U.S. Food and Drug Administration

Juli 2000

Toxikologische Grundsätze für die Sicherheitsbewertung von LebensmittelzutatenRedbook 2000Kapitel IV.C.1.d. Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test

Zurück zum Inhaltsverzeichnis des Redbook 2000

I. Einleitung

Mikrokerne sind zytoplasmatische, chromatinhaltige Körper, die gebildet werden, wenn azentrische Chromosomenfragmente oder Chromosomen während der Anaphase zurückbleiben und während der Zellteilung nicht in die Kerne der Tochterzellen eingebaut werden können. Da genetische Schäden, die zu Chromosomenbrüchen, strukturell abnormalen Chromosomen oder Spindelanomalien führen, zur Bildung von Mikrokernen führen, dient das Auftreten von Mikrokernen als Index für diese Arten von Schäden. Es wurde festgestellt, dass im Wesentlichen alle Agenzien, die Doppelstrang-Chromosomenbrüche (Klastogene) verursachen, Mikronuklei hervorrufen. Da die Zählung von Mikrokernen viel schneller und technisch weniger anspruchsvoll ist als die Auswertung von Chromosomenaberrationen und weil Mikrokerne aus zwei wichtigen Arten genetischer Schäden entstehen (Klastogenese und Spindelbruch), wurde der Mikrokern-Assay in großem Umfang zum Screening auf Chemikalien verwendet, die diese Arten von Schäden verursachen.

Dieser Leitfaden befasst sich mit dem am weitesten verbreiteten In-vivo-Mikrokern-Assay: dem Säugetier-Erythrozyten-Mikronukleus-Assay. Dieser In-vivo-Mikrokerntest dient dem Nachweis von Schäden, die durch die Prüfsubstanz an den Chromosomen oder dem mitotischen Apparat von Erythroblasten verursacht werden, durch Analyse von Erythrozyten, die aus Knochenmark und/oder peripheren Blutzellen von Tieren, in der Regel Nagern, entnommen werden.

Der Zweck des Mikronukleustests besteht darin, Substanzen zu identifizieren, die zytogenetische Schäden verursachen, die zur Bildung von Mikronuklei führen, die zurückgebliebene Chromosomenfragmente oder ganze Chromosomen enthalten.

Wenn sich ein Erythroblast aus dem Knochenmark zu einem polychromatischen Erythrozyten entwickelt, wird der Hauptkern extrudiert; gebildete Mikronuklei können im ansonsten entkernten Zytoplasma zurückbleiben. Die Visualisierung von Mikrokernen wird bei diesen Zellen durch spezifische Färbetechniken und durch das Fehlen eines Hauptkerns erleichtert. Eine Zunahme der Häufigkeit mikrokernhaltiger polychromatischer Erythrozyten in behandelten Tieren ist ein Hinweis auf eine induzierte Chromosomenschädigung.

II. Definitionen

Das Zentromer (Kinetochore) ist ein Bereich eines Chromosoms, mit dem während der Zellteilung Spindelfasern verbunden sind, die eine geordnete Bewegung der Tochterchromosomen zu den Polen der Tochterzellen ermöglichen.

Mikrokerne sind kleine, von den Hauptkernen der Zellen getrennte und zusätzliche Kerne, die während der Telophase der Mitose (Meiose) aus zurückgebliebenen Chromosomenfragmenten oder ganzen Chromosomen entstehen.

Normochromatischer Erythrozyt ist ein reifer Erythrozyt, dem Ribosomen fehlen und der von unreifen, polychromatischen Erythrozyten durch für Ribosomen selektive Färbungen unterschieden werden kann.

Polychromatischer Erythrozyt ist ein unreifer Erythrozyt in einem Zwischenstadium der Entwicklung, der noch Ribosomen enthält und daher von reifen, normochromatischen Erythrozyten durch Färbungen, die für Ribosomen selektiv sind, unterschieden werden kann.

III. Erste Überlegungen

Das Knochenmark von Nagetieren wird routinemäßig für diesen Test verwendet, da in diesem Gewebe polychromatische Erythrozyten produziert werden. Die Messung mikrokernhaltiger unreifer (polychromatischer) Erythrozyten im peripheren Blut ist bei allen Spezies, bei denen die Unfähigkeit der Milz, mikrokernhaltige Erythrozyten zu entfernen, nachgewiesen wurde oder die eine ausreichende Empfindlichkeit zum Nachweis von Agenzien, die strukturelle und/oder numerische Chromosomenaberrationen verursachen, gezeigt haben, ebenfalls akzeptabel. Mikrokerne können anhand einer Reihe von Kriterien unterschieden werden. Dazu gehört die Identifizierung des Vorhandenseins oder Fehlens eines Kinetochors oder zentromerischer DNA in den Mikrokernen. Die Häufigkeit der mikrokernhaltigen unreifen (polychromen) Erythrozyten ist der wichtigste Endpunkt. Die Anzahl der reifen (normochromatischen) Erythrozyten im peripheren Blut, die unter einer gegebenen Anzahl reifer Erythrozyten Mikrokerne enthalten, kann ebenfalls als Endpunkt des Tests verwendet werden, wenn die Tiere kontinuierlich über einen Zeitraum behandelt werden, der die Lebensdauer der Erythrozyten bei der betreffenden Tierart übersteigt (z. B. 4 Wochen bei der Maus), vorausgesetzt, dass bei der betreffenden Tierart/dem betreffenden Stamm keine signifikante Selektion in der Milz gegen mikrokernhaltige Erythrozyten stattfindet. Die Folgen einer eventuellen Milzselektion sollten in vollem Umfang berücksichtigt werden.

Dieser In-vivo-Mikrokerntest an Säugetieren ist für die Bewertung der mutagenen Gefahr besonders wichtig, da er die Berücksichtigung von Faktoren des In-vivo-Stoffwechsels, der Pharmakokinetik und der DNA-Reparaturprozesse ermöglicht, auch wenn diese je nach Tierart, Gewebe und genetischen Endpunkten unterschiedlich sein können. Ein In-vivo-Test ist auch für die weitere Untersuchung einer mutagenen Wirkung nützlich, die mit einem In-vitro-System nachgewiesen wurde.

Wenn es Hinweise darauf gibt, dass die Prüfsubstanz oder ein reaktiver Metabolit das Zielgewebe nicht erreicht, ist es nicht angebracht, diesen Test zu verwenden.

IV. Prinzip der Prüfmethode

Tiere werden der Prüfsubstanz auf einem geeigneten Weg ausgesetzt. Wird Knochenmark verwendet, so werden die Tiere zu geeigneten Zeitpunkten nach der Behandlung getötet, das Knochenmark entnommen, Präparate hergestellt und gefärbt.(16),(17),(18),(26),(32),(41) Bei Verwendung von peripherem Blut wird das Blut zu geeigneten Zeitpunkten nach der Behandlung entnommen, es werden Ausstrichpräparate hergestellt und gefärbt.(4),(5),(14),(16),(27),(28),(29),(32) Die Präparate werden auf das Vorhandensein von Mikrokernen untersucht.

V. Beschreibung der Methode

A. Präparate

1. Auswahl der Tierspezies

In der Vergangenheit wurden routinemäßig Mäuse oder Ratten für diesen Test verwendet. Ist das Knochenmark das zu untersuchende Gewebe, kann jede geeignete Säugetierart verwendet werden (siehe Abschnitt III.). Wie bei jeder toxikologischen Studie sollte die Auswahl der geeigneten Tierart begründet werden. Wenn peripheres Blut verwendet wird, werden Mäuse empfohlen. Es kann jedoch jede geeignete Säugetierart verwendet werden, sofern es sich um eine Spezies handelt, bei der die Milz keine mikrokernhaltigen Erythrozyten ausscheidet, oder um eine Spezies, die eine angemessene Empfindlichkeit für den Nachweis von Stoffen gezeigt hat, die strukturelle und/oder numerische Chromosomenaberrationen verursachen. Es sollten gängige Laborstämme junger gesunder Tiere verwendet werden. Zu Beginn der Studie sollten die Gewichtsschwankungen der Tiere minimal sein und ±20 % des Durchschnittsgewichts jedes Geschlechts nicht überschreiten.

2. Unterbringungs- und Fütterungsbedingungen

Die Temperatur im Versuchstierraum sollte für die verwendete Spezies angemessen sein; bei Mäusen und Ratten sollte sie 22°C (±3°C) betragen. Die relative Luftfeuchtigkeit sollte mindestens 30 % und vorzugsweise nicht mehr als 70 % betragen, außer bei der Reinigung des Raumes, wobei ein Wert von 50-60 % angestrebt werden sollte. Die Beleuchtung sollte künstlich sein, wobei die Reihenfolge 12 Stunden Licht, 12 Stunden Dunkelheit lautet. Für die Fütterung kann herkömmliches Laborfutter verwendet werden, und es steht unbegrenzt Trinkwasser zur Verfügung. Die Wahl des Futters kann durch die Notwendigkeit beeinflusst werden, eine geeignete Beimischung einer Prüfsubstanz zu gewährleisten, wenn diese auf diesem Wege verabreicht wird. Die Tiere können einzeln oder in kleinen Gruppen gleichen Geschlechts untergebracht werden.

3. Vorbereitung der Tiere

Gesunde junge erwachsene Tiere sollten nach dem Zufallsprinzip den Kontroll- und Behandlungsgruppen zugeordnet werden. Die Tiere sollten eindeutig identifiziert werden. Die Tiere sollten mindestens fünf Tage lang an die Laborbedingungen akklimatisiert werden. Die Käfige sollten so angeordnet sein, daß mögliche Auswirkungen der Käfiganordnung minimiert werden.

4. Vorbereitung der Dosen

Feste Prüfsubstanzen sollten in geeigneten Lösungsmitteln oder Vehikeln gelöst oder suspendiert und gegebenenfalls vor der Verabreichung an die Tiere verdünnt werden. Flüssige Prüfsubstanzen können direkt dosiert oder vor der Verabreichung verdünnt werden. Es sollten frische Zubereitungen der Prüfsubstanz verwendet werden, es sei denn, die Stabilitätsdaten belegen die Zulässigkeit einer Lagerung.

B. Prüfbedingungen

1. Lösungsmittel/Vehikel

Das Lösungsmittel/Vehikel sollte bei den verwendeten Dosen keine toxischen Wirkungen hervorrufen und sollte nicht im Verdacht stehen, mit der Prüfsubstanz chemisch zu reagieren. Wenn andere als die üblicherweise verwendeten Lösungsmittel/Vehikel verwendet werden, sollte ihre Verwendung mit Referenzdaten belegt werden, die ihre Verträglichkeit mit der Prüfsubstanz und den Tieren belegen. Es wird empfohlen, gegebenenfalls zuerst die Verwendung eines wässrigen Lösungsmittels/Vehikels in Erwägung zu ziehen.

2. Kontrollen

Gleichzeitige Positiv- und Negativkontrollen (Lösungsmittel/Vehikel) sollten in der Regel für jedes Geschlecht bei jedem mit Nagetieren durchgeführten Test vorgesehen werden. Wird der Mikronukleus-Assay jedoch als Teil einer allgemeinen Toxizitätsstudie gemäß den GLP-Richtlinien durchgeführt, so wird die Überprüfung der angemessenen Dosierung durch eine chemische Analyse vorgenommen. In solchen Fällen ist eine gleichzeitige Behandlung der Tiere mit einer Positivkontrolle möglicherweise nicht erforderlich, und die Kontrolle der Färbe- und Auswerteverfahren kann durch die Einbeziehung geeigneter Referenzproben erfolgen, die zuvor von Tieren gewonnen wurden, die nicht Teil des aktuellen Versuchs sind. Bei Studien mit höheren Tierarten wie Primaten oder Hunden kann auf Positivkontrollen verzichtet werden, sofern das Prüflabor zuvor eine akzeptable Reaktion auf positive Kontrollsubstanzen der verwendeten Tierart nachgewiesen hat. In allen Fällen sind gleichzeitige Negativkontrollen ein obligatorischer Bestandteil der Studie. Abgesehen von der Behandlung mit der Prüfsubstanz sollten die Tiere in den Kontrollgruppen auf die gleiche Weise behandelt werden wie die Tiere in den Behandlungsgruppen.

Positivkontrollen sollten in vivo Mikrokerne in Expositionshöhen erzeugen, die eine nachweisbare, statistisch signifikante Zunahme gegenüber dem Hintergrund erwarten lassen. Die Dosen der Positivkontrollen sollten so gewählt werden, dass die Auswirkungen deutlich sind, aber dem Leser die Identität der kodierten Objektträger nicht sofort offenbaren. Es ist akzeptabel, dass die Positivkontrolle auf einem anderen Weg als die Prüfsubstanz verabreicht und nur zu einem einzigen Zeitpunkt beprobt wird. Darüber hinaus kann die Verwendung von Positivkontrollchemikalien, die mit der chemischen Klasse verwandt sind, in Betracht gezogen werden, sofern sie verfügbar sind. Beispiele für Positivkontrollsubstanzen sind:

Negative Kontrolltiere, die nur mit Lösungsmittel oder Vehikel behandelt wurden und ansonsten die gleiche Behandlung wie die Behandlungsgruppen erfahren haben, sollten bei jeder Probenahme mit einbezogen werden, es sei denn, dass es unter bestimmten Umständen möglich ist, ein Tier als eigene Kontrolle zu verwenden, indem Proben vor und nach der Behandlung verglichen werden. Wird für die Negativkontrollen eine Einzelbeprobung durchgeführt, so sollte der gewählte Zeitpunkt der Probenahme begründet werden. Darüber hinaus sollten auch unbehandelte Kontrollen verwendet werden, es sei denn, es liegen a) Daten des Prüflabors oder b) historische oder veröffentlichte Kontrolldaten vor, die belegen, dass das gewählte Lösungsmittel/Vehikel keine schädlichen oder mutagenen Wirkungen hervorruft.

Wird peripheres Blut verwendet, kann auch eine Vorbehandlungsprobe als gleichzeitige Negativkontrolle akzeptiert werden, allerdings nur bei kurzen peripheren Blutstudien (z. B., 1-3 Behandlungen), wenn die resultierenden Daten im erwarteten Bereich für die historische Kontrolle liegen und wenn das Fehlen eines Lösungsmitteleffekts nachgewiesen wurde.

VI. Vorgehensweise bei Ratten und Mäusen

Die folgenden Abschnitte enthalten Leitlinien für die Vorgehensweise bei Mäusen und Ratten, den in diesem Test am häufigsten verwendeten Arten.

A. Anzahl und Geschlecht der Tiere

Jede Behandlungs- und Kontrollgruppe sollte mindestens 5 analysierbare Tiere pro Geschlecht umfassen.(12) Wenn zum Zeitpunkt der Studie Daten aus Studien mit derselben Tierart und demselben Expositionsweg vorliegen, die zeigen, dass es keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Geschlechtern in der Toxizität gibt, ist die Prüfung an einem einzigen Geschlecht ausreichend.

B. Behandlungsschema

Es können verschiedene Behandlungsschemata (d. h. 1, 2 oder mehr Behandlungen im Abstand von 24 Stunden) empfohlen werden. Proben aus erweiterten Dosierungsschemata sind akzeptabel, solange eine positive Wirkung für diese Studie nachgewiesen wurde oder, bei einer negativen Studie, solange die Toxizität nachgewiesen wurde oder die Grenzdosis (siehe Abschnitt „D“, unten) verwendet wurde und die Dosierung bis zum Zeitpunkt der Probenahme fortgesetzt wurde. Dies beruht auf Studien, die gezeigt haben, dass wiederholte Expositionen von Mäusen und Ratten von bis zu subchronischer Dauer Wirkungen in einem ähnlichen Ausmaß hervorrufen, wie sie mit dem herkömmlichen akuten Test erzielt werden.(1),(2),(8),(11),(19),(21),(22),(23),(25),(29),(37),(38),(44),(48),(50) Da jedoch die Besorgnis besteht, dass die Empfindlichkeit in längerfristigen Studien aufgrund des Nichterreichens einer echten MTD oder aufgrund einer möglichen Adaptation verringert werden könnte, wird derzeit davon ausgegangen, dass die Behandlungsdauer auf vier Wochen begrenzt werden sollte, bis die Empfindlichkeit des Assays bei längeren Behandlungen bestätigt wird.(12)

Die Prüfsubstanzen können auch in Form einer geteilten Dosis verabreicht werden, d. h., zwei oder mehr Behandlungen am selben Tag im Abstand von nur wenigen Stunden, um die Verabreichung einer großen Menge an Material zu erleichtern oder um Schwankungen der Blutspiegel des Prüfgegenstands zu minimieren.

Zwei Arten, wie der Test durchgeführt werden kann, sind:

• Tiere werden einmal oder zweimal im Abstand von nicht mehr als 24 Stunden mit der Prüfsubstanz behandelt. Knochenmarksproben werden mindestens zweimal zwischen 24 und 48 Stunden nach der letzten Dosis entnommen, mit angemessenen Abständen zwischen den Proben. Die Verwendung von Probenahmezeiten, die früher als 24 Stunden nach der Behandlung liegen, sollte begründet werden. Periphere Blutproben werden mindestens zweimal zwischen 36 und 72 Stunden nach der letzten Behandlung entnommen, wobei der Abstand zwischen den Proben angemessen sein muss. Wird bei einem Probenahmezeitpunkt eine positive Reaktion festgestellt, sind keine weiteren Probenahmen erforderlich.
• Wenn drei oder mehr Behandlungen pro Tag durchgeführt werden (z. B. drei oder mehr Behandlungen im Abstand von 24 Stunden), können die Proben für das Knochenmark einmal spätestens 24 Stunden nach der letzten Behandlung und für das periphere Blut einmal spätestens 40 Stunden nach der letzten Behandlung entnommen werden.(12), (20)

Wenn dies sachdienlich und wissenschaftlich gerechtfertigt ist, können zusätzliche Probenahmezeiten verwendet werden.

C. Dosisstufen

Wenn eine Studie zur Ermittlung des Dosisbereichs durchgeführt wird, weil keine geeigneten Daten verfügbar sind, sollte sie im selben Labor unter Verwendung derselben Tierart, desselben Stammes, Geschlechts und desselben Behandlungsschemas durchgeführt werden, die in der Hauptstudie verwendet werden.(7) Wenn Toxizität vorliegt, sollten drei Dosisstufen für die erste Probenahmezeit verwendet werden. Diese Dosisstufen sollten einen Bereich von deutlicher Toxizität bis zu geringer oder keiner Toxizität abdecken. Bei der späteren Probenahme muss nur noch die höchste Dosis verwendet werden. Die höchste Dosis ist definiert als die Dosis, die Anzeichen von Toxizität hervorruft, so dass bei einer höheren Dosis auf der Grundlage desselben Dosierungsschemas mit einer tödlichen Wirkung zu rechnen wäre. Stoffe mit spezifischen biologischen Aktivitäten bei niedrigen, nicht toxischen Dosen (wie Hormone und Mitogene) können Ausnahmen von den Kriterien für die Festlegung der Dosis darstellen und sollten von Fall zu Fall bewertet werden. Die höchste Dosis kann auch als eine Dosis definiert werden, die Anzeichen für eine Toxizität des Knochenmarks hervorruft (z. B. eine Verringerung des Anteils unreifer Erythrozyten an der Gesamtzahl der Erythrozyten im Knochenmark oder peripheren Blut).

D. Grenzwerttest

Wenn eine einmalige Behandlung mit einer Dosis von mindestens 2000 mg/kg Körpergewicht oder zwei Behandlungen am gleichen Tag keine beobachtbaren toxischen Wirkungen ergeben und wenn aufgrund von Daten über strukturell verwandte Substanzen keine Gentoxizität zu erwarten ist, ist eine vollständige Studie mit drei Dosisstufen möglicherweise nicht erforderlich. Bei Studien von längerer Dauer beträgt die Grenzdosis 2000 mg/kg/Körpergewicht/Tag bei einer Behandlung von bis zu 14 Tagen und 1000 mg/kg/Körpergewicht/Tag bei einer Behandlung von mehr als 14 Tagen. Die zu erwartende Exposition des Menschen kann es erforderlich machen, eine höhere Dosis für den Grenzwerttest zu verwenden.

E. Verabreichung der Dosen

Die Prüfsubstanz wird in der Regel durch Schlucken über eine Magensonde oder eine geeignete Intubationskanüle oder durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Andere Verabreichungswege können zulässig sein, wenn sie begründet werden können. Die maximale Flüssigkeitsmenge, die mit der Magensonde oder durch Injektion verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Das Volumen sollte 2 ml/100 g Körpergewicht nicht überschreiten. Die Verwendung eines höheren Volumens muss begründet werden. Mit Ausnahme von reizenden oder ätzenden Substanzen, die normalerweise bei höheren Konzentrationen verstärkte Wirkungen zeigen, sollte die Variabilität des Prüfvolumens durch Anpassung der Konzentration minimiert werden, um ein konstantes Volumen in allen Dosisstufen zu gewährleisten.

F. Knochenmark/Blutpräparation

Knochenmarkzellen werden in der Regel unmittelbar nach der Tötung aus den Oberschenkeln oder Schienbeinen gewonnen. In der Regel werden die Zellen aus den Oberschenkeln oder Schienbeinen entnommen, aufbereitet und nach etablierten Methoden gefärbt. Das periphere Blut wird aus der Schwanzvene oder einem anderen geeigneten Blutgefäß entnommen. Die Blutzellen werden sofort supravital gefärbt(4),(5),(14) oder es werden Ausstrichpräparate hergestellt und anschließend gefärbt. Die Verwendung einer DNA-spezifischen Färbung (z. B. Acridinorange(15) oder Hoechst 33258 plus Pyronin-Y(30)) kann einige der Artefakte beseitigen, die bei der Verwendung einer nicht-DNA-spezifischen Färbung auftreten. Dieser Vorteil schließt die Verwendung herkömmlicher Färbungen (z. B. Giemsa) nicht aus. Zusätzliche Systeme (z. B., Zellulosesäulen zur Entfernung kernhaltiger Zellen(36)) können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, dass sich diese Systeme für die Mikronukleuspräparation im Labor als geeignet erwiesen haben.

G. Analyse

Der Anteil der unreifen an den gesamten (unreifen + reifen) Erythrozyten wird für jedes Tier durch Zählung von insgesamt mindestens 200 Erythrozyten für das Knochenmark und 1000 Erythrozyten für das periphere Blut bestimmt.(9) Alle Objektträger, auch die der Positiv- und Negativkontrollen, sollten vor der mikroskopischen Analyse unabhängig voneinander codiert werden. Mindestens 2000 unreife Erythrozyten pro Tier werden auf das Vorkommen von mikrokernhaltigen unreifen Erythrozyten untersucht. Zusätzliche Informationen können gewonnen werden, indem reife Erythrozyten auf Mikrokerne untersucht werden. Bei der Analyse der Objektträger sollte der Anteil der unreifen Erythrozyten an der Gesamtzahl der Erythrozyten nicht unter 20 % des Kontrollwertes liegen. Werden die Tiere über einen Zeitraum von 4 Wochen oder länger kontinuierlich behandelt, können mindestens 2000 reife Erythrozyten pro Tier auch auf das Vorkommen von Mikrokernen untersucht werden. Systeme für die automatisierte Analyse (Bildanalyse oder durchflusszytometrische Analyse von Zellsuspensionen) sind akzeptable Alternativen zur manuellen Auswertung, wenn sie im Vergleich zur klassischen mikroskopischen Auswertung angemessen begründet und validiert sind.(12)

VII. Verfahren für andere Spezies als Ratten und Mäuse

Veröffentlichte Informationen auf der Grundlage von Studien an Mäusen, Ratten, Hamstern, Schweinen, Hunden, nichtmenschlichen Primaten und Menschen(3),(6),(18),(28),(31),(32),(39),(40),(45) deuten darauf hin, dass die spontane und die induzierte Häufigkeit mikrokernhaltiger Erythrozyten bei den meisten Säugetierarten ähnlich ist, und legen nahe, dass die Messung der Häufigkeit mikrokernhaltiger unreifer Erythrozyten im Knochenmark für die Beurteilung von Chromosomen- oder Spindelschäden bei den bisher untersuchten Arten geeignet ist. Das Auftreten und Verschwinden von mikrokernhaltigen Erythrozyten im Knochenmark hängt von der Kinetik der Erythrogenese und der Lebensdauer der Erythrozyten bei den einzelnen Tierarten ab, weshalb die Dosierung und die Probenahme entsprechend den geeigneten Parametern der Erythrozytenkinetik für jede Tierart angepasst werden müssen. Andere Spezies als Mäuse oder Ratten können gegebenenfalls verwendet werden, doch sollten die folgenden Angaben gemacht werden:

• Begründung der ausgewählten Tierart und der verwendeten Dosierungs- und Probenahmeschemata in Bezug auf die Kinetik der Erythropoese und die Lebensdauer der Erythrozyten bei der verwendeten Tierart;
• Nachweis, dass die Häufigkeit der spontanen Mikrokerne mit den veröffentlichten Informationen übereinstimmt und/oder innerhalb des Labors, das die Studie durchführt, konsistent ist;
• Nachweis, dass bekannte Gentoxika bei der verwendeten Spezies einen Anstieg der Mikronukleus-Häufigkeit hervorrufen, und Referenzwerte für das Ausmaß der induzierten Reaktion;
• Auswirkungen der selektiven Entfernung von mikrokernhaltigen Zellen aus dem peripheren Blut (wenn letzteres als zu überwachendes Gewebe dient).

VIII. Daten und Berichterstattung

A. Behandlungsergebnisse

Die Daten der einzelnen Tiere sollten in Tabellenform dargestellt werden. Die Versuchseinheit ist das Tier. Die Zahl der ausgewerteten unreifen Erythrozyten, die Zahl der mikrokernhaltigen unreifen Erythrozyten und die Zahl der unreifen Erythrozyten im Verhältnis zur Gesamtzahl der Erythrozyten sind für jedes untersuchte Tier getrennt aufzuführen. Werden die Tiere 4 Wochen oder länger kontinuierlich behandelt, sollten auch die Daten über die reifen Erythrozyten angegeben werden, sofern sie erhoben wurden. Der Anteil unreifer Erythrozyten an der Gesamtzahl der Erythrozyten und, falls zutreffend, der Prozentsatz mikrokernhaltiger reifer Erythrozyten sollte für jedes Tier angegeben werden. Gibt es keine Hinweise auf eine unterschiedliche Reaktion zwischen den Geschlechtern, können die Daten beider Geschlechter für die statistische Analyse kombiniert werden.

B. Auswertung und Interpretation der Ergebnisse

Es gibt mehrere Kriterien zur Bestimmung eines positiven Ergebnisses, wie z. B. ein dosisabhängiger Anstieg der Anzahl mikrokernhaltiger Zellen oder ein deutlicher Anstieg der Anzahl mikrokernhaltiger Zellen in einer einzigen Dosisgruppe zu einem einzigen Probenahmezeitpunkt. Zur Auswertung der Testergebnisse sollten statistische Methoden angewandt werden.(24),(35) Die statistischen Kriterien für ein positives, negatives oder nicht eindeutiges Ergebnis sollten im Protokoll klar angegeben werden. Da biologische Faktoren die Interpretation verändern können, sollte die statistische Signifikanz nicht der einzige Faktor sein, der für eine Schlussfolgerung ausschlaggebend ist. Uneindeutige Ergebnisse sollten durch weitere Tests geklärt werden, gegebenenfalls durch eine Änderung der Versuchsbedingungen.

Obwohl die meisten Versuche eindeutig positive oder negative Ergebnisse liefern, kann es in seltenen Fällen vorkommen, dass die Datenlage eine eindeutige Beurteilung der Aktivität der Prüfsubstanz nicht zulässt. Positive Ergebnisse im Mikronukleustest weisen darauf hin, dass eine Substanz Mikronuklei hervorruft, die das Ergebnis einer Chromosomenschädigung oder einer Schädigung des mitotischen Apparats in den Erythroblasten der Testspezies sind. Negative Ergebnisse zeigen an, dass die Prüfsubstanz unter den Testbedingungen keine Chromosomen- oder Spindelschäden verursacht, die zur Bildung von Mikrokernen in den unreifen Erythrozyten der Prüfspezies führen.

Die Wahrscheinlichkeit, dass die Prüfsubstanz oder ihre Metaboliten in den allgemeinen Kreislauf oder speziell in das Zielgewebe gelangen (z. B. systemische Toxizität), sollte erörtert werden. Der Nachweis einer adäquaten Exposition des Zielgewebes in einem negativen Mikronukleustest ist eine besonders wichtige Überlegung, wenn es positive Hinweise auf Genotoxizität in einem oder mehreren anderen Testsystemen gibt.

C. Prüfbericht

Der Prüfbericht sollte auch folgende Informationen enthalten:

1. Prüfsubstanz

• Identifikationsdaten und CAS-Nr., falls bekannt
• physikalische Beschaffenheit und Reinheit
• physikochemische Eigenschaften, die für die Durchführung der Studie relevant sind
• Stabilität der Prüfsubstanz, falls bekannt

2. Lösungsmittel/Vehikel

• Begründung für die Wahl des Vehikels
• Löslichkeit und Stabilität der Prüfsubstanz im Lösungsmittel/Vehikel, sofern bekannt

3. Dosierlösungen

• Zeitpunkte, zu denen die Dosierlösungen zubereitet und verwendet wurden (oder Intervall zwischen Zubereitung und Verwendung), und Lagerungsbedingungen
• Daten, die die Konzentration der Dosierlösung verifizieren, falls verfügbar

4. Versuchstiere

• verwendete Arten/Stämme, einschließlich Begründung
• Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere
• Quelle, Haltungsbedingungen, Ernährung usw.
• Einzelgewicht der Tiere zu Beginn des Tests, einschließlich Körpergewichtsbereich, Mittelwert und Standardabweichung für jede Gruppe
• Informationen über den möglichen Einfluss der Milzselektion auf das Auftreten von mikrokernhaltigen Zellen im peripheren Blut, falls zutreffend

5. Testbedingungen

• positive und negative (Vehikel/Lösungsmittel) Kontrolldaten
• Daten aus der Bereichsfindungsstudie, falls durchgeführt
• Grundlage für die Auswahl der Dosis
• Details der Zubereitung der Prüfsubstanz
• Details der Verabreichung der Prüfsubstanz
• Grundlage für den Verabreichungsweg und das Dosierungsschema
• Methoden zur Überprüfung, ob die Prüfsubstanz den allgemeinen Kreislauf und/oder das Zielgewebe erreicht hat, falls zutreffend
• Umrechnung der Konzentration der Prüfsubstanz in der Nahrung/Trinkwasser (ppm) in die tatsächliche Dosis (mg/kg Körpergewicht/Tag), falls zutreffend
• Details zur Lebensmittel- und Wasserqualität
• Detaillierte Beschreibung der Behandlungs- und Probenahmepläne
• Methoden zur Präparation von Objektträgern
• Methoden zur Messung der Toxizität
• Kriterien für die Bewertung von mikrokernhaltigen unreifen Erythrozyten und, falls angemessen und anwendbar, reife Erythrozyten
• Anzahl der analysierten Zellen pro Tier
• Kriterien für die Einstufung von Studien als positiv, negativ oder zweideutig

6. Ergebnisse

• Anzeichen von Toxizität
• Anteil unreifer Erythrozyten an der Gesamtzahl der Erythrozyten
• Anzahl der mikrokernhaltigen unreifen Erythrozyten an der Gesamtzahl der unreifen Erythrozyten, getrennt für jedes Tier angegeben
• wenn angemessen und zutreffend, Anzahl der mikrokernhaltigen reifen Erythrozyten an der Gesamtzahl der reifen Erythrozyten, getrennt für jedes Tier
• Mittelwert ± Standardabweichung der mikrokernhaltigen unreifen und, falls zutreffend, reifen Erythrozyten pro Gruppe
• Dosis-Wirkungs-Beziehung, soweit möglich
• statistische Analysen und Begründung der angewandten Methode, mit entsprechender Literaturangabe
• gegenwärtige und historische Negativkontrolldaten
• gegenwärtige und historische Positivkontrolldaten

7. Diskussion der Ergebnisse

8. Schlussfolgerung

XI. Nachtrag: Identifizierung von Mikrokernen, die von azentrischen Fragmenten und zentromerischen Chromosomen stammen

Mikrokerne können von azentrischen Fragmenten oder ganzen Chromosomen gebildet werden, die in der Mitose zurückbleiben. Letztere wurden zunächst durch ihre Größe,(49) durch C-Banding(47) oder durch Messung des DNA-Gehalts erkannt.(46) Diese Methoden waren jedoch nicht sehr zuverlässig. Daher wurden zwei molekulare zytogenetische Methoden entwickelt, um das Vorhandensein von Zentromeren in Mikronuklei nachzuweisen und so zwischen Mikronuklei klastogenen und aneugenen Ursprungs zu unterscheiden:(12) 1) Immunfluoreszenz-CREST-Färbung und 2) Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit pancentromerischen DNA-Sonden. Wenn es mechanistisch wichtig ist, das Vorhandensein des Kinetochors oder Zentromers in den Mikrokernen zu bestimmen, können diese Methoden angewandt werden.

Die CREST-Methode, die beim Knochenmark-Mikrokerntest angewandt wird, wird von Miller und Adler ausführlich beschrieben.(33) Zellen auf Objektträgern (normale Knochenmarkausstriche) werden fixiert, dehydriert, in zwei Schritten mit SDS und Triton-X inkubiert und dann mit Antikörpern gefärbt. Die DNA wird mit Hoechst 33258 gegengefärbt.

Bei der FISH wird die Minor-Satelliten-DNA-Sonde, die in der Nähe des Zentromers hybridisiert(43), verwendet, um die zentromerische Region zu identifizieren, falls vorhanden. Eine FISH-Methode mit den zentromerischen DNA-Sonden wurde von Pinkel et al. beschrieben.(34) Diese Methode kann auf durchflusssortierte mikrokernhaltige Erythrozyten(10) oder auf isolierte Mikrokerne aus peripheren Blutproben angewendet werden.(13)

In Kontroll-Objektträgern beträgt der Anteil der markierten Mikrokerne, die die zentromerische Region enthalten, etwa 50 %.(43) Etwa 70 % der durch bekannte Aneugene (Colchicin und Vinblastin) induzierten Mikrokerne sind markiert,(33) während die durch Klastogene (Hydrochinon und Mitomycin C) induzierten Mikrokerne nur 5-15 % markierte Mikrokerne aufweisen.(33) Zur Charakterisierung der relativen klastogenen gegenüber der aneugenen Aktivität einer Chemikalie ist es nützlich, als Index die Anzahl der mikrokernhaltigen polychromatischen Erythrozyten pro 1000 polychromatische Erythrozyten, die die zentromerische Region enthalten, zu verwenden.(42)

Der Hauptmangel der bisher beschriebenen FISH-Methoden besteht darin, dass sie nicht zwischen normochromatischen und polychromatischen Erythrozyten unterscheiden.(12) Daher sind nur Präparate für die Analyse geeignet, bei denen ein großer Teil der vorhandenen Mikrokerne durch den Prüfgegenstand induziert wird. So sind z.B. periphere Blutproben aus Experimenten mit akuter Exposition bei erwachsenen Tieren praktisch nie für die Analyse geeignet, da die Zielzellpopulation (unreife Erythrozyten) nur 3-5% der Erythrozyten in der Probe ausmacht.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die CREST- oder FISH-Markierung als zuverlässige Methoden zum Nachweis der aneugenischen Eigenschaften von Chemikalien im In-vivo-Mikronukleustest gelten, vorausgesetzt, es wird darauf geachtet, dass geeignete Proben für die Analyse verwendet werden.(12) Die Komplexität der derzeitigen Methoden schränkt ihre Anwendung jedoch auf die Fälle ein, in denen der Verdacht besteht, dass eine Chemikalie eine Spindelschädigung verursacht (z. B., aufgrund des Vorhandenseins großer Mikrokerne, der Induktion von Polyploidie usw.) oder wenn es andere spezifische Gründe gibt, um diese mechanistischen Informationen zu erhalten.

X. Referenzen

1. Armstrong, M.J., Galloway, S.M. (1993). Micronuclei Induced in Peripheral Blood of mu-PIM-1 Transgenic Mice by Chronic Oral Treatment with 2-Acetylaminofluorene or Benzene but not with Diethylnitrosamine or 1,2-Dichloroethane. Mutation Res. 302:61-70.
2. Choy, W.N., MacGregor, J.T., Shelby, M.D., Maronpot, R.R. (1985). Induktion von Mikronuklei durch Benzol in B6C3F1-Mäusen: Retrospektive Analyse von Ausstrichen des peripheren Blutes aus dem NTP-Karzinogenese-Bioassay. Mutation Res. 143:55-59.
3. Choy, W.N., Willhite, C.C., Cukierski, M.J. and Book, S.A. (1989). Primaten-Mikronukleus-Studie von L-Selenomethionin. Environ. Molec. Mutagenesis 14:123-125.
4. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMS.MMS. Mutation Res. 278:83-98.
5. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Empfohlenes Protokoll für den Short-Term Mouse Peripheral Blood Micronucleus Test. Mutagenesis 10:153-159.
6. Everson, R.B., Wehr, C.M., Erexson, G.L. und MacGregor, J.T. (1988). Assoziation von marginalem Folatmangel mit erhöhter menschlicher Chromosomenschädigung in vivo: Nachweis durch Analyse von mikrokernhaltigen Erythrozyten. J. Natl. Cancer Inst. 80:25-529.
7. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J., und Richold, M. (1992). Bericht der British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis 7:313-319.
8. Garriott M.L., Brunny J.D., Kindig D.E., Parton J.W., Schwier L.S. (1995). Der In-vivo-Ratten-Mikronukleustest: Integration mit einer 14-Tage-Studie. Mutation Res. 342:71-6.
9. Gollapudi, B. und McFadden, L.G. (1995). Sample Size for the Estimation of Polychromatic to Normochromatic Erythrocyte Ratio in the Bone Marrow Micronucleus Test. Mutation Res. 347:97-99).
10. Grawé J., Nüsse M. und Adler I.-D. (1997). Quantitative und qualitative Untersuchungen der Mikronukleus-Induktion in Maus-Erythrozyten mittels Durchflusszytometrie: I. Measurement of Micronucleus Induction in Peripheral Blood Polychromatic Erythrocytes by Chemicals with Known and Suspected Genotoxicity. Mutagenesis 12:1-8.
11. Hamada, S., Sutou, S., Morita, T., Wakata, A., Asanami, S., Hosoya, S., Ozawa, S., Kondo, K., Nakajima, M., Shimada, H., Osawa, K., Kondo, Y., Asano, N., Sato, S.-I., Tamura, H., Yajima, N., Marshall, R., Moore, C., Blakey, D.H., Weaver, J.L., Torus, D.K., Proudlock, R., Ito, S., Namiki, C., Hayashi, M. (1999). Bewertung des Langzeit-Mikronukleus-Tests für Nagetiere: Zusammenfassung der 13. gemeinschaftlichen Studie von CSGMT/JEMS.MMS, Environ. Molec. Mutagenesis 37(2):93-110.
12. Hayashi, M., MacGregor, J.T., Gatehouse, D.G., Adler, I.-D., Blakey, D.H., Dertinger, S.D., Krishna, G., Morita, T., Russo, A. und Sutou, S. (2000). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay: II. Some Aspects of Protocol Design Including Repeated Treatments, Integration with Toxicity Testing, and Automated Scoring. Environ. Molec. Mutagenesis 35: 234-252.
13. Hayashi M., Mäki-Paakkanen J., Tanabe H., Honma M., Suzuki T., Matsuoka A., Mizusawa H., Sofuni T. (1994). Isolierung von Mikrokernen aus Mausblut, Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung mit einer zentromerischen DNA-Sonde der Maus. Mutation Res. 307:245-251.
14. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Research 245:245-249.
15. Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res. 120:241-247.
16. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. und Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res. 312:293-304.
17. Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res. 18:187-190.
18. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). Die Induktion von Mikronuklei als Maß für die Genotoxizität. Mutation Res. 123:61-118.
19. Henderson, L., Fedyk, J., Windebank, S., Smith, M. (1993). Induktion von Mikronuklei in Rattenknochenmark und peripherem Blut nach akuter und subchronischer Behandlung mit Azathioprin. Mutation Res. 291:79-85.
20. Higashikuni, N. und Sutou, S. (1995). Ein optimaler, verallgemeinerter Probenahmezeitpunkt von 30 ±6 h nach der doppelten Dosierung im Maus-Peripherie-Blut-Mikronukleustest. Mutagenesis 10:313-319.
21. Jauhar, P.P., Henika, P.R., MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Shelby, M.D., Murphy, S.A., Margolin, B.H. (1988). 1,3-Butadien: Induktion von mikrokernhaltigen Erythrozyten im peripheren Blut von B6C3F1-Mäusen, die 13 Wochen lang durch Inhalation exponiert wurden. Mutation Res. 209:171-176.
22. Krishna, G., Criswell, K., Zielinski, D., Urda G., Juneau, P., Bleavins, M., Theiss, J., (1998a). Validierung der Mikronukleus-Bewertung bei der Ratte mittels Durchflusszytometrie mit fünf Modellverbindungen. Environ. Molec. Mutagen. 31:46.
23. Krishna, G., Urda, G., Theiss, J. (1998b). Principles and Practices of Integrating Genotoxicity Evaluation into Routine Toxicology Studies: A Pharmaceutical Industry Perspective. Environ. Molec. Mutagen. 32:115-120.
24. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. und Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney S. 184-232.
25. Luke, C.A., Tice, R.R., Drew, R.T. (1988). The Effect of Exposure Regimen and Duration on Benzene-Induced Bone-Marrow Damage in Mice. I. Geschlechtsvergleich bei DBA/2-Mäusen. Mutation Res. 203:251-271.
26. MacGregor, J.T., Heddle, J.A., Hite, M., Margolin, G.H., Ramel C., Salamone, M.F., Tice, R.R. und Wild, D. (1987). Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes. Mutation Res. 189:103-112.
27. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M. (1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in: „Entwicklungen in Wissenschaft und Praxis der Toxikologie“, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.
28. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Gould, D.H. (1980). Clastogen-Induced Micronuclei in Peripheral Blood Erythrocytes: The Basis of an Improved Micronucleus Test. Environ. Mutagenesis 2:509-514.
29. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E. (1990). Der In-vivo-Erythrozyten-Mikronukleustest: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol. 14:513-522.
30. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., and Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res. 120:269-275.
31. Matter, B.E. and Schmid, W. (1971). Trenimon-Induced Chromosomal Damage in Bone Marrow Cells of Six Mammalian Species. Mutation Res. 12:417-425.
32. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A. (1990). Der In-vivo-Mikronukleustest in Knochenmark und peripherem Blut von Säugetieren. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res. 239:29-80.
33. Miller B.M. und Adler I.-D. (1990). Application of Antikinetochore Antibody Staining (CREST Staining) to Micronuclei in Erythrocytes Induced In Vivo. Mutagenesis 5:411-415.
34. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. (1986). Cytogenetic Analysis Using Quantitative, High-Sensitivity Fluorescence Hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2934-2938.
35. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. und Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Bericht. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, S. 115-141.
36. Romagna, F. und Staniforth , C.D.(1989). The Automated Bone Marrow Micronucleus Test. Mutation Res. 213:91-104
37. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1982). A Rapid Screen for Cumulative Chromosomal Damage in Mice. Accumulation of Circulating Micronucleated Erythrocytes. Mutation Res. 113:481-487.
38. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1983). The Persistence of Micronuclei in Peripheral Blood Erythrocytes: Nachweis von chronischen Chromosomenbrüchen bei Mäusen. Mutation Res. 104:367-369.
39. Schlegel, R. und MacGregor, J.T. (1984). The Persistence of Micronucleated Erythrocytes in the Peripheral Circulation of Normal and Splenectomized Fischer 344 Rats: Implikationen für das zytogenetische Screening. Mutation Res. 127:169-174.
40. Schlegel, R., MacGregor, J.T. und Everson, R.B. (1986). Assessment of Cytogenetic Damage by Quantitation of Micronuclei in Human Peripheral Blood Erythrocytes. Cancer Res. 46:3717-3721.
41. Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test. Mutation Res. 31:9-15.
42. Schriever-Schwemmer G. and Adler I.-D. (1997). Differenzierung von Mikronuklei in Knochenmarkzellen der Maus: A Comparison between CREST Staining and Fluorescence In Situ Hybridization with Centromeric and Telomeric DNA Probes. Mutagenesis 9:333-340.
43. Schriever-Schwemmer G., Kliesch U., and Adler I.-D. (1994). Extrudierte Mikronuklei, die durch Colchicin oder Acrylamid induziert werden, enthalten meist nachhängende Chromosomen, die in Pinselausstrichen durch Minor- und Major-DNA-Sonden der Maus identifiziert werden. Mutagenesis 12:201-207.
44. Tice, R.R., Furedi-Machacek, M., Satterfield, D.N.A., Udumudi, A., Vasquez, M., Dunnick, J.K. (1998). Messung von mikrokernhaltigen Erythrozyten und DNA-Schäden während der chronischen Aufnahme von Phenolphthalein bei transgenen weiblichen Mäusen, die heterozygot für das p53-Gen sind. Environ. Molec. Mutagen. 31:113-124.
45. Tsuchimoto, T. and Matter, B.E. (1979). In Vivo Cytogenetic Screening Methods for Mutagens, with Special Reference to the Micronucleus Test. Arch. Toxicol. 42:239-248.
46. Vanderkerken K., Vanparys Ph., Verschaeve L., and Kirsch-Volders M. (1989). The Mouse Bone Marrow Micronucleus Assay Can be Used to Distinguish Aneugens from Clastogens. Mutagenesis 4:6-11.
47. Verschaeve L., Vanderkerken K., and Kirsch-Volders M. (1988). C-banding as a Simple Tool to Discriminate between Micronuclei Induced by Clastogens and Aneugens. Stain Technol. 63:351-354.
48. Witt, K.L., Gulati, D.K., Kaur, P., Shelby, M.D. (1995). Phenolphthalein: Induktion von mikrokernhaltigen Erythrozyten in Mäusen. Mutation Res. 341:151-60.
49. Yamamoto K.I. and Kikuchi Y. (1980). A Comparison of Diameters of Micronuclei Induced by Clastogens and by Spindle Poisons. Mutation Res. 71:127-131.
50. Yamamoto K.I. and Kikuchi Y. (1981). Studies on Micronuclei Time Response and on the Effects of Multiple Treatments of Mutagens on Induction of Micronuclei. Mutation Res. 90:163-173.