeV und 106 bis 108 Ionen – Puls-1 aufgetragen, die für Abbildung 1A e0 → e-4,5, für Abbildung 1B e0 → e-5,8 und für Abbildung 1C e0 → 0 betragen. Abbildung 1D-F zeigt die zellulären Überlebensdaten aus den Ergebnissen des MTT-Tests in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdosis (10 bis 50 Gy) bei einer Energie von 114 AMeV und 106 bis 108 Ionen-Puls-1-Niveaus, die e0 → 0 waren. Im Allgemeinen wurde eine ausreichende Übereinstimmung zwischen den Berechnungen und den experimentellen Daten erzielt. Bei den Stämmen, die mit 68 AMeV behandelt wurden, unterschätzte die Gleichung die Wirksamkeit der Dosis, während bei den Zellen, die mit hohen Energien (114 AMeV) bestrahlt wurden, das Ergebnis überschätzt wurde. Die maximale Abweichung, die sich aus dem Verhältnis der berechneten zu den gemessenen Dosen für ein bestimmtes Wirkungsniveau ergibt, betrug 15 %. Der Überlebensanteil der Stämme hing stark von den besonderen physikalischen Eigenschaften des 12C6+-Ionenstrahls ab, die durch die Energie, die Dosis und die Ionen-Puls-1-Niveaus der betrachteten Teilchen bestimmt wurden (Abbildung 1). Es ist offensichtlich, dass der Überlebensanteil mit zunehmender Energie der Kohlenstoffionen abnimmt. Wie erwartet, zeigte die logarithmische Überlebensrate der Versuche die gleichen Merkmale: die Überlebensrate hing von der Energie, dem Ionenpuls-1 und der Dosis der 12C6+-Ionen-Bestrahlung ab. Die Erhöhung eines physikalischen Parameters nach dem anderen führte zu einem Rückgang der Überlebensrate. Eine sehr begrenzte Überlebensrate (e-3,5 → e-6,5) wurde erreicht, wenn das 12C6+-Ion mit einer Energie von 114 AMeV, einer Dosis von 20 bis 40 Gy und 106 bis 108 Ionen-Impulsen-1 bestrahlt wurde.
Die Wirkung der 12C6+-Ionen-Bestrahlung auf das Überleben von Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755. Die Zellen wurden 20 Stunden nach der Aussaat bestrahlt, und das Ausmaß des Überlebens wurde mit dem MTT-Assay bestimmt. Die Überlebensdaten sind gegen die Bestrahlungsstärke aufgetragen. (A-C) 12C6+-Ionen wurden auf bis zu 68 AMeV beschleunigt, und die Anzahl der Ionen/Puls lag zwischen 106 und 108 bei einer Dosis von 10 bis 50 Gy. (D-F) 12C6+-Ionen wurden auf bis zu 114 AMeV beschleunigt, und ihre Ionen/Pulse reichten von 106 bis 108, bei einer Dosisleistung von 10 bis 50 Gy. Zellen mit geringer Stoffwechselaktivität und langsamer Proliferation oder Zellen, die ihre Proliferation einstellen, wurden durch Waschen und Trypsinierung aus dem Test ausgeschlossen, wenn die Ausplattierung nach der Bestrahlung erfolgte.
Viele Zelltypen zeichnen sich durch regelmäßige Zellteilung alle 12 bis 24 Stunden aus. Aufgrund der Kraft des exponentiellen Wachstums kann eine einzelne Zelle innerhalb von etwa 9 bis 12 normalen Teilungszyklen, d. h. innerhalb weniger Tage, Tausende von Tochterzellen produzieren. Nach der Bestrahlung können sich die Überlebenden dann aus einigen Mutanten zusammensetzen. Ein sehr kleiner Prozentsatz der überlebenden C. tyrobutyricum ATCC 25755 kann eine verbesserte Fähigkeit zur Butyratproduktion aufweisen.
Die Auswirkungen von Buttersäure auf das Zellwachstum nach Bestrahlung
C. tyrobutyricum ATCC 25755 verwendet Glucose oder Xylose als Kohlenstoff- und Energiequelle. Das Monosaccharid wird über ein Phosphoenolpyruvat-abhängiges Phosphotransferase-Aufnahmesystem in die Zelle transportiert. Danach wird Glucose oder Xylose durch Glykolyse verstoffwechselt, die im Bereich von pH 7 bis pH 5,5 eine unbedeutende pH-Abhängigkeit aufweist. Die Fermentationen wurden jedoch gestoppt, wenn Glukose oder Xylose nicht mehr von den Zellen verbraucht wurde, da sie durch Butyrat gehemmt wurden. Um die spezifische Wirkung der Bestrahlung auf die Zellwachstumsprofile weiter zu untersuchen (basierend auf Messungen der optischen Dichte (OD) der Zellsuspension bei 600 nm), wurden einzelne Batch-Kulturen in chemisch definiertem P2-Medium (durchgeführt in Serumflaschen) durchgeführt, das 42 g-L-1 Glukose enthielt und mit 3,6, 7,2 und 10,8 g-L-1 Buttersäure ergänzt wurde. Der pH-Wert der Kultur von C. tyrobutyricum ATCC 25755 (Abbildung 2A, Kontrolle) sank auf etwa 4,8 (ΔpH von 1,4, ausgehend von pH 6,2), während er bei der Ergänzung mit 3,6 g-L-1 Buttersäure (Abbildung 2A1), 7.2 g-L-1 Buttersäure (Abbildung 2A2) und 10,8 g-L-1 Buttersäure (Abbildung 2A3) lagen die entsprechenden pH-Werte bei etwa 6,0 (ΔpH von 0,5 ausgehend von 6,5), 6,1 (ΔpH von 0,3 ausgehend von 6,4) bzw. 5,9 (ΔpH von 0,5 ausgehend von 6,4). Wurde die Kultur jedoch mit 68 AMeV bei einer Dosis von 40 Gy bestrahlt (Abbildung 2D, Kontrolle), fiel der pH-Wert auf etwa 4,8 (ΔpH von 1,7 ausgehend von 6,5), während bei einer Dosis von 40 Gy (ergänzt mit 3,6 g-L-1 Buttersäure) (Abbildung 2D1), einer Dosis von 40 Gy (ergänzt mit 7.2 g-L-1 Buttersäure) (Abbildung 2D2) und einer Dosis von 40 Gy (ergänzt mit 10,8 g-L-1 Buttersäure) (Abbildung 2D3), die pH-Werte etwa 4,6 (ΔpH von 1,6 ab 6,2), 4,8 (ΔpH von 1,4 ab 6,2) bzw. 5,9 (ΔpH von 0,3 ab 6,2) betrugen. Wenn die Kultur mit 114 AMeV und einer Dosis von 40 Gy bestrahlt wurde (Abbildung 2G, Kontrolle), fiel der pH-Wert auf etwa 5,7 (ΔpH von 0,6 ausgehend von 6,3), während bei einer Dosis von 40 Gy (ergänzt mit 3,6 g-L-1 Buttersäure) (Abbildung 2G1), einer Dosis von 40 Gy (ergänzt mit 7.2 g-L-1 Buttersäure) (Abbildung 2G2) und einer Dosis von 40 Gy (ergänzt mit 10,8 g-L-1 Buttersäure) (Abbildung 2G3) die pH-Werte etwa 5,7 (ΔpH von 0,6 ab 6,3), 5,4 (ΔpH von 0,9 ab 6,3) bzw. 5,6 (ΔpH von 0,7 ab 6,3) betrugen. Wenn die Kultur mit 68 AMeV und einer Dosis von 20 Gy (ergänzt mit 7,2 g-L-1 Buttersäure) bestrahlt wurde (Abbildung 2B2), fiel der pH-Wert auf etwa 4,4 (ΔpH von 0,9 ausgehend von 6,3), während bei einer Dosis von 30 Gy (ergänzt mit 7.2 g-L-1 Buttersäure) (Abbildung 2C2) und einer Dosis von 40 Gy (ergänzt mit 7,2 g-L-1 Buttersäure) (Abbildung 2D2) die pH-Werte bei etwa 4,6 (ΔpH von 1,7 ausgehend von 6,3) bzw. 4,8 (ΔpH von 1,5 ausgehend von 6,3) lagen. Wenn die Kultur mit 114 AMeV und einer Dosis von 40 Gy (ergänzt mit 10,8 g-L-1 Buttersäure) bestrahlt wurde (Abbildung 2E3), sank der pH-Wert auf 5,9 (ΔpH von 0,4 ausgehend von 6,3), während bei einer Dosis von 30 Gy (ergänzt mit 10,8 g-L-1 Buttersäure) (Abbildung 2F3) und einer Dosis von 40 Gy (ergänzt mit 10,8 g-L-1 Buttersäure) (Abbildung 2G3) die pH-Werte bei etwa 6.0 (ΔpH von 0,3 ausgehend von 6,3) bzw. 5,8 (ΔpH von 0,5 ausgehend von 6,3).
Zeitlicher Verlauf der Aktivitäten von Wildtyp- und bestrahlten Zellen als Funktion der zugesetzten Buttersäurekonzentrationen während der ersten 54 h der Fermentation. (A) Zellwachstum der Wildtyp-Stämme, unbeeinflusst von der Zugabe von Butyrat (Kontrollkulturen). (B-D) Zellwachstum der bestrahlten Stämme (Energie 68 AMeV und Dosen von 20, 30 und 40 Gy), unbeeinflusst von der Zugabe von Butyrat (Kontrollkulturen). (E,F) Zellwachstum der bestrahlten Stämme (Energie 114 AMeV und Dosen von 20, 30 und 40 Gy), unbeeinflusst von der Zugabe von Butyrat (Kontrollkulturen). ( A1-A3) Die Auswirkungen der Butyratzugabe auf das Wachstum der Wildtyp-Zellen. Einzelne Batch-Kulturen wurden in chemisch definiertem P2-Medium (durchgeführt in Serumflaschen) durchgeführt, das Glukose (ca. 42 g-L-1) enthielt und mit 3,6 (A1), 7,2 (A2) und 10,8 g-L-1 (A3) Buttersäure ergänzt wurde. (B1-B3, C1-C3, D1-D3) Die Auswirkung des zugesetzten Butyrats auf das Wachstum der bestrahlten Zellen (Energie 114 AMeV und Dosen von 20, 30 und 40 Gy). Einzelne Batch-Kulturen wurden in chemisch definiertem P2-Medium (durchgeführt in Serumflaschen) durchgeführt, das Glukose (ungefähr 42 g-L-1) enthielt und mit 3,6 (X1), 7,2 (X2) und 10,8 g-L-1 (X3) Buttersäure ergänzt wurde. (E1-E3, F1-F3, G1-G3) Die Auswirkungen des zugesetzten Butyrats auf das Wachstum der bestrahlten Zellen (Energie 114 AMeV und Dosen von 20, 30 und 40 Gy). Einzelne Batch-Kulturen wurden in chemisch definiertem P2-Medium (durchgeführt in Serumflaschen) durchgeführt, das Glukose (ca. 42 g-L-1) enthielt und mit 3,6 (X1), 7,2 (X2) und 10,8 g-L-1 (X3) Buttersäure ergänzt wurde.
Diese Unterschiede im pH-Wert regulieren den zeitlichen Wechsel, der mit der Bildung von Lösungsmitteln für jeden bestrahlten Stamm verbunden ist. Dies deutet darauf hin, dass die Wildtyp- und bestrahlten Stämme ein biphasisches Stoffwechselmuster aufweisen, das stark vom pH-Wert des Mediums beeinflusst wird. Als allgemeine Tendenz verbrauchten die Zellen zunächst Glukose, um das Wachstum zu unterstützen, und produzierten und scheiden organische Säuren (Butyrat und Acetat) als primäre Metaboliten aus (Acidogenese), die eine Abnahme des pH-Werts des Mediums verursachten, wenn sie sich bis zu einem gewissen Grad anreicherten. Durch diesen Anstieg des Säuregehalts der Brühe verlagerte sich die Bildung von Säuren auf die Produktion von Lösungsmitteln, wenn die Kultur die stationäre Phase des Zellwachstums erreichte (Solventogenese). Bei hohem pH-Wert werden hauptsächlich organische Säuren gebildet, während bei niedrigem pH-Wert die Lösungsmittelproduktion angeregt wird. Wie erwartet, waren die Art der Stoffwechselverschiebung und das kinetische Muster der Lösemittelbildung stammabhängig, da die bestrahlten Stämme ihre eigenen genetischen und metabolischen Merkmale aufwiesen. Von Buttersäure wurde bereits berichtet, dass sie das Zellwachstum hemmt. Die Ergebnisse zeigten, dass bei den Wildtyp-Stämmen eine allmähliche Hemmung des Zellwachstums auftrat, wobei bei Buttersäurekonzentrationen über 3,6 g-L-1 kein realistisches Wachstum mehr beobachtet wurde. Bei den bestrahlten Stämmen gab es jedoch keine allmähliche Hemmung des Zellwachstums, und bei Buttersäurekonzentrationen über 10,8 g-L-1 wurde kein realistisches Wachstum beobachtet.
Um die Wirkung des zugesetzten Butyrats genauer zu untersuchen, wurden die Zellwachstumsprofile (basierend auf OD-Messungen) für die Wildtyp-Stämme und die bestrahlten Stämme während der ersten 54 Stunden der Fermentation verglichen (Abbildung 2A1-G3). Interessanterweise war die Buttersäure-Toleranz der Stämme stark erhöht, wenn die Energie und Dosis der 12C6+-Ionen-Bestrahlung erhöht wurde. Die Stoffwechselwege des Glukosestoffwechsels in C. tyrobutyricum ATCC 25755 sind in Abbildung 3 dargestellt. Acetyl-CoA, Acetoacetyl-CoA und Butyryl-CoA sind drei wichtige Zwischenprodukte, die für die Fermentation im Hinblick auf das Potenzial zur Bildung verschiedener Produkte während der Acidogenese oder Solventogenese von besonderem Interesse sind. Diese Zwischenprodukte sind wichtige Verzweigungspunkte, die den Stoffwechselfluss entweder zur Säure- oder zur Lösungsmittelbildung leiten. Als letztes wichtiges Zwischenprodukt leitet Butyryl-CoA die Bildung von Buttersäure/Butyrat ein. Butyrat wird durch die aufeinander folgenden Aktivitäten von PTB und BK gebildet. Beide Enzyme sind während der Acidogenese am aktivsten und ihre spezifischen Aktivitäten nehmen während der Solventogenese ab, und zwar um das Zweifache für PTB und das Sechsfache für Buk . Normalerweise ist eine starke pH-abhängige Aktivität mit einem in vitro-Optimum bei acidogenen pH-Werten von 5,5 (optimal bei pH 4,7) und einem in vivo (endogenen) pH-Wert von mehr als 5,5 erforderlich, um die Solventogenese einzuleiten. Eine vergleichende Analyse dieser Diagramme ergab jedoch eindeutig eine Hauptgruppe, die aus den mit 68 AMeV und 40 Gy bestrahlten Stämmen und den mit 114 AMeV und Dosen von 30 und 40 Gy bestrahlten Stämmen bestand. Die beiden Gruppen zeigten im Vergleich zu den Wildtyp-Bakterien eine sehr ähnliche Toleranz gegenüber steigenden Butyratkonzentrationen.
Metabolische Wege des Glukosestoffwechsels in Clostridium tyrobutyricum . Die Enzyme sind wie folgt mit Buchstaben gekennzeichnet: Laktatdehydrogenase; Pyruvat-Ferderoxin-Oxidoreduktase; NADH-Ferderoxin-Oxidoreduktase; NADPH-Ferderoxin-Oxidoreduktase; Hydrogenase; Phosphat-Acetyltransferase (Phosphotransacetylase); Acetatkinase; Acetaldehyd-Dehydrogenase; Ethanol-Dehydrogenase; Thiolase (Acetyl-CoA-Acetyltransferase); Acetoacetyl-CoA; Acetat/Butyrat:CoA-Transferase; Acetoacetat-Decarboxylase; 3-Hydroxylbutyryl-CoA-Dehydrogenase; Crotonase; Butyryl-CoA-Dehydrogenase; Phosphat-Butyltransferase (Phosphobutyrylase); Butyrat-Kinase.
Auswirkung von 12C6+-Ionenbestrahlung auf die Buttersäureproduktion
Die Buttersäureproduktion der bestrahlten Stämme war sowohl in Bezug auf die Endproduktkonzentration als auch auf die Ausbeute im Vergleich zum Wildtyp-Stamm stark verbessert, wie in Abbildung 4B,E gezeigt. Die nicht bestrahlte C. tyrobutyricum-Kultur (Wildtyp-Stamm, Kontrolle), die in glukoseminimale Medien beimpft wurde, begann fast sofort mit der Zuckeraufnahme, wobei die Buttersäureproduktion 12 bis 18 Stunden später begann (Abbildung 4A,B). Die gleiche Kontrollkultur, die in ein Clostridien-Wachstumsmedium (CGM) mit 60 g-L-1 Glukose beimpft wurde, benötigte über 96 Stunden, um sich zu akklimatisieren, obwohl die Fermentationen der bestrahlten Stämme und der Wildtyp-Stämme unter den gleichen Bedingungen getestet wurden. Die verlängerte Periode minimalen Stoffwechsels und minimaler Produktivität ist darauf zurückzuführen, dass die Bestrahlung (unterschiedliche Parameter) eine Verzögerung der log-Phase des Zellwachstums verursachte (Abbildung 4C,F). Die Buttersäuretoleranz der bestrahlten Stämme war stark erhöht, so dass sie mehr Buttersäure produzieren konnten, was zu einer vollständigen Glukoseverwertung und einer Produktion von über 32 g-L-1 Buttersäure und ähnlichen Mengen an Zellbiomasse führte. Außerdem stieg das Buttersäure/Kontrollverhältnis von 1,0 beim Wildtyp-Stamm auf 1 an.52 für die mit 114 AMeV und 40 Gy bestrahlten Stämme, 1,37 für die mit 114 AMeV und 30 Gy bestrahlten Stämme, 1,41 für die mit 68 AMeV und 40 Gy bestrahlten Stämme und 1,31 für die mit 68 AMeV und 30 Gy bestrahlten Stämme. Dieser Trend deutet darauf hin, dass die Kohlenstoff- und Energieflüsse in den Stoffwechselwegen der bestrahlten Stämme umverteilt wurden, was auch zu signifikanten Veränderungen in der Produktion verschiedener Fermentationsprodukte führte. Es ist anzumerken, dass die Essigsäureproduktion (Daten nicht gezeigt) während der Fermentation viel früher abflachte als Butyrat/Buttersäure. Die Fermentationen wurden gestoppt, wenn die Glukose nicht mehr von den Zellen verbraucht wurde, da sich in der Brühe organische Säuren und Abfallprodukte ansammelten, die das Zellwachstum und andere Aktivitäten hemmten. Die bestrahlten Stämme waren jedoch toleranter gegenüber Buttersäure, wie die wesentlich höhere Endkonzentration an Butyrat zeigt, die bei den Fermentationen mit diesen bestrahlten Stämmen im Vergleich zum Wildtyp erreicht wurde. Dies ist nicht völlig überraschend; wie in Abbildung 3 gezeigt, kann die erhöhte Buttersäure-Toleranz der bestrahlten Stämme auch auf den reduzierten Fluss durch den Butyrat-PTA/AK-Weg zurückgeführt werden. Da die bestrahlten Stämme für die Energieproduktion und das Überleben nicht mehr auf den PTA/AK-Stoffwechselweg angewiesen waren, reagierten sie weniger empfindlich auf die Hemmung durch Buttersäure.
Vergleich der Säure- und Biomasse-Trockengewichtsproduktion von Wildtyp und bestrahltem C. tyrobutyricum, das auf Glukose (mit 60 g-L-1) in Clostridien-Wachstumsmedium bei 37°C bei pH 5,5 und 6,0 gewachsen ist. (A-C) Auswirkungen der 12C6+-Ionen-Bestrahlung (Energie 68 AMeV und Dosen von 20, 30 und 40 Gy) auf die Glucosekonzentration, die Buttersäureproduktion und das Trockengewicht der Biomasse. (D-F) Auswirkung der 12C6+-Ionen-Bestrahlung (Energie 114 AMeV und Dosen von 20, 30 und 40 Gy) auf die Glukosekonzentration, die Buttersäureproduktion und das Trockengewicht der Biomasse. (G) SDS-PAGE von zellulären Proteinen aus C. tyrobutyricum. Spur WT: Wildtyp; Spur 1: mit 68 AMeV und einer Dosis von 30 Gy bestrahlte Zellen; Spur 2: mit 68 AMeV und einer Dosis von 40 Gy bestrahlte Zellen; Spur 3: mit 114 AMeV und einer Dosis von 30 Gy bestrahlte Zellen; Spur 4: Wildtyp und mit 114 AMeV und einer Dosis von 40 Gy bestrahlte Zellen; Spur MW: Protein-Molekulargewichtsmarker.
Die Induktion der ack- und pta-Gene, die für Enzyme im Zusammenhang mit dem Acetatbildungsweg kodieren, verbessert die Buttersäureproduktion erheblich. Um die Fermentationskinetik des Glukosestoffwechsels nach Exposition von C. tyrobutyricum mit 12C6+-Ionen und die daraus resultierende Schädigung der ack- und pta-Gene besser zu verstehen, wurde die Proteinexpression von Wildtyp und bestrahlten Stämmen untersucht und verglichen. Abbildung 4G zeigt die Ergebnisse der SDS-PAGE. Die Analyse bestätigte die Expression des Proteins (Molekulargewicht, ca. 85 kDa) in vier bestrahlten Stämmen, mit dem höchsten Proteinexpressionsniveau in Spur 4. Die Menge eines etwa 106 kDa großen Proteins war bei dem mit 114 AMeV und 40 Gy bestrahlten Stamm viel höher als beim Wildtyp-Stamm. AK und PTA aus verschiedenen Mikroorganismen wurden charakterisiert, aber die Ergebnisse zeigten große Schwankungen in ihrem Molekulargewicht. Daher wurden Enzymaktivitätstests durchgeführt, um die Rolle von AK, PTA und PTB in den säurebildenden Stoffwechselwegen weiter zu untersuchen (Abbildung 3). Die Selektivität des Stoffwechsels in C. tyrobutyricum wird durch das Wachstumsstadium beeinflusst, wobei exponentiell wachsende Kulturen sowohl Buttersäure als auch Essigsäure produzieren, während langsamere stationäre Wachstumsraten eher Buttersäure produzieren. Daher wurden während der logarithmischen Wachstumsphase jeder Charge Kulturproben entnommen und auf die Aktivitäten von PTA, PTB und AK in den bestrahlten und Wildtyp-Stämmen untersucht. Die spezifischen Enzymaktivitäten für PTA, PTB und AK in den bestrahlten Stämmen (verschiedene physikalische Parameter) wurden bestimmt und ihre relativen Aktivitäten mit denen des Wildtyp-Stammes verglichen. Die AK-Aktivität war bei den mit 114 AMeV und 40 Gy bestrahlten Stämmen um ca. 47 %, bei den mit 114 AMeV und 30 Gy bestrahlten Stämmen um 31 % und bei den mit 68 AMeV und 40 Gy bestrahlten Stämmen um 26 % reduziert. Im Vergleich zu den Wildtyp-Stämmen hatten die mit 114 AMeV und 40 Gy bestrahlten Stämme eine geringere AK-Aktivität (47 %), aber eine unerwartet höhere PTA-Aktivität (129 %), obwohl die PTB-Aktivitäten ähnlich waren. Da die mit 114 AMeV bestrahlten Stämme eine viel geringere AK-Aktivität aufwiesen, wäre der PTA-AK-Stoffwechselweg beeinträchtigt gewesen, so dass sie mehr Butyrat (60 g-L-1) aus Glukose produzierten als die Wildtyp-Stämme. Wie bereits erwähnt, können diese Verbesserungen auf eine erhöhte Toleranz gegenüber der Butyrathemmung und bis zu einem gewissen Grad auf den verringerten Kohlenstofffluss durch den PTA-AK-Stoffwechselweg zurückgeführt werden, was durch das erhöhte Butyrat/Acetat-Verhältnis in den bestrahlten Stämmen belegt wird.
Wirkung von 12C6+ -Bestrahlung auf den Säureertrag und das Wachstum von C. tyrobutyricum
Ein Experiment wurde im Fermentationsmodus unter Verwendung von Glucose als primäre Kohlenstoffquelle durchgeführt, um die Butyrat-Produktionskapazität von C. tyrobutyricum ATCC 25755 nach der Bestrahlung zu bestimmen. Wie in Abbildung 5A,B zu sehen ist, stieg die Buttersäure-Ausbeute aus Glucose signifikant an, von 0,43 g-g-1 für die Wildtyp-Stämme auf 0,56 g-g-1 für den Stamm, der mit 68 AMeV und einer Dosis von 30 Gy bestrahlt wurde, 0.59 g-g-1 für den mit 68 AMeV und einer Dosis von 40 Gy bestrahlten Stamm, 0,63 g-g-1 für den mit 114 AMeV und einer Dosis von 30 Gy bestrahlten Stamm und 0,66 g-g-1 für den mit 114 AMeV und einer Dosis von 40 Gy bestrahlten Stamm. Es ist bemerkenswert, dass die Butyratausbeute für den mit 114 AMeV und einer Dosis von 40 Gy bestrahlten Stamm höher gewesen wäre (>0,66 g-g-1), wenn der Glukoseverbrauch während der Verzögerungsphase vernachlässigt worden wäre. Die Essigsäure, die von dem mit 68 AMeV und Dosen von 30 und 40 Gy bestrahlten Stamm produziert wurde, war ähnlich wie die des Wildtyps. Die Essigsäure, die von dem mit 114 AMeV und Dosen von 30 und 40 Gy bestrahlten Stamm produziert wurde, nahm jedoch im Vergleich zu der des Wildtyps ab. Wie in Abbildung 5B gezeigt, nahm die Essigsäureausbeute aus Glukose ebenfalls deutlich ab, von etwa 0,11 g-g-1 für den Wildtyp-Stamm auf etwa 0,08 g-g-1 für den Stamm, der mit 114 AMeV und 30 Gy bestrahlt wurde, und etwa 0,07 g-g-1 für den Stamm, der mit 114 AMeV und 40 Gy bestrahlt wurde. Dennoch stieg das Butyrat/Acetat-Verhältnis (g/g) von 3,99 für den Wildtyp-Stamm auf 5,82 für die bestrahlten Stämme, ein deutlicher Hinweis darauf, dass die Stoffwechselwege in den bestrahlten Stämmen zugunsten der Buttersäureproduktion gegenüber der Essigsäureproduktion verschoben wurden. Da die AK- und PTA-Aktivitäten in den bestrahlten Stämmen deutlich reduziert waren, muss mehr Pyruvat über den Butyrat-produzierenden Stoffwechselweg abgebaut worden sein, was zu höheren Butyrat-Ausbeuten aus Glukose führt (siehe Abbildung 3). Außerdem könnte die Buttersäure eine frühere Umstellung auf den säurebildenden Stoffwechselweg gefördert haben, was sich in einer langsameren Wachstumsrate niederschlagen könnte. Aus demselben Grund wiesen die bestrahlten Proben eine langsamere Wachstumsrate auf, weil weniger ATP aus dem Acetat-produzierenden (PTA-AK) Weg produziert wurde, der normalerweise mehr ATP pro Mol verstoffwechselter Glukose erzeugen kann als der Butyrat-produzierende (PTB-BK) Weg .
Vergleich der Säureproduktion von Wildtyp- und bestrahlten C. tyrobutyricum-Zellen. (A) Die Produktion von Buttersäure und Essigsäure wurde aus den Steigungen der linearen Plots für die Wildtyp-Zellen und die mit 68 AMeV und Dosen von 30 und 40 Gy bestrahlten Zellen geschätzt. (B) Die Produktion von Buttersäure und Essigsäure wurde anhand der Steigungen der linearen Diagramme für die Wildtyp-Zellen und die mit 114 AMeV und Dosen von 30 und 40 Gy bestrahlten Zellen geschätzt. (C) Linearisierung (Integration) der kinetischen Wachstumsprofile des Biomasse-Trockengewichts über die Zeit unter Verwendung einer natürlichen Logarithmentransformation. Die maximalen spezifischen Wachstumsraten für die Wildtyp- und die bestrahlten Zellen wurden entsprechend dem Beispiel für die mit 114 AMeV und einer Dosis von 40 Gy bestrahlten Zellen berechnet, die in Clostridium-Wachstumsmedium mit 60 g-L-1 Glukose gewachsen sind. BDW, Biomasse-Trockengewicht.
Ein Diagramm von μ max wurde dann bei hohen Anfangsglukosekonzentrationen (40, 60, 80 und 120 g-L-1) durch Anpassung der Fermentationsdaten an die Vorhersagen aus der Modellsimulation bestimmt. Die Linearisierung (Integration) der kinetischen Wachstumsprofile des Biomassetrockengewichts (BDW) über die Zeit wurde durch Verwendung der natürlichen Logarithmentransformation erreicht:
Wobei x(t) = BDW-Konzentration zu jedem Zeitpunkt x 0; t = anfängliche BDW-Konzentration; μ max = maximale spezifische Wachstumsrate (h-1); und die spezifische Wachstumsrate ist μ = (1/x(t)) – (dx/dt). Zur Vereinfachung wurde angenommen, dass alle Bakterien dem Exponentialgesetz des Zellwachstums in einer Batch-Kultur gemäß einem kinetischen Modell erster Ordnung folgen. Die spezifische Wachstumsrate der Zellen bzw. die Zunahme der Zellmasse im Laufe der Zeit stellt eine Verschiebung der Selektivität bei unterschiedlichen Wachstumsraten dar, die einen erheblichen Einfluss auf den Fermentationsprozess hat. Schnelles Zellwachstum hat einen höheren Energiebedarf und produziert bevorzugt Essigsäure. Bei niedrigen Wachstumsraten wird die Produktion von Buttersäure gegenüber Essigsäure bevorzugt. Bei kontinuierlicher Gärung ist die Produktion von Butyrat/Buttersäure höher, wenn μ niedriger ist. Wenn μ gegen Null tendiert, kommt es zu einer Oszillation der Produktivität. Diese Gleichungen ermöglichen einen Vergleich der Wachstumsrate von Batch- und kontinuierlichen Systemen in den Wildtyp- und Strahlenstämmen.
Das Modell ist nicht medienunabhängig: Das wie oben beschrieben verwendete Medium wirkt sich sowohl auf die Wachstumsrate der Zellen als auch auf die produzierten Butyrat-/Buttersäuremengen aus, und unterschiedliche Glukoseverbrauchsprofile würden zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Um die optimale Glukosekonzentration für das Zellwachstum besser quantifizieren zu können, wurden die maximalen spezifischen Wachstumsraten für den Wildtyp und die bestrahlten Stämme aus kinetischen Daten der exponentiellen Wachstumsphase bestimmt und gegen die Konzentration der zugesetzten Glukose aufgetragen. Wie in Abbildung 5C zu sehen ist, wurden die maximalen spezifischen Wachstumsraten für die Stämme, die mit 114 AMeV und einer Dosis von 40 Gy bestrahlt wurden, gemäß dem Beispiel berechnet, bei dem der Stamm in CGM-Medium mit 60 g-L-1 Glukose gewachsen ist. Es wurde der beste lineare Bereich von Datenpunkten gewählt, der der exponentiellen Wachstumsphase des Stammes entsprach. In einigen Fällen, in denen die Mindestanforderung von drei experimentellen Datenpunkten nicht erfüllt war, wurde ein alternativer Ausdruck verwendet, der nur zwei Extrempunkte (am Anfang und am Ende der exponentiellen Phase) berücksichtigte. Die Steigung der Geraden (m = μmax) ergibt die maximale spezifische Wachstumsrate (0,213 h-1). Das unitäre lineare Regressionsmodell (y = 0,2129x – 2,6457) hatte einen bereinigten Bestimmungskoeffizienten von R2 = 0,9765, was bedeutet, dass alle Datenpunkte auf der Linie der besten Anpassung lagen und keine Datenpunkte von dieser Linie abwichen. Darüber hinaus wurde jede spezifische Wachstumsrate anhand der Steigung der entsprechenden halblogarithmischen Kurve des BDW über der Zeit geschätzt. Die Fehlerbalken sind als Standardabweichung (SD) ausgedrückt, die sich aus den Berechnungen für jede unabhängige Fermentationswiederholung für die bestrahlten Stämme und den Wildtyp ergeben (die Originaldaten sind nicht dargestellt). Die Ergebnisse zeigen, dass diese bestrahlten Stämme eine signifikant niedrigere spezifische Wachstumsrate (μ = 0,38 ±0,03 bis 0,21 ±0,02 h-1) im Vergleich zum Wildtyp (μ = 0,38 bis 0,42 h-1) aufweisen. Die Bestrahlung mit 12C6+-Ionen bei 68 AMeV, 20 bis 40 Gy und 106 bis 108 Ionen-Impulsen-1 führte zu einer besonders langen Verzögerungsphase von 10, 12 bzw. 16 Stunden. Im Vergleich dazu führte die Bestrahlung mit 12C6+-Ionen bei 114 AMeV, 20 bis 40 Gy und 106 bis 108 Ionen-Puls-1 zu Verzögerungsphasen von 12, 18 bzw. 24 Stunden. Diese längeren Verzögerungsphasen können zum Teil auf die unterschiedlichen Bestrahlungsparameter und die geringe Impfdichte bei der Fermentation zurückgeführt werden. Die geringere spezifische Wachstumsrate der bestrahlten Zellen könnte auf die metabolische Belastung der Zellen zurückzuführen sein, die sich aus der geringeren Menge an Energie ergibt, die durch den Glukosestoffwechsel erzeugt wird, weil die Zellen bei höheren Energien und Dosen geschädigt werden. Im Vergleich zu den Wildtyp-Stämmen wiesen die mit 20 und 30 Gy bei 68 AMeV bestrahlten Stämme ähnliche Wachstums- und Glukoseverbrauchsprofile auf, mit einer fast identischen spezifischen Wachstumsrate von μ = 0,42 ±0.03 h-1, während die mit 30 und 40 Gy bestrahlten Stämme bei 114 AMeV eine deutlich längere Verzögerungsphase, einen langsameren Glukoseverbrauch und eine viel geringere spezifische Wachstumsrate von μ = 0,26 ±0,03 h-1 (30 Gy) und μ = 0,21 ±0,02 h-1 (40 Gy) aufwiesen.
Wie bereits erwähnt, wird Acetat über PTA- und AK-Reaktionen synthetisiert, wobei die letztere Reaktion ATP liefert (Abbildung 3). Für die Biosynthese von Butyrat werden zwei Moleküle Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA kondensiert, gefolgt von einer Reduktion zu Butyryl-CoA, das dann über PTB- und BK-Reaktionen unter ATP-Gewinnung in Butyrat umgewandelt wird. Die geringere spezifische Wachstumsrate für die bestrahlten Stämme (Energie 114 AMeV und Dosen von 30 und 40 Gy) kann auf die metabolische Belastung der Zellen durch eine geringere Energie (ATP)-Generierung während des Glukosestoffwechsels aufgrund der Bestrahlungsschäden von ack und pta zurückgeführt werden. Das BDW aus Glukose für die bestrahlten Stämme unterschied sich ebenfalls von dem der Wildtyp-Stämme. Die Darstellung des BDW über der Zeit und der spezifischen Wachstumsrate der bestrahlten Stämme zeigte, dass der Kohlenstoff- und Energiefluss in den Stoffwechselwegen dieser Stämme umverteilt wurde, was auch zu signifikanten Veränderungen in der Säureproduktion der Fermentationsprodukte führte.