PEI fördert die Anheftung von schwach verankerten Zellen und Primärgeweben
PC-12-Zellen werden im Labor als Modell für die neuronale Differenzierung verwendet, da die Behandlung dieser Zellen mit dem Nervenwachstumsfaktor (NGF) die Ausdehnung von Neuriten und die Expression von biochemischen Markern des sympathischen neuronalen Phänotyps induziert. Sie wachsen als schwach verankerte Zellen und Kollagen- oder Polylysin-Polymere werden häufig zur Vorbeschichtung von Platten für die PC-12-Zellkultur verwendet. PC-12-Zellen wurden im Labor in naiven Vertiefungen oder in mit verschiedenen Anheftungsfaktoren vorbeschichteten Vertiefungen (Multiwell-12-Gewebekulturschalen) kultiviert, um die Auswirkungen auf die Verankerung der Zellen auf dem Substrat zu beobachten. In Abwesenheit jeglicher Beschichtung zeigten die Zellen eine charakteristische Tendenz zur Bildung von Zellclustern, die sich in der Mitte der Vertiefung ansammeln; diese Zellen sind untereinander fest verankert, aber nur sehr schwach mit der Gewebekulturschale verbunden (Abbildung 1D). Dies führt zu einer sehr heterogenen Verteilung der Zellen (nur sehr wenige Zellen verbleiben am Rand der Vertiefungen) und zu einem erheblichen Verlust von Zellen bei Waschvorgängen oder Medienwechseln. Die Vorbehandlung der Platten mit PEI führte zu einer deutlich homogeneren Verteilung der Zellen in den Vertiefungen, wobei die Zellen fest an der Platte haften und eine wesentlich geringere Tendenz zur Klumpenbildung aufweisen (Abbildung 1A). Zum Vergleich wurden die Platten auch mit anderen häufig verwendeten Beschichtungsmitteln, Kollagen (Abbildung 1B) und Poly-D-Lysin (PDL; Abbildung 1C), vorbehandelt, was ebenfalls zu einer festeren Anhaftung der Zellen an den Platten und einer homogeneren Verteilung der Zellen führte.
Anhaftung von PC-12-Zellen und neuronalen Explantaten an Kulturschalen. PC-12-Zellen haften besser an Kunststoffoberflächen, die mit verankerungsfördernden Faktoren wie PEI (Tafel A), Kollagen (Tafel B) oder PDL (Tafel C) vorbehandelt wurden, als an der unbehandelten Kunststoffoberfläche (Tafel D), die Zellen in Clustern enthielt und nur sehr lose am Substrat haftete (die Bilder wurden in der Mitte zwischen Mitte und Rand der Platte aufgenommen). Die PEI-Beschichtung führte zu einer homogenen Verteilung der Zellen, die fest mit dem Schalensubstrat verbunden waren (Tafel A). PEI fördert die Anhaftung von Netzhautexplantaten von Zebrafischen an Kulturschalen (Tafel E). Dieser Anheftungsfaktor unterstützte die Neuritenausdehnung in Netzhautexplantaten, die durch eine präkonditionierende Läsion des Sehnervs zum axonalen Wachstum angeregt wurden (Tafel F). Der Balken in den Mikroaufnahmen entspricht 25 μm in den Tafeln A-D, 50 μm in Tafel E und 100 μm in Tafel F.
Um die durch die PEI-Vorbehandlung der Kulturschalen beobachtete Verbesserung der Verankerung weiter zu testen, wurde ein zweites System verwendet. Netzhautexplantate von Teleostfischen wurden für die Untersuchung der Nervenregeneration verwendet. Wenn der Sehnerv des Fisches verletzt wird, setzt eine Regenerationsreaktion ein, und die retinalen Ganglienzellen (RGCs) der Netzhaut verlängern ihr Axon wieder in Richtung des tektalen Zielgewebes. Wird die Netzhaut eines solchen „geprimten“ Fisches entnommen und kultiviert, lässt sich die Regenerationsreaktion in vitro durch die beschleunigte Ausdehnung langer Neuriten beobachten. Dieses Phänomen erfordert jedoch die Verwendung einer extrazellulären Matrix oder von Anheftungsfaktoren (z. B. Kollagen oder PDL-Beschichtung), da die Explantate eine sehr geringe Affinität zur unbeschichteten Kunststoffoberfläche aufweisen. In Experimenten wurde untersucht, ob PEI als Anheftungsfaktor fungieren könnte, der das axonale Auswachsen von Zebrafisch-Netzhaut-Explantaten fördert. Netzhautexplantate aus Kontroll-Zebrafischaugen konnten sich an PEI-behandelte Kulturschalen anheften (Abbildung 1E). Darüber hinaus konnten Netzhautexplantate von Fischen, die eine konditionierende Läsion erhalten hatten, Axone kräftig ausstrecken, wenn sie mit PEI als Anheftungsfaktor kultiviert wurden (Abbildung 1F).
Die Ergebnisse mit den Netzhautexplantaten deuten darauf hin, dass neuronale Zellen, die an PEI-beschichtete Schalen angeheftet sind, sich differenzieren und Neuriten bilden können, die gut an das Substrat anhaften. Um diese Hypothese mit den pro-neuronalen PC-12-Zellen zu testen, wurden Differenzierungsexperimente durch NGF-Behandlung mit Zellen durchgeführt, die auf mit PEI beschichteten Schalen befestigt waren. Die mit NGF behandelten PC-12-Zellen blieben über mehrere Tage fest mit der Platte verbunden und bildeten Netzwerke von Neuriten (Abbildung 2). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass PEI den Differenzierungsprozess und die Anheftung der Neuriten an der Platte begünstigt. Die differenzierten Zellen blieben während der immunzytochemischen Experimente fest verankert (M. Challa, G. R. Chapa, M. González-García und R. P. Ballestero, unveröffentlichte Ergebnisse).
Differenzierung von PC-12-Zellen auf mit PEI beschichteten Kulturschalen. PC-12-Zellen, die sich auf PEI-beschichteten Schalen befanden, blieben fest auf der Platte verankert und bildeten bei Behandlung mit NGF Neuriten aus. Die Bilder zeigen den Fortschritt der Differenzierung der behandelten Zellen im Laufe der Zeit: 0 h (Tafel A), 24 h (Tafel B), 48 h (Tafel C) und 96 h (Tafel D) nach Beginn der Behandlung mit 100 ng/ml NGF. Der Balken in den Mikroaufnahmen entspricht 25 μm.
Stärke der Verankerung von eukaryotischen Zellen auf Kulturschalen, die mit PEI und anderen Anheftungsfaktoren vorbehandelt wurden
Drei verschiedene Zelllinien wurden ausgewählt, um die Fähigkeit von PEI zu testen, eine starke Verankerung auf Plastikkulturschalen zu fördern. PC-12- und HEK-293-Zellen wurden oben als schwach verankert beschrieben. MYS-Zellen hingegen sind primäre Fibroblasten, die stark an Plastikkulturschalen haften und zu einer Monolage von Zellen auf der Oberfläche heranwachsen. Um die Stärke der Verankerung der verschiedenen Zellen auf den Platten zu testen, wurde ein Protokoll durchgeführt, bei dem vier aufeinanderfolgende Waschungen mit isotonischem Puffer erfolgten, gefolgt von der Verwendung eines kolorimetrischen Protokolls zur Zählung der in der Platte verbliebenen Zellen (basierend auf dem Vitalfarbstoff Neutralrot). Die mit den verschiedenen Anheftungsfaktoren vorbehandelten Platten wurden mit den nicht vorbehandelten Platten verglichen. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, und es wurden die Durchschnittswerte des Farbstoffs berechnet, der in den Platten mit den einzelnen Behandlungen verblieben war. Diese Durchschnittswerte wurden auf den mit der PEI-Vorbehandlung erzielten Durchschnittswert normiert, dem in allen Experimenten der willkürliche Wert von 100,0 % zugewiesen wurde. Die Ergebnisse aus repräsentativen Experimenten mit den drei Zelllinien sind in Abbildung 3 dargestellt (mit jeder Zelllinie wurden mindestens drei unabhängige Experimente durchgeführt). PC-12-Zellen hafteten fast gleich gut an Platten, die mit PEI, Kollagen oder PDL beschichtet waren (relative Zellzahlen von 100,0 % ± 5,3 %, 89,3 % ± 5,0 % und 96,3 % ± 5,8 % für PEI, Kollagen bzw. PDL). Ein signifikanter Zellverlust wurde jedoch beim Vergleich von unbehandelten mit PEI-behandelten Platten beobachtet, mit einer relativen Zellzahl von 43,9 % ± 5,8 % (Abbildung 3A). Im Falle von HEK-293 hafteten die Zellen sowohl an den PEI- als auch an den PDL-behandelten Vertiefungen stark. In dem in Abbildung 3B dargestellten repräsentativen Experiment betrugen die relativen Zählungen mit diesen beiden Behandlungen 100,0 % ± 0,4 % bzw. 96,8 % ± 1,7 %. Allerdings ging eine große Anzahl von Zellen verloren, wenn sie in die unbehandelten Vertiefungen (relative Zählung von 8,3 % ± 0,6 %) oder in die mit Kollagen vorbehandelten Vertiefungen (11,5 % ± 1,2 %) plattiert wurden, was darauf hindeutet, dass diese Zellen relativ lose an den Kunststoff oder an die kollagenbeschichteten Vertiefungen anhaften. Bei der Verwendung von Fibroblastenzellen (MYS-Zellen) schließlich schienen die Zellen an allen vier Oberflächen recht gut zu haften, auch an den unbehandelten Vertiefungen (Abbildung 3C). Abbildung 3C zeigt ein repräsentatives Diagramm mit relativen MYS-Zellzahlen von 100,0 % ± 2,2 %, 85,9 % ± 7,8 %, 73,7 % ± 6,6 % und 77,1 % ± 1,4 % bei mit PEI, Kollagen oder PDL vorbehandelten bzw. unbehandelten Vertiefungen. Diese Zelllinie haftet also im Vergleich zu den PC-12- und HEK-293-Zelllinien recht gut an der unbehandelten Kunststoffoberfläche.
PEI-Beschichtung fördert die feste Anhaftung von schwach verankerten Zellen an das Substrat. Um die Stärke der Anhaftung von Zellen an Kulturschalen zu bewerten, die mit Faktoren beschichtet sind, die die Zellverankerung fördern, wurde der Verlust von Zellen gemessen, der durch ein Protokoll mit mehreren Waschvorgängen verursacht wurde. PEI wurde mit anderen Anheftungsfaktoren (Kollagen, PDL) und mit unbehandelten Kontrollschalen verglichen. Die relativen Zellzahlen wurden normalisiert, indem den PEI-behandelten Schalen ein willkürlicher Wert von 100,0 % zugewiesen wurde. Die PEI-Beschichtung führte zu einer signifikanten Verbesserung der Verankerungsstärke bei PC-12-Zellen (Diagramm A) und bei HEK-293-Zellen (Diagramm B), was im Vergleich zu anderen üblicherweise verwendeten Anheftungsfaktoren positiv ist. Bei einer stark verankerten Zelllinie (MYS-Zellen, Diagramm C) wurden keine Vorteile bei der Befestigung festgestellt. Die Balken zeigen den Durchschnitt ± Standardabweichung von dreifachen Versuchen, die für mindestens drei verschiedene durchgeführte Experimente repräsentativ sind (* signifikant höher als die unbehandelte Kontrolle, p < 0,01; ** signifikant höher als die unbehandelte Kontrolle in dem vorgestellten Experiment, p < 0,01, aber Signifikanz in unabhängigen Experimenten nicht aufrechterhalten).
Um einen Anhaltspunkt für die Schwankungen zwischen den Experimenten zu erhalten, wurden die Mittelwerte ± Standardabweichungen der relativen Zellzahlen, die in den unabhängigen Experimenten erzielt wurden, für jede Zelllinie und jede Behandlung berechnet (da in allen Experimenten die Zahl der mit PEI vorbehandelten Vertiefungen auf 100,0 % festgelegt wurde, beträgt der Wert für den Gesamtdurchschnitt mit diesem Beschichtungsmittel genau 100,0 % für alle Zelllinien). Die Vergleichsergebnisse für die anderen Behandlungen sind unten angegeben. Bei den PC-12-Zellen betrugen die relativen Zählungen 81,5 % ± 8,8 % für die mit Kollagen vorbehandelten Vertiefungen (n = 4), 93,9 % ± 21,2 % für die mit PDL vorbehandelten Vertiefungen (n = 4) und 52,1 % ± 13,7 % für die unbehandelten Vertiefungen (n = 4). Bei den HEK-293-Zellen betrugen die relativen Zahlen 16,3 % ± 12,7 % für die mit Kollagen vorbehandelten Vertiefungen (n = 3), 99,6 % ± 2,5 % für die mit PDL vorbehandelten Vertiefungen (n = 3) und 9,0 % ± 4,1 % für die unbehandelten Vertiefungen (n = 3). Bei den Experimenten mit MYS-Zellen betrug der Durchschnitt der relativen Zählungen in den mit Kollagen vorbehandelten Vertiefungen 92,7 % ± 16,2 % (n = 3), 71,1 % ± 6,7 % bei den mit PDL vorbehandelten Vertiefungen (n = 3) und 78,4 % ± 11,5 % bei den unbehandelten Vertiefungen (n = 3). Die statistische Analyse zeigt, dass die Verbesserung der Adhäsion von PC-12- und HEK-293-Zellen an PEI-behandelten Schalen im Vergleich zu unbehandeltem Kunststoff signifikant ist (p < 0,05 bzw. p < 0,01, t-Test-Analyse), während sie für MYS-Zellen statistisch nicht signifikant ist (p > 0,05).
Um die Eigenschaften von PEI als Anheftungsfaktor für schwach verankerte Zellen weiter zu charakterisieren, wurden Experimente durchgeführt, um die PEI-Dosierung, die eine optimale Zellverankerung ermöglicht, den Bereich der Zellzahlen, die von der Anwesenheit von PEI profitieren können, und die Stabilität von PEI als Anheftungsfaktor zu analysieren. Abbildung 4A zeigt die Ergebnisse eines repräsentativen Versuchs, bei dem die Stärke der Anhaftung von HEK-293-Zellen an mit verschiedenen PEI-Dosierungen beschichteten Schalen getestet wurde. Die Zellzahlen wurden auf den Wert normalisiert, der für die Behandlung mit 25 μg/ml PEI erhalten wurde, der auf 100,0 % festgelegt wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass PEI-Konzentrationen von 2,5 μg/ml oder höher zu einer maximalen Anheftungsverbesserung führen, was darauf hindeutet, dass die Oberfläche der Kunststoffschale bei diesen Konzentrationen vollständig mit dem Polymer beschichtet ist. Die höheren Konzentrationen des Polymers schienen keine toxischen Auswirkungen auf die Zellen zu haben, wenn der in der Lösung verbleibende PEI-Überschuss gründlich entfernt wurde (leichte toxische Auswirkungen wurden bei der Konzentration von 250 μg/ml beobachtet, wenn die Lösung nach der Behandlung nicht vollständig entfernt wurde). Das dargestellte Experiment ist repräsentativ für 4 unabhängige Versuche. Abbildung 4B zeigt die Ergebnisse, die mit verschiedenen Zahlen von PC-12- und HEK-293-Zellen erzielt wurden. Die Abbildung zeigt die relativen Zellzahlen, wobei ein willkürlicher Wert von 100,0 % dem Durchschnittswert der PEI-behandelten Vertiefungen mit der höchsten Anzahl der jeweiligen Zelllinie (3,2 × 105 HEK-293-Zellen und 1,5 × 106 PC-12-Zellen) zugeordnet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass PEI als Anheftungsfaktor über einen breiten Bereich von Zellzahlen sowohl für PC-12- als auch für HEK-293-Zellen gut funktioniert. Niedrigere Zellzahlen konnten nicht zuverlässig getestet werden, da sie nahe an der Empfindlichkeitsgrenze des Neutralrot-Tests lagen. Die dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens 4 unabhängige Experimente, die mit jeder Zelllinie durchgeführt wurden. Abbildung 4C zeigt die Ergebnisse eines Experiments, das durchgeführt wurde, um die Stabilität von PEI als Anheftungsfaktor zu testen. In diesem Experiment wurde ein Satz Platten mit PEI behandelt und anschließend 10 Tage lang bei 4 °C in PBS aufbewahrt. In einem zweiten Versuch wurden die Platten mit PEI behandelt und (mit Medium) 3 Tage lang im CO2-Inkubator bei 37°C aufbewahrt, wobei alle 24 Stunden ein Mediumwechsel vorgenommen wurde. Die Leistung von PEI in diesen Platten wurde dann mit Platten verglichen, die mit PEI behandelt wurden, wobei das für frühere Versuche beschriebene Standardprotokoll verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigen die relativen Zellzahlen, normalisiert auf den Durchschnitt der Absorptionswerte, die mit den PEI-behandelten Standardplatten erzielt wurden, die den willkürlichen Wert von 100,0 % erhielten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die PEI-Beschichtung auf der Oberfläche der Kunststoffschalen mindestens 10 Tage lang im Kühlschrank stabil bleibt und auch durch die Bebrütung bei 37 °C im Medium oder sogar durch wiederholte Mediumwechsel nicht entfernt wird. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 4 unabhängige Experimente, die in dreifacher Ausführung durchgeführt wurden.
Charakterisierung der Eigenschaften von PEI als Bindungsfaktor. Schaubild A: Es wurden steigende Dosen von PEI getestet, um den Konzentrationsbereich für eine optimale Beschichtung zu bestimmen. PEI zeigte eine vollständige Verbesserung der Anhaftung bei Konzentrationen von 2,5 μg/ml und höher. Schaubild B: PEI förderte die Anheftung sowohl von PC-12- als auch von HEK-293-Zellen über einen breiten Bereich von Zellzahlen (die getesteten Zahlen sind auf der X-Achse angegeben). Schaubild C: Die PEI-Beschichtung blieb auf der Oberfläche der Kulturschale über lange Inkubationszeiten und Medienwechsel hinweg stabil (10d-PBS: PEI-behandelte Schale, die 10 Tage lang in PBS bei 4 °C inkubiert wurde; 96 h-3MC: PEI-behandelte Schale, die 96 Stunden lang mit drei Medienwechseln bei 37 °C inkubiert wurde). Für alle Diagramme zeigen die Balken den Durchschnitt ± Standardabweichung von dreifachen Versuchen, die für mindestens 3 unabhängige Experimente repräsentativ sind (* signifikant höher als die unbehandelte Kontrolle, p < 0,01).
PEI-Vorbehandlung verbessert die Lipofektion von schwach verankerten Zellen
Die Transfektion eukaryontischer Zellen durch Lipofektion umfasst mehrere Schritte, Medienzugaben und -wechsel, die bei schwach verankerten Zellen einen Tribut fordern können. Selbst wenn darauf geachtet wird, Zellverluste zu vermeiden, können die schwach verankerten Zellen die Transfektionskomplexe weniger effizient aufnehmen. Da die PEI-Vorbehandlung von Zellkulturschalen die Stärke der Anhaftung von Zellen an solche Oberflächen erhöht, wurde die Hypothese aufgestellt, dass sich der Anhaftungsfaktor positiv auf die durch Lipofektion erzielte Transfektionsausbeute auswirken könnte. Die drei oben beschriebenen Zelllinien wurden zur Überprüfung dieser Hypothese unter Verwendung der zuvor untersuchten Beschichtungsmittel verwendet. Die Transfektionen wurden mit einem Plasmid durchgeführt, das für das Reporterenzym β-Galactosidase kodiert. Die Transfektionsausbeute wurde durch Bestimmung der Aktivität des Reporterenzyms in Lysaten der transfizierten Zellen überwacht. Mit jeder Zelllinie wurden mindestens zwei unabhängige Assays in dreifacher Ausführung durchgeführt. Repräsentative Diagramme sind in Abbildung 5 dargestellt. Die Ausbeuten (β-Galaktosidase-Aktivitäten) wurden auf die mit PEI-Vorbeschichtung erhaltene Aktivität normiert, die als Referenz auf 100,0 % gesetzt wurde. Generell wurde beobachtet, dass die Transfektionsausbeute bei den schwach verankerten Zellen durch die Vorbeschichtung mit Mitteln, die die Zellanhaftung an der Platte fördern, verbessert wurde. Im Fall der PC-12-Zellen führte die Vorbeschichtung der Vertiefungen mit PEI, Kollagen oder PDL zu einer 2- bis 3-fachen Steigerung der Transfektionsausbeute im Vergleich zu den unbehandelten Vertiefungen: relative Ausbeuten von 100,0 % ± 1,4 % für PEI, 87,0 % ± 8,7 % für Kollagen und 100,1 % ± 2,4 % für PDL gegenüber 42,9 % ± 2,2 % für die unbehandelten Vertiefungen (Abbildung 5A). Die Verbesserung der Transfektionsausbeute durch die PEI-Vorbehandlung war bei HEK-293-Zellen stärker ausgeprägt. Das Experiment in Abbildung 5B zeigt eine relative Aktivität von 21,1 % ± 3,4 % für die Zellen in den unbehandelten Vertiefungen im Vergleich zu 100,0 % ± 8,4 % für die mit PEI vorbehandelten Vertiefungen (etwa fünffache Steigerung). Die Vorbehandlung mit Kollagen oder PDL führte zu bescheideneren Induktionen (etwa 2- bis 3-fach in Abbildung 5B). Die geringste Verbesserung wurde mit Kollagen beobachtet, ähnlich wie die geringere Verstärkung der Anheftung von HEK-293-Zellen, die zuvor in Abbildung 3B beobachtet wurde. Bei den stark anhaftenden MYS-Fibroblasten schließlich wurde kein signifikanter positiver Effekt durch die Verwendung von Anheftungsfaktoren im Transfektionsverfahren beobachtet. Die Schwankungen betrugen in der Regel weniger als 20 % für alle Versuchsbedingungen. Das in Abbildung 5C gezeigte repräsentative Experiment zeigt in der Tat eine etwas höhere Transfektionsausbeute für die unbehandelten Vertiefungen als für die PEI-vorbehandelten Platten (relative Aktivität von 117,7 % ± 3,2 % für die unbehandelten Vertiefungen gegenüber 100,0 % ± 4.8% für die PEI-behandelten Vertiefungen, oder eine etwa 1,2-fach höhere Transfektionsausbeute in der Kontrolle).
PEI verbessert die Transfektion von schwach verankerten Zellen. Die Transfektionsausbeuten wurden durch β-Galactosidase-Assays bestimmt und auf die Ausbeuten normalisiert, die mit PEI-Beschichtung der Kulturschale erzielt wurden (denen ein willkürlicher Wert von 100,0 % zugewiesen wurde). PEI und andere Anheftungsfaktoren verbesserten die Transfektion von lose anhaftenden Zelllinien wie PC-12-Zellen (Grafik A) und HEK-293-Zellen (Grafik B). Bei fest haftenden Zellen wie MYS-Fibroblasten wurde kein signifikanter Effekt beobachtet (Diagramm C). Die Balken zeigen den Durchschnitt ± Standardabweichung von dreifachen Versuchen, die für mindestens zwei unabhängige Experimente repräsentativ sind (* signifikant höher als die unbehandelte Kontrolle, p < 0,01).
Wenn man die Ergebnisse aller durchgeführten Experimente zusammenfasst, ergibt sich eine durchschnittliche Vervielfachung (± Standardabweichung) der Transfektionsausbeute von PC-12-Zellen, die an PEI verankert sind, im Vergleich zu Zellen auf unbehandelten Vertiefungen um das 2.4fach (± 0,1fach; n = 3), während die Steigerung bei HEK-293-Zellen 6,3fach (± 0,5fach; n = 2) betrug. Die statistische t-Test-Analyse zeigt, dass beide Steigerungen signifikant sind (p < 0,05). In den Experimenten mit MYS-Zellen wurde keine signifikante Transfektionssteigerung beobachtet, mit einer durchschnittlichen Fold-Änderung von 1,0-fach (± 0,3-fach; n = 2) durch die Vorbehandlung mit PEI (im Grunde identisch mit der Ausbeute ohne Behandlung).