Struktur der humanen lysosomalen sauren α-Glucosidase – ein Wegweiser für die Behandlung der Pompe-Krankheit

Strukturübersicht

GAA wird als 110 kDa Glykoprotein synthetisiert, Es wird über den Mannose-6-Phosphat-Rezeptor zum Lysosom transportiert und durchläuft im späten endosomalen/lysosomalen Kompartiment eine Reihe von proteolytischen und N-Glykan-Prozessen, die zu einer reifen aktiven Form führen, die aus vier eng miteinander verbundenen Peptiden besteht19,20. Da die Kristallisation der kommerziellen Myozyme®-Vorläuferform von rhGAA (Q57-C952) keine Kristalle ergab, die sich über ~7 Å hinaus beugten, und Proteinstörungsprädiktoren21 auf das Vorhandensein ungeordneter Peptidregionen hinwiesen, führten wir eine In-situ-Proteolyse mit α-Chymotrypsin durch, um mutmaßliche flexible Oberflächenschleifen zu entfernen, die die Bildung produktiver Kristallkontakte behindern. Die proteolytische Behandlung führte zu einem Polypeptid mit einer um ~5 kDa geringeren Masse als der rhGAA-Vorläufer (Abb. 2a), das sich leicht kristallisieren ließ. Dies ermöglichte es uns, Beugungsdaten bis zu 1,9 Å zu sammeln und die Struktur von rhGAA durch molekulare Substitution zu lösen (Tabelle 1). Die proteolytisch verdaute Form hatte eine Aktivität, die mit der des Vorläufers vergleichbar war (2,34 ± 0,06 und 2,26 ± 0,16 U mg-1 für den Vorläufer bzw. die reife Form), was darauf hindeutet, dass die α-Chymotrypsin-Behandlung die Funktionalität von rhGAA nicht verändert hat.

Die Kristallstruktur von rhGAA entspricht der reifen Form von humanem plazentarem GAA und rhGAA20 (Abb. 2b). 2b), was darauf hindeutet, dass die Behandlung mit α-Chymotrypsin die Entfernung der proteaselabilen Regionen (Q57-T80, G116-M122, R199-A204 und A782-R794) auf eine Weise ermöglichte, die mit der in vivo stattfindenden proteolytischen Reifung vergleichbar ist. Die Gesamtarchitektur von rhGAA ähnelt der der menschlichen Glykosidhydrolase-Familie GH311-Homologen, den intestinalen Bürstengrenzenzymen Maltase-Glucoamylase (MGAM)22,23 und Sucrase-Isomaltase (SI)24 (Abb. 2c und ergänzende Abb. 1). Auf eine N-terminale Trefoil-Typ-P-Domäne folgt eine β-Faltblatt-Domäne, das katalytische (β/α)8-Fass mit zwei Inserts nach β-Strängen β3 (Insert I) und β4 (Insert II) sowie proximale und distale β-Faltblatt-Domänen am C-Terminus. Die Vorläuferform von rhGAA enthält ~14 kDa Kohlenhydrat und sieben Glykosylierungsstellen wurden vorhergesagt und charakterisiert20. Für fünf von ihnen konnten wir in der Kristallstruktur Glykanstrukturen unterschiedlicher Länge beobachten, insbesondere an N140, N233, N390, N470 und N652 (Abb. 2c und ergänzende Abb. 2). Wir entdeckten eine restliche Differenz-Elektronendichte an N882, die nicht ausreicht, um eine Glykanstruktur zu modellieren, und beobachteten keine Differenz-Elektronendichte in der Nähe von N925.

Aktive Stelle und Inhibitor-Bindung

Die schmale Substrat-Bindungstasche von rhGAA befindet sich in der Nähe der C-terminalen Enden der β-Stränge der katalytischen (β/α)8-Domäne und wird durch eine Schleife aus der N-terminalen β-Sheet-Domäne und den beiden Inserts I und II geformt (Abb. 2c). Die Enzyme der Familie GH31 katalysieren über einen klassischen Koshland-Doppelverschiebungs-Reaktionsmechanismus, wobei die anomere Kohlenstoffkonfiguration im Produkt erhalten bleibt. Aus einer frühen Charakterisierung der katalytischen Stelle von GAA25 und durch Homologie mit mechanistisch sezierten Mitgliedern der Familie GH3126,27 können das katalytische Nukleophil und die Säure/Base dem D518 bzw. D616 zugeordnet werden. Um einen Einblick in die Wechselwirkung von rhGAA mit dem dokumentierten pharmakologischen Chaperon 1-Deoxynojirimycin16,28 und seinem Derivat N-Hydroxyethyl-Deoxynojirimycin29 (DNJ bzw. NHE-DNJ) zu erhalten, haben wir rhGAA-Kristalle mit diesen auf das aktive Zentrum gerichteten Iminozucker-Inhibitoren getränkt und für beide Komplexe Beugungsdaten mit einer Auflösung von 2,0 Å erhalten (Tabelle 1). DNJ bindet in einer 4C1-Konformation im substratbindenden Teilbereich -130 und wird durch Wasserstoffbrückenbindungen zu den Seitenketten von D404, D518, R600, D616 und H674 stabilisiert. Weitere stabilisierende Wechselwirkungen sind durch hydrophobe Kontakte mit W376, I441, W516, M519, W613 und F649 gegeben (Abb. 3a, b). Abgesehen von einer 20°-Kippung der Seitenkette von W376 treten nach der Bindung von DNJ im aktiven Zentrum von rhGAA keine größeren Konformationsänderungen auf. Dies ist nicht der Fall bei der Bindung von NHE-DNJ, das die gleiche Stellung wie DNJ einnimmt, bei dem aber der Hydroxyethyl-Substituent erhebliche Konformationsänderungen an den Seitenketten von M519 und W481 bewirkt (Abb. 3c, d). In dieser ligandeninduzierten Konformation bildet der rhGAA-Rest W481, der sich an der Spitze von Insert I befindet, eine stabilisierende Wechselwirkung mit dem Hydroxyethylsubstituenten von NHE-DNJ. Ähnliche Konformationsänderungen können bei der Bindung von NHE-DNJ an die N-terminale Untereinheit von MGAM (NtMGAM)31 beobachtet werden (ergänzende Abb. 3a).

Substraterkennung und Spezifität

Um eine Vorstellung von der Substraterkennung durch rhGAA zu erhalten, haben wir die Beugungsdaten bis zu einer Auflösung von 2,45 Å für einen rhGAA-Kristall gewonnen, der mit Acarbose, einem nicht spaltbaren α-1,4-Tetrasaccharid-Substratanalogon, getränkt war (Tabelle 1). In diesem Komplex nimmt der Valienaminring, der im Unterfeld -1 untergebracht ist, eine 2H3-Halbchair-Konformation an. Trotz dieses Konformationsunterschieds im Vergleich zu DNJ, das in der 4C1-Halbchair-Konformation gebunden ist, ist das Wasserstoffbrückenbindungsmuster im Unterfeld -1 für beide Verbindungen im Wesentlichen identisch (Abb. 3e, f und ergänzende Abb. 3b). Der nicht hydrolysierbare „interglycosidische“ Stickstoff nimmt das katalytische Zentrum ein und ist mit der katalytischen Säure/Base D616 wasserstoffgebunden. Die 6-Desoxyglucosyleinheit in Unterseite + 1 bildet über ihre 2- und 3-Hydroxylgruppen Wasserstoffbrückenbindungen mit dem konservierten R600 und mit D282, das aus einer Schleife in der N-terminalen β-Faltblattdomäne stammt. Obwohl die Reste dieser Schleife in der Sequenz nicht konserviert sind, interagieren sie in allen verfügbaren Kristallstrukturen der Mitglieder der Familie GH31 ausnahmslos mit Kohlenhydratliganden. Die Maltoseeinheit der Acarbose in den Unterseiten + 2 und + 3 geht keine direkten Wechselwirkungen mit rhGAA ein und wird vielmehr durch Wechselwirkungen der Kristallgitterpackung und einen durch Wasser vermittelten Kontakt mit der Seitenkette von W618 am Rand der Substratbindetasche stabilisiert. Diese geringe Anzahl von Wechselwirkungen deutet darauf hin, dass rhGAA nur zwei produktive Substratbindungsstellen besitzt, nämlich die Unterseiten -1 und + 1. Interessanterweise nimmt die an rhGAA gebundene Acarbose-Maltose-Einheit jedoch die gleiche Gesamtstellung ein wie bei der Bindung an NtMGAM22, was auf eine funktionelle Rolle auch für die Unterseiten + 2 und + 3 in rhGAA hindeutet (ergänzende Abb. 3c). 3c).

Glykogen ist ein großes Polymer, das aus linearen Ketten von α-1,4-verknüpften Glukoseresten mit α-1,6-verknüpften Verzweigungen aufgebaut ist. Im Zytosol wird das Energiespeicherpartikel durch die gleichzeitige Wirkung von Glykogenphosphorylase und eines Debranching-Enzyms abgebaut. Im Lysosom ist kein Debranching-Enzym vorhanden und GAA muss die Hydrolyse sowohl der α-1,4- als auch der α-1,6-glykosidischen Bindungen sicherstellen. Allerdings zeigt rhGAA eine klare Präferenz für die erstgenannte Bindung, da die Spezifitätskonstante für Maltose 32-mal höher ist als die für Isomaltose (ergänzende Tabelle 2). Um die strukturelle Grundlage für die duale Substratspezifität aufzudecken, haben wir versucht, rhGAA-Kristalle mit dem nicht hydrolysierbaren Tetrasaccharid Glucopyranosyl-α-(1,6)-thio-Maltotriose zu tränken. Dieser Ansatz schlug jedoch fehl, was höchstwahrscheinlich daran lag, dass Kristallkontakte die Aufnahme des Tetrasaccharids behinderten, das aufgrund der α-1,6-Verknüpfung etwas länger ist als Acarbose. Es wurde beobachtet, dass letztere kaum in den Substratbindungsspalt passt und eng an ein symmetrieverwandtes Molekül angrenzt (Abb. 3e). Wir haben ein α-1,6-verknüpftes Disaccharid, das im aktiven Zentrum von rhGAA gebunden ist, durch eine strukturelle Überlagerung von rhGAA mit der katalytischen (β/α)8-Domäne von Blautia obeum GAA im Komplex mit Isomaltose32 (rmsd von 1,50 Å für 318 ausgerichtete Cα-Positionen) abgeleitet. Das Modell zeigt, dass durch die Unterbringung einer α-1,6-Verknüpfung zwischen Unterseite -1 und + 1 keine sterische Behinderung auftritt und dass produktive Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der Glykopyranoseeinheit in Unterseite + 1 und D282 erhalten bleiben (Abb. 4a, b). Aufgrund der größeren Länge der α-1,6-Verknüpfung im Vergleich zu einer α-1,4-Verknüpfung ist die stabilisierende Wasserstoffbrückenbindung mit R600 jedoch geschwächt, was eine geringere Aktivität des Enzyms an α-1,6-verknüpften Zweigen erklären könnte.

Die sekundäre substratbindende Domäne

Im rhGAA-Acarbose-Komplex konnten wir den Acarvosin-Anteil eines zweiten Acarbose-Moleküls in einer Tasche innerhalb der N-terminalen Trefoil-Typ-P-Domäne beobachten, die sich auf derselben Seite von rhGAA befindet, auf der sich die aktive Stelle befindet, und 25 Å von der darin gebundenen Acarbose entfernt ist (Abb. 4c). Der Valienaminanteil geht mit seinen 4- und 6-Hydroxylgruppen Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Hauptkettenstickstoff und -sauerstoff von C127, dem Hauptkettensauerstoff von A93 und der Seitenkette von D91 ein. Weitere stabilisierende Wechselwirkungen sind durch Stapelwechselwirkungen mit P125 und W126 gegeben. P125 und D91 sind konserviert oder durch konservative Substitutionen in den Enzymen der GH31-Familie ersetzt, die eine dreifaltige Typ-P-Domäne umfassen (ergänzende Abb. 4a). Neben der sekundären Kohlenhydratbindungsstelle war die Oberflächenschleife G116-M122 durch proteolytische Behandlung abgeschnitten worden. Es ist denkbar, dass die Entfernung des Segments G116-M122, das nur bei den lysosomalen Vertretern der Familie GH31 vorkommt (ergänzende Abb. 4a, b), zur Bildung der sekundären Substratbindungsstelle beiträgt. Man könnte sich vorstellen, dass die sekundäre Acarbose-Bindungsstelle auf rhGAA eine echte Substratbindungsstelle darstellt, die möglicherweise die Prozessivität des Enzyms erhöht. Diese Stelle könnte auch ein Pharmakophor für das In-silico-Screening nach neuen pharmakologischen Chaperonen darstellen. Besonders bemerkenswert ist, dass ein von Acarbose abgeleitetes Trisaccharid an die N-terminale Domäne der α-1,4-Glucanlyase der Familie GH31 aus Gracilariopsis lemaneiformis 33 in einer Position nahe der hier beschriebenen sekundären Substratbindungsstelle gebunden ist (ergänzende Abb. 5).

N-Acetylcystein ist ein allosterisches pharmakologisches Chaperon

Das bekannte Arzneimittel N-Acetylcystein (NAC) wirkt nachweislich als allosterisches pharmakologisches Chaperon, das die Stabilität von mutiertem endogenem GAA und rhGAA, die für die ERT verwendet werden, erhöht, ohne die katalytische Aktivität zu beeinträchtigen18. Um das therapeutische Potenzial von NAC für die Pompe-Krankheit durch Strukturstudien nutzbar zu machen, haben wir die Kristallstruktur von rhGAA im Komplex mit NAC untersucht. Die Struktur des Komplexes mit einer Auflösung von 1,83 Å, die wir durch Experimente mit dem Einweichen von Kristallen erhalten haben (Tabelle 1), zeigt zwei NAC-Bindungsstellen, die vom aktiven Zentrum entfernt sind (Abb. 4d, e), was strukturelle Beweise dafür liefert, dass NAC tatsächlich ein allosterisches Chaperon ist, wie es die funktionellen Studien erwarten lassen18. Mit Hilfe von Aktivitätsassays und Differential-Scanning-Fluorimetrie konnten wir feststellen, dass NAC rhGAA und das in dieser Studie hergestellte proteolytisch gereifte Enzym gleichermaßen stabilisiert, und dass das Chaperon spezifisch für GAA ist, da NAC keine stabilisierende Wirkung auf ein GH31-Homolog aus Reis hat (ergänzende Abb. 6a, b und ergänzende Tabellen 3 und 4). In der Struktur des rhGAA-NAC-Komplexes befindet sich ein NAC-Molekül, das als NAC1 bezeichnet wird, etwa 30 Å vom aktiven Zentrum entfernt, an der Schnittstelle zwischen dem (β/α)8-Fass und der distalen β-Faltblattdomäne (Abb. 4d). NAC1 bindet an das Hauptkettencarboxyl von H432 über dessen Amidstickstoff, und die Carboxylfunktion stellt einen wasservermittelten Kontakt mit der Seitenkette von D513 her. Die Cβ-Sγ- und die Acetylgruppen bilden Stapelwechselwirkungen mit der Guanidingruppe von R437 bzw. der Schleife G434-G435. Ein zweites, teilweise (75%) besetztes NAC-Molekül (NAC2) befindet sich an der Schnittstelle zwischen dem (β/α)8-Fass und der proximalen β-Faltblattdomäne in einem Abstand von 25 Å vom aktiven Zentrum (Abb. 4e). Die Carboxylfunktion von NAC2 stellt einen wasservermittelten Kontakt mit dem Hauptkettensauerstoff von L756 her, das Thiol stapelt sich gegen die Seitenkette von Q757 und die Acetylgruppe stapelt sich gegen die Seitenkette von H742. Die beiden NAC-Moleküle gehen weniger und schwächere Wechselwirkungen mit rhGAA ein als die Chaperone DNJ und NHE-DNJ. Dies spiegelt die höheren Konzentrationen von NAC wider, die für die Chaperonaktivität benötigt werden (mM vs. µM), wie der K D von 11,57±0,74 mM, den wir durch Differential Scanning Fluorimetry erhalten haben, und der K i von 3,4 bzw. 3,0 µM für DNJ und NHE-DNJ zeigen18,29. Eine sigmoidale Sättigungskurve, die am besten zu den experimentellen Punkten passt, unterstützt die vollständig (NAC1) und teilweise (NAC2) besetzten allosterischen Bindungsstellen von NAC (ergänzende Abb. 6c). Die zwischen den Acetylgruppen von NAC1 und NAC2 und rhGAA aufgebauten Stapelwechselwirkungen müssen erheblich zur Bindungsenergie beitragen, da mit NAC verwandte Aminosäuren wie N-Acetylserin und N-Acetylglycin ebenfalls eine stabilisierende Wirkung auf rhGAA haben, während die nicht-acetylierten Gegenstücke keine Wirkung zeigen18. Die Struktur des rhGAA-NAC-Komplexes zeigt eine Abnahme der atomaren thermischen Verschiebungsparameter von Resten, die die NAC-Bindungsstellen umgeben, im Vergleich zu ungebundenem rhGAA, was auf eine allgemeine Stabilisierungsfunktion zwischen den Domänen durch NAC hinweist (ergänzende Abb. 7a-d). Im Kristall scheint NAC auch eine antioxidative Wirkung auszuüben, da der Rest C938 in allen hier beschriebenen Kristallstrukturen zur Sulfensäureform oxidiert ist, mit Ausnahme der Struktur des rhGAA-NAC-Komplexes (ergänzende Abb. 8a, b).

NAC und Iminozucker zeigen unterschiedliche Chaperonprofile

Einige Mutationen, die zur Pompe-Krankheit führen, sprechen sowohl auf NAC als auch auf die Iminozucker DNJ und NB-DNJ an, während andere spezifisch auf das eine oder andere pharmakologische Chaperon reagieren16,17,18. Die überwiegende Mehrheit der GAA-Mutanten, die auf die Chaperonaktivität von Iminozuckern ansprechen, befinden sich entweder in Reichweite des aktiven Zentrums oder auf Strukturelementen, die zu dessen globaler Architektur beitragen. In Pompe-Patienten, Fibroblasten und Mausmodellen befinden sich die GAA-Mutanten, die am stärksten auf NAC ansprechen (A445P, Y455F und L552P)18 , auf den Inserts I und II, wo die entsprechenden Wildtyp-Reste zur Stabilisierung der Domäne beitragen. A445 definiert zusammen mit F487 die Grenzen von Insert I, und die A445P-Mutante destabilisiert höchstwahrscheinlich das gesamte Gerüst von Insert I (ergänzende Abb. 9a). Die Seitenkettenhydroxylgruppe von Y455 auf Insert I interagiert mit einer langen Schleife der katalytischen Domäne, während die Seitenkette von L552 auf Insert II hydrophobe Wechselwirkungen mit Resten der N-terminalen β-Faltblattdomäne eingeht (ergänzende Abb. 9b, c). Die entsprechenden Y455F- und L552P-Mutanten haben mit Sicherheit eine insgesamt destabilisierende Wirkung, die durch NAC eindeutig aufgehoben wird. Daher kann die Chaperonwirkung von Iminozuckern als konformationelle Rettung von strukturell gestörten aktiven Stellen betrachtet werden, während die Wirkung des allosterischen Chaperons NAC auf die Stabilisierung allgemeiner oder lokaler Konformationsschwankungen zurückzuführen zu sein scheint.