Synthese und hemmende Wirkung einiger 4-Hydroxycumarin-Derivate auf die HIV-1-Protease

Abstract

Sechs neue 4-Hydroxycumarin-Derivate wurden rational synthetisiert, verifiziert und durch molekulares Docking unter Verwendung von Kristall-HIV-1-Protease charakterisiert. Molekulare Docking-Studien sagten die Antiprotease-Aktivität von (7) und (10) voraus. Die wichtigsten funktionellen Gruppen, die für die Interaktion mit der HIV-1-Protease durch die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen verantwortlich sind, sind das Pyran-Sauerstoffatom, das Lacton-Carbonyl-Sauerstoffatom und eine der Hydroxylgruppen. Die neu synthetisierten Verbindungen wurden in MT-4-Zellen biologisch auf die Hemmung der HIV-1-Replikation getestet, wobei der Schutz der Zellen vor der zytopathischen Wirkung von HIV, gemessen am Zellüberleben im MTT-Test, untersucht wurde. Ein Derivat -7 zeigte eine 76-78%ige Hemmung der Virusinfektiosität mit IC50 = 0,01 nM, viel weniger als die maximale nicht toxische Konzentration (1 mM). Die Antiprotease-Aktivität von 7 in zwei verschiedenen Konzentrationen wurde mit 25% festgestellt. Dennoch ermutigen die Ergebnisse der Studie von (7) dazu, es als Pharmakophor für die weitere Synthese und Bewertung der Anti-HIV-Aktivität zu verwenden.

1. Einleitung

Die retrovirale Protease (PR) des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) ist eines der Schlüsselenzyme für die Virusreplikation. Sie spaltet Protein- und Glykoproteinvorstufen, um aktive virale Enzyme und Strukturproteine zu erzeugen. Das inaktive HIV-1 PR führt zu nicht infektiösen Virionen. Diese Tatsache regte die Suche nach potenten Substanzen mit Antiprotease-Aktivität an, die die HIV-1-Replikation hemmen. In den letzten 12 Jahren wurde eine Reihe von peptidomimetischen Analoga – Inhibitoren der HIV-1-PR (PIs) – klinisch eingeführt, aber die meisten von ihnen weisen schlechte pharmakologische Eigenschaften auf, wie z. B. schlechte orale Bioverfügbarkeit, schnelle Clearance und Verträglichkeitsprobleme – oft in Verbindung mit Lypodystrophie und Dyslipidämie. Da es sich um Peptidomimetika handelt, zeigen Virusisolate außerdem schnell ein hohes Maß an Resistenz und Kreuzresistenz, selbst wenn die Mitglieder der Gruppe verwendet werden, bevor PIs auf den Markt kamen.

Die Entwicklung neuer nicht-peptidischer PIs, wie Tipranavir und Darunavir, zeigte eine beeindruckende Wirksamkeit gegen PI-resistente Mutanten und bleibt somit eine wichtige Option für Patienten, die eine solche Resistenz aufweisen . Dies ist der Grund für die Suche nach neuen nicht-peptidischen Substanzen, die die HIV-1-Protease hemmen. Experimentelle Daten über einige nichtpeptidische Substanzen – 4-Hydroxycumarine (Abbildung 1) und 4-Hydroxypyran-Derivate, die die HIV-1-PR hemmen, unterstützen diese Idee .

Abbildung 1

Struktur von 4-Hydroxycumarin.

Da wir seit vielen Jahren an der Synthese und Bewertung einer Reihe von nichtpeptidischen Substanzen wie 4-Hydroxycumarin-Derivaten interessiert sind, wurden wir ermutigt, diese Versuche zu erweitern. Hier werden eine Reihe neuer Synthesen vorgestellt, begleitet von molekularen Docking-Experimenten unter Verwendung von Kristallenzymen und der Bewertung der biologischen Aktivität von neuen und vielversprechenden 4-Hydroxycumarin-Derivaten.

2. Ergebnisse und Diskussion

2.1. Synthese von 4-Hydroxycumarin-Derivaten

2.1.1. Synthese von Arylmethylen-β-Ketoestern

Unterschiedlich substituierte aromatische Aldehyde werden zur Synthese von Arylmethylen-β-Ketoestern über die Knoevenagel-Reaktion mit Ethylacetoacetat in Gegenwart von Piperidin als basischem Mittel und Eisessig verwendet. Diese Arylmethylen-β-ketoester können wie in Abbildung 2 dargestellt werden.

Abbildung 2

Allgemeine chemische Struktur und Synthese von Arylmethylen-β-ketoestern.

Eine Reaktion von 4-Hydroxybenzaldehyd und 2,4-Pentandion wurde ebenfalls unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben durchgeführt. Das isolierte Produkt war 3-(4-Hydroxy)phenylmethylen-2,4-pentandion (6) , siehe Abbildung 3.

Abbildung 3

Synthese von 3-(4-Hydroxy)phenylmethylen-2,4-pentandion (6).

2.1.2. Die Michael-Addition von Arylmethylen-β-Ketoestern und Arylmethylen-2,4-Pentandionen an 4-Hydroxycumarin

Der zweite Schritt der Reaktion ist eine Addition der erhaltenen Arylmethylen-β-Ketoester mit 4-Hydroxycumarin durch die Michael-Reaktion, unter Verwendung von Natriummethoxid oder Piperidin als basisches Mittel. Diese Reaktion kann wie in Abbildung 4 dargestellt werden.

Abbildung 4

Die Michael-Addition von 4-Hydroxycumarin und Arylmethylen-β-ketoestern.

Abbildung 5

Die Michael-Addition von 4-Hydroxycumarin und 3-(4-Hydroxy)phenylmethylen-2,4-pentandion (6).

2.2. Molekulares Docking

Die Wechselwirkung von HIV-1-Protease durch molekulares Docking mit einigen neu synthetisierten 4-Hydroxycumarinderivaten wurde untersucht. Zum Vergleich wurden experimentelle Daten über die Aktivität einiger 4-Hydroxycumarine herangezogen.

Vorläufiges molekulares Docking wurde auf der Grundlage bekannter 4-Hydroxycumarin-Derivate durchgeführt, die eine hemmende Wirkung auf die HIV-1-Protease haben (Tabelle 1). Das Gitter wird so gewählt, dass der Ligand, der zuvor an das Enzym gebunden wurde, überdimensioniert ist (in diesem Fall wurde eine Gittergröße von 7 Å gewählt).

Die 𝐺-Score- und E-Modell-Funktionswerte wurden mit dieser Methode ermittelt. Sie werden Scoring-Funktion genannt und sind abstrakte Äquivalente von Δ𝐺bind. Diese Funktionen berücksichtigen die freie Energie aufgrund von Lösungsmitteleffekten, Konformationsänderungen des Proteins und des Liganden, Wechselwirkungen zwischen Protein und Ligand (Wasserstoffbrückenbindungen, ionische Wechselwirkungen und Van-der-Waals-Kräfte), den Verlust an freier Energie beim Einfrieren der internen Rotation des Proteins und des Liganden, den Verlust an freier Energie in Form von Translations- und Rotationsenergie, der durch die Assoziation der beiden Moleküle verursacht wird, und die freie Energie aufgrund von Änderungen des Schwingungsmodus (wird in der Regel ignoriert). Wenn diese Werte für einen Liganden negativer sind, bedeutet dies, dass die Bindungsfähigkeit dieses Liganden besser ist. Wenn der Ligand in einer bestimmten Konformation Bindungsfähigkeit zeigt, zeigt das Programm dies als „gute Pose“ an.

Dieses Enzym besteht aus zwei Polypeptidketten und gehört zur Familie der Aspartylproteasen mit zwei Aspartatresten am unteren Ende des aktiven Zentrums. Wir haben die kristallografische Struktur der retroviralen HIV-1-Protease verwendet, die mit einem peptidomimetischen Inhibitor BEA369 aus der Protein Data Bank mit dem pdb-Code 1EBY gebunden ist.

Daraus lässt sich schließen, dass der Ligand (1) die stärkste Bindungsfähigkeit an die HIV-1-Protease besitzt. Die Ergebnisse des molekularen Dockings bestätigen die experimentellen Daten über den Liganden (1).

Für die Liganden (1)-(5) sind die 𝐺-Score- und E-Modell-Werte aus dem molekularen Docking für die Gruppe der getesteten Verbindungen in Tabelle 2 dargestellt.

Die Wechselwirkungen zwischen den untersuchten 4-Hydroxycumarinderivaten und den aktiven Stellen des Enzyms HIV-1-Protease werden durch Wasserstoffbrückenbindungen und van der Waals-Wechselwirkungen realisiert. Die aktivste Verbindung mit der besten Bindungsaktivität ist zum Beispiel die Verbindung (10), nach den Liganden (1)-(4) (basierend auf den Werten der Scoring-Funktionen). Diese Tatsache ist wahrscheinlich auf die Bildung von Wasserstoffbrücken zwischen dem Pyran-Sauerstoffatom, dem Lacton-Carbonyl-Sauerstoff und einer der Hydroxylgruppen (in Metaposition) zurückzuführen, die von der Seitenkette aus an den aromatischen Ring gebunden sind. Die van-der-Waals-Anziehungskräfte tragen ebenfalls zu einer guten Bindung bei. Nach dem Liganden (5) ist die Verbindung (7) am aktivsten. Für die Verbindung (7) gibt es zwei Wasserstoffbrückenbindungen unter Beteiligung des Pyran-Sauerstoffatoms, des Carbonyl-Sauerstoffatoms des Lactonrings und eines und der entsprechenden Proteinfragmente. Die Van-der-Waals-Wechselwirkungen, an denen wahrscheinlich die m-Nitrogruppe mit einem ihrer Sauerstoffatome beteiligt ist, sind für die Bindung von Bedeutung. Die Verbindung (7) scheint aktiver zu sein als die experimentellen Liganden.

2.3. Biologische Aktivität in Zellkultur (MT-4-Zellen)

Nachdem die Aktivität einiger 4-Hydroxycumarin-Derivate gegenüber isolierten HIV-PR in molekularen Docking-Experimenten nachgewiesen wurde, wäre es von Interesse, sie an HIV-1-infizierten MT-4-Zellen weiter zu testen. Die Bewertung der Anti-HIV-Wirkung erfolgte durch einen schnellen und empfindlichen In-vitro-Mikrotiter-Infektionstest, der auf der Quantifizierung der Zytolyse durch die Aufnahme des Vitalfarbstoffs (MTT) als Endpunkt der Infektion beruht. Zusätzlich wurde die Wirkung der Inhibitoren auf die Aktivität der endogenen reversen Transkriptase (RT) von HIV-1 III B-infizierten MT-4-Überständen als Marker für die Fähigkeit zur Blockierung der HIV-1-Replikation betrachtet. MT-4-Zellen wurden infiziert und 72-96 Stunden lang mit den einzelnen Inhibitoren inkubiert. Anschließend wurde die RT-Aktivität in den Zellüberständen gemäß den Richtlinien des HS-Lenti Kit-RT-Assays (Cavidi, Schweden) gemessen. Es wurde auch eine Studie zur direkten Wirkung der neu synthetisierten 4-Hydroxycumarine auf exogene rekombinante RT (rRT) durchgeführt. Außerdem wurden alle Verbindungen auf ihre Anti-HIV-1-PR-Aktivität getestet. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse des Mikrotiter-Infektionstests mit MTT und die Hemmung der HIV-1-PR-Aktivität. Die Experimente wurden für jede Verbindung in der maximal ungiftigen Konzentration (MNC) durchgeführt.

Zuallererst ist festzustellen, dass die Verbindungen (8), (7) und (12) eine höhere MNC aufweisen, was bedeutet, dass sie zytotoxischer sind als die anderen drei Verbindungen. Nur zwei von ihnen (10) und (7) hemmten die virale Replikation in MT-4-Zellen, wobei die durch (7) induzierte Hemmung bemerkenswert war (78%). Unter Verwendung von 10-fachen viralen Verdünnungen wurde die IC50 auf 0,01 nM festgelegt. Keine Verbindung zeigte eine Wirkung sowohl auf die endogene als auch auf die exogene RT. Dies bedeutet, dass RT nicht das Ziel der antiviralen Wirkung war. Wie durch molekulare Docking-Studien vorhergesagt, wurde die HIV-1-PR-Aktivität durch (7) um 24-25 % gehemmt (es wurden 5 separate Bewertungen durchgeführt). Die für (7) festgestellte Diskordanz zwischen den Daten zur Infektiositätshemmung (ca. 75 %) und der Proteaseaktivität (25 %) könnte durch eine andere Aktivität, z. B. eine Anti-Integrase-Aktivität, erklärt werden. Es ist bekannt, dass einige 4-Hydroxycumarinderivate Integraseinhibitoren sind.

Die in dieser Arbeit beschriebenen Experimente erweitern die früher berichteten, dass 4-Hydroxycumarin-Derivate als neuartige nicht-peptidische PIs dienen könnten. Ähnlich wie Tipranavir und Darunavir könnten sie bei Patienten mit entwickelter Resistenz gegen peptidische PIs wirksam sein. Insbesondere (7) könnte als Pharmakophor für die Synthese neuer, aktiverer Derivate gegen die HIV-1-Protease verwendet werden.

3. schlussfolgerung

Sechs 4-Hydroxycumarin-Verbindungen wurden durch eine zweistufige Synthese hergestellt. Der erste Schritt ist die Knoevenagel-Reaktion zwischen aromatischen Aldehyden und Ethylacetoacetat oder Acetylaceton. Der zweite Schritt ist die Michael-Addition des erhaltenen Arylmethylen-β-Ketoesters oder Arylmethylen-2,4-Pentandions mit 4-Hydroxycumarin. Die Produkte werden durch 1H NMR, EI-MS, FTIR und Elementanalyse identifiziert und charakterisiert.

Die Untersuchung ihrer Bindungsaktivität an HIV-1 PR wurde durch molekulares Docking durchgeführt. Dazu wurde der Kristall HIV-1 PR verwendet, der an den peptidomimetischen Inhibitor BEA369 gebunden ist. Die höchste Bindungsaktivität zeigt Verbindung (10), entsprechend den experimentellen Liganden (1), (2), (3) und (4) und Verbindung (7), entsprechend Ligand 5. Diese Tatsache ist wahrscheinlich auf die Bildung von Wasserstoffbrücken zwischen dem Sauerstoffatom des Pyrans, dem Carbonylsauerstoff des Lactons und einer der Hydroxylgruppen (in der Metaposition) zurückzuführen, die von der Seitenkette aus an den aromatischen Ring gebunden sind. Die Van-der-Waals-Anziehungskräfte tragen ebenfalls zu einer guten Bindung bei.

Alle sechs Verbindungen wurden auf ihre Anti-HIV-1-PR-Aktivität in MT4-Zellen getestet, die mit HIV-1 infiziert waren. Das Überleben der Zellen wurde mit dem MTT-Test bewertet und auch der Prozentsatz der HIV-1-PR-Hemmung wurde gemessen. Die höchste Hemmung von HIV-1 PR (25 %) und die höchste Überlebensrate von MT4-Zellen (78 %) wurden von Verbindung (7) nachgewiesen. Verbindung (7) könnte als Pharmakophor für die Synthese neuer, aktiverer Derivate gegen HIV-1 PR verwendet werden.

4. Experimenteller Teil

4.1. Synthese von 4-Hydroxycumarin-Derivaten

4.1.1. Materialien und Methoden

Alle Ausgangsmaterialien wurden von Merck, Sigma-Aldrich und Fluka bezogen. Sie werden ohne weitere Aufreinigung verwendet. Die Schmelzpunkte wurden in offenen Kapillarröhrchen auf einem Büchi 535 Schmelzpunktapparat gemessen. Die IR-Spektren wurden mit dem Shimadzu FT-IR 8101 M Spektrometer in Nujol aufgenommen, und die Frequenzen sind in cm-1 angegeben. Die 1H-NMR-Spektren wurden mit Brucker 250 MHz in DMSO-d6 oder Aceton unter Verwendung von TMS als internem Standard aufgenommen (chemische Verschiebungen werden in ppm-Einheiten angegeben, Kopplungskonstanten (𝐽) in Hz). Die Abkürzungen lauten wie folgt: s: Singulett, d: Dublett, dd: Doppeldublett, dq: Doppelquartett, dqui: Doppelquintett, t: Triplett und m: Multiplett.

Die Massenspektralanalyse wurde durch Elektronenionisation am Massenspektrometer Hewlett-Packard 5973 bei 70 eV durchgeführt.

4.1.2. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von Arylmethylen-β-Ketoestern

Aromatischer Aldehyd und Ethylacetoacetat in äquimolaren Mengen werden in einem Rundkolben gemischt. Dem Reaktionsgemisch werden auch Piperidin (0,03 mol) und Eisessig (0,04 mol) zugesetzt. Das Gemisch wird 90 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 20 mL Ether und/oder 150 mL destilliertem Wasser zum Reaktionsgemisch bilden sich Kristalle mit unterschiedlichen Farben. Diese Kristalle werden filtriert und gewaschen. Anschließend werden sie bei Raumtemperatur getrocknet und in geeigneten Lösungsmitteln – hauptsächlich Alkoholen (Ethanol, Propanol und 2-Propanol) und Wasser – umkristallisiert.

4.1.3. Verfahren zur Herstellung von 3-(4-Hydroxy)-Phenylmethylen-2,4-Pentandion (6)

4-Hydroxybenzaldehyd (3,66 g, 0,03 mol) und Acetylaceton (5,14 mL, 0,05 mol) werden im Rundkolben gemischt. Piperidin (0,03 mol) und Eisessig (0,04 mol) werden dem Reaktionsgemisch ebenfalls zugesetzt. Das Gemisch wird 120 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach werden 150 mL destilliertes Wasser zum Reaktionsgemisch zugegeben. Es bilden sich Kristalle mit unterschiedlicher Farbe. Diese Kristalle werden abfiltriert und gewaschen. Anschließend werden sie bei Raumtemperatur getrocknet und in Methylenchlorid umkristallisiert.

4.1.4. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von Kondensationsprodukten mit 4-Hydroxycumarin

Der in der vorangegangenen Reaktion erhaltene Arylyden-β-ketoester und 4-Hydroxycumarin werden in äquimolaren Mengen in 25-30 mL Methanol (als Lösungsmittel verwendet) gemischt. Natriummethoxid (0,003 mol) als basisches Mittel wird ebenfalls zu den Reagenzien gegeben. Das Reaktionsgemisch wird gekocht und 60 Stunden lang unter Rückfluss gerührt. Die Reaktion wird durch TLC kontrolliert (Hexan : Aceton = 2 : 1 oder Hexan : Aceton : Chloroform : Methanol = 5 : 3 : 2 : 1). Wenn die Mengen der Reagenzien verbraucht sind, wird das Erhitzen eingestellt. Der Rückstand aus der Reaktionsmischung wurde abfiltriert und mit heißem Wasser gewaschen, um das nicht umgesetzte 4-Hydroxicumarin zu entfernen. Danach wird der Rückstand bei Raumtemperatur getrocknet und in einem geeigneten Lösungsmittel (Methanol, Ethanol oder 2-Propanol) umkristallisiert.

4.1.5. Die Michael-Addition zwischen 3-(4-Hydroxybenzyliden)-2,4-Pentandion (SS-23) und 4-Hydroxycumari

3-(4-Hydroxybenzyliden)-2,4-Pentandion (1,02 g, 0,005 mol) und 4-Hydroxycumarin (0,81 g, 0,005 mol) werden in leichtem Überschuss an 4-Hydroxycumarin in 15-25 mL Methanol gemischt. Piperidin (0,003 mol) als basisches Mittel wird ebenfalls zu den Reagenzien gegeben. Das Reaktionsgemisch wird gekocht und 60 Stunden lang unter Rückfluss gerührt. Die Reaktion wird mittels TLC kontrolliert (Hexan : Chloroform : Essigsäure = 10 : 10 : 4, Hexan : Chloroform : Essigsäure = 10 : 10 : 2, Hexan : Aceton = 2 : 1). Wenn die Mengen der Reagenzien erschöpft sind, wird das Erhitzen beendet. Der Rückstand aus dem Reaktionsgemisch wird abfiltriert und mit heißem Wasser gewaschen, um das nicht umgesetzte 4-Hydroxicumarin zu entfernen. Danach wird der Rückstand bei Raumtemperatur getrocknet und in Aceton umkristallisiert.

4.2. Molekulares Docking

Alle molekularen Docking-Berechnungen wurden mit dem Programm Maestro Macromodel Glide aus dem Schrodinger-Paket durchgeführt. Alle Strukturen (experimentell getestete und neue) wurden mit dem Programm Macromodel unter Verwendung des Kraftfelds OPLS2005 und 5000 Iterationen minimiert. Die Röntgenstruktur des Enzyms HIV-1-Protease, zusammen mit dem Inhibitor BEA369, stammt aus der Protein Data Bank mit dem PDB-Code 1EBY.

4.3. Zelllinien und Viren

MT-4-eine humane lymphoblastoide Suspensionszelllinie, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Gianfranco Pancino- Institut Pasteur, (Unite de Regulation des Infections Retrovirales, Paris, Frankreich) stellt ein klassisches Modell für experimentelle produktive Infektionen mit dem HIV-1 III B-Stamm dar und wird als Routineziel für die Untersuchung der Wirkung von mutmaßlichen HIV-Inhibitoren in Zellkulturen verwendet.

Als Quelle für HIV-1 wurden Überstände der H9/HTLV III B-Linie – ein Geschenk von Dr. R. Gallo (NIH, USA) – verwendet. Die Überstände wurden gesammelt und zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen, und es wurden Virusbestände mit bekanntem p24-Antigengehalt (460 pg/mL, Murex HIV Antigen mAB Test), RT-Aktivität (565,3 pg RT/mL, HS-Lenti RT Activity Kit, Cavidi, Schweden) und Infektiosität (2 × 106 infektiöse Virionen/mL, Mikrotiter-Infektionstest) hergestellt. MT-4 und H9/HTLV III B-Zellen wurden in RPMI 1640, ergänzt mit 10% FCS (Invitrogen), gezüchtet.

4.4. Zytotoxizitätstests und antivirale Assays in Zellkultur

Die untersuchten Verbindungen wurden zunächst in DMSO gelöst und dann in Zellwachstumsmedium ohne fötales Serum verdünnt. Alle Lösungen wurden ex tempore hergestellt.

Die folgenden Parameter wurden untersucht: die zytotoxische Konzentration 50-CC50 (die Konzentration, die den Tod von 50 % der MT-2-Zellen verhindert), die maximale ungiftige Konzentration-MNC und die Hemmkonzentration 50-IC50 (die Konzentration, die die virale Replikation zu 50 % hemmt), soweit möglich. CC50 und MNC wurden mit dem MTT-Aufnahmetest ermittelt. Die IC50 wurde an MT-4-Zellen mit Hilfe eines Mikrotiter-Infektionstests untersucht, wobei der Schutz der Zellen vor der zytopathischen Wirkung von HIV mit dem MTT-Test gemessen wurde. Die Experimente unter den Bedingungen einer akuten Infektion wurden in 96-Well-Mikroplatten mit 6-8 Parallelversuchen/Experiment durchgeführt. Bei jedem Experiment wurden Zellkontrollen (MT-4-Zellen nur mit Medium) und Viruskontrollen (virusinfizierte MT-4-Zellen) durchgeführt. Für die Antivirus-Assays wurde HIV in jede Vertiefung gegeben, um eine Infektionsmultiplikation von 0,1 zu erreichen, außer bei den Zellkontrollen. Die Anheftung des Virus wurde eine Stunde lang bei 37°C/5% CO2 zugelassen. Die Platten wurden 72-96 Stunden bei 37°C/5% CO2 bebrütet. Danach wurde der MTT-Test wie beschrieben durchgeführt, und die Absorption der lebensfähigen Zellen wurde kolorimetrisch bei A540 nm gemessen. Für alle Experimente wurde der Mittelwert jeder Säule berechnet (nur wenn die Werte in A540 nicht um ±10% voneinander abwichen). Für antivirale Assays wurden die Mittelwerte der Versuchs- und Kontrollreihen verglichen und der Prozentsatz der geschützten Zellen (Zellüberleben) unter der entsprechenden Konzentration der Substanz gegen die Konzentration der Substanz aufgetragen, um die IC50 zu erhalten. Das Zellüberleben (% des Zellschutzes) wurde nach folgender Formel berechnet: =%ZellschutzA540𝑋-A540ControlHIVA540CellControl-A540ControlHIV×100,(1) wobei 𝑋 der Mittelwert von A540 von HIV-infizierten Zellen ist, die mit der entsprechenden Konzentration der untersuchten Substanz behandelt wurden; control HIV ist der Mittelwert von A540 von HIV-infizierten Zellen ohne Zusatz einer Substanz; cell control ist der Mittelwert von A540 von nicht infizierten und nicht mit Inhibitor behandelten Zellen.

Als Referenzsubstanz wurden ABC (Abacavir bekannter Nukleosid-Reverse-Transkriptase-Inhibitor-NRTI) und Pepstatin verwendet.

4.4.1. Endogene RT-Aktivität und direkte Wirkung der Verbindungen auf die RT

Es wurde mit dem HS-Lenti Kit-RT-Assay (Cavidi, Schweden) getestet. Der Kit enthält rekombinante RT (rRT) als Standard, der eine Quantifizierung der RT ermöglicht. Für den endogenen RT-Assay wurden Überstände von HIV-1-infizierten/uninfizierten MT-4-Zellen nach Inkubation mit/ohne Verbindungen gemäß den Richtlinien des Herstellers getestet. Die RT-Aktivität im Überstand wurde anhand des HIV-1 rRT-Standardsatzes in jedem Kit berechnet (in pg/mL). Die direkte Wirkung der Verbindungen auf die rRT-Aktivität wurde mit demselben Kit gemessen, um RT als Ziel der antiviralen Wirkung nachzuweisen. Entsprechende Stufenverdünnungen des Inhibitors wurden in Kontrollpuffer hergestellt und dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Die Reaktion wurde 3 Stunden lang bei 33°C durchgeführt. Die RT-Aktivität der Standardverdünnungen wurde mit derjenigen verglichen, bei der die Verbindungen hinzugefügt wurden, oder mit den Kontrollen (bei denen nur die Inkubationsmischung ohne Verbindungen hinzugefügt wurde).

4.4.2. Nachweis der Antiprotease-Aktivität durch Tests mit nativer viraler PR

Eine zuvor von Broglia et al. (2006) beschriebene Methode zum Nachweis rekombinanter Protease-Aktivität wurde modifiziert, um native virale Protease zu verwenden. Als Quelle der nativen HIV-1-Protease wurde wiederum eine Suspension eines konzentrierten Virusbestandes (50x) aus chronisch infizierten H9/HTLV IIIB-Zellüberständen verwendet. Die Lyse der Viruspartikel und die Freisetzung des aktiven Enzyms (Protease) erfolgte unter Verwendung von Aufschlusspuffer (Lysepuffer), der 2,5 % Triton X-100 in Phosphatpuffer enthält. Die Konzentration der virushaltigen Gewebekulturflüssigkeit erfolgte durch Ultrazentrifugation in Biofuge Stratos, Heraeus, für 1 Stunde bei 4°C und 35000 U/min. Das Pellet wurde resuspendiert, um ein 50-faches Konzentrat in Disruptionspuffer zu erhalten.

Das folgende Reaktionsgemisch wurde für jedes Experiment vorbereitet: 1000 𝜇L Phosphatpuffer (20 mM, pH 6.0); 20 𝜇L HIV-Protease-Substrat III (1 𝜇g/mL, 760 𝜇M; Bachem, Schweiz) in DMSO, ex tempore hergestellt; 20 μL Enzym (HIV-Stamm), entnommen aus einer Lösung, die 25 𝜇L Aufschlusspuffer (Lysepuffer) + 100 μL HIV-Stamm enthielt, inkubiert 40 min bei 37°C vor dem Experiment.

Die HIV-1-PR-Aktivität wurde durch direkte spektrophotometrische Messung der Substratausnutzung der Enzymreaktion bei 300 nm, bei Raumtemperatur und 1 cm Schichtdicke, mit einem T80 + UV-Vis-Spektrophotometer (PG Instruments) gemessen. Die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit (V0) wurde durch Variation der Enzymaktivität (virale Konzentration) auf 0,0020-0,0030 ΔAbs/min eingestellt. Die getestete Verbindung und der Referenzinhibitor (hier verwendetes Pepstatin) wurden dem Reaktionsgemisch vor dem Enzym zugesetzt, um das Screening auf hemmende Wirkung durchzuführen. IC50 wurde definiert als die Konzentration der getesteten Verbindung, die die Geschwindigkeit der Reaktion um 50 % der ursprünglichen Geschwindigkeit ohne getestete (Referenz-)Verbindung verringert.