Da eine genaue Proteinquantifizierung für alle Experimente im Zusammenhang mit Proteinstudien unerlässlich ist, wurden verschiedene Methoden zur Messung der Proteinkonzentration in einem bestimmten Assay entwickelt. Zu den traditionelleren Methoden der Gesamtproteinquantifizierung gehören die Messung der UV-Absorption bei 280 nm (A280), Bicinchoninsäure- (BCA) und Bradford-Assays sowie andere alternative Methoden wie Lowry und andere neuartige Assays.
Da Proteine Licht bei einer bestimmten Wellenlänge absorbieren, kann die Messung mit einem Spektralphotometer erfolgen. Insbesondere die Aminosäuren Tyrosin und Tryptophan weisen eine sehr spezifische Absorption bei 280 nm auf, die eine direkte A280-Messung der Proteinkonzentration ermöglicht.
Die UV-Absorption bei 280 nm wird aufgrund ihrer Einfachheit, Benutzerfreundlichkeit und Erschwinglichkeit routinemäßig zur Schätzung der Proteinkonzentration in Labors verwendet. Die Messungen sind schnell und in hohem Maße reproduzierbar, da keine Inkubation erforderlich ist. Darüber hinaus erfordert diese Methode ein äußerst geringes Probenvolumen, da moderne Spektralphotometer während der Messung ein Probenrückhaltesystem verwenden.
Es sollte jedoch darauf geachtet werden, dass die Proteinprobe keine Nicht-Protein-Komponenten (z. B. Nukleinsäuren) mit demselben Absorptionsspektrum enthält, da dies zu falschen Ergebnissen führen kann. Neben der Bestimmung von Proteinkonzentrationen können Absorptionswerte auch zum Nachweis von Konformationsänderungen und Ligandenbindung sowie zur Verfolgung von Enzymreaktionen verwendet werden.
Der Einfluss von Tryptophan und Tyrosin bei der Proteinquantifizierung
Durch das Vorhandensein von Tyrosin und Tryptophan absorbieren Proteine und Peptide, die diese aromatischen Aminosäuren enthalten, UV-Licht bei einer Wellenlänge von 280 nm. Jeder dieser Reste hat unterschiedliche Absorptions- und Emissionswellenlängen und variiert in der Quantenausbeute. Phenylalanin und Disulfidbindungen tragen ebenfalls zur Absorption bei dieser Wellenlänge bei, aber da sie relativ unbedeutend sind, können sie nur in Abwesenheit von Tryptophan und Tyrosin beobachtet werden.
Viele enzymatische Cofaktoren, die aromatische Ringstrukturen enthalten (z. B. FMN, FAD, NAD und Porphyrine), absorbieren ebenfalls UV-Licht zur Anregung und tragen daher zur Intensität der resultierenden Fluoreszenz bei. Spezielle Proteine wie das Grün Fluoreszierende Protein haben auch eine interne Serinetyrosin-Glycin-Sequenz, die posttranslational modifiziert ist und im sichtbaren Lichtbereich fluoresziert.
Tryptophan
Tryptophan ist deutlich fluoreszierender als Tyrosin und Phenylalanin. Seine Fluoreszenzeigenschaften sind jedoch lösungsmittelabhängig, d. h. das Spektrum verschiebt sich zu kürzeren Wellenlängen und nimmt an Intensität zu, wenn die Polarität des Lösungsmittels abnimmt. So weisen Tryptophanreste, die in hydrophoben Domänen gefalteter Proteine vergraben sind, eine spektrale Verschiebung von 10 bis 20 nm auf.
Das Fluoreszenzspektrum eines Proteins, das die drei Aminosäuren enthält, ähnelt in der Regel dem von Tryptophan, da es ein größeres Absorptionsvermögen, eine höhere Quantenausbeute und einen Resonanzenergietransfer aufweist.
Tyrosin
Tyrosin kann bei ähnlichen Wellenlängen wie Tryptophan angeregt werden, emittiert aber bei einer deutlich anderen Wellenlänge. Tyrosin ist zwar weniger fluoreszierend als Tryptophan, kann aber ein bedeutendes Signal liefern, da es in vielen Proteinen in großer Zahl vorhanden ist. Es wurde beobachtet, dass die Fluoreszenz von Tyrosin durch das Vorhandensein von Tryptophananteilen in der Nähe gelöscht wird, entweder durch Resonanzenergietransfer oder durch die Ionisierung seiner aromatischen Hydroxylgruppe.
Hier sind einige wichtige Punkte zu beachten, wenn Peptide mit der A280-Methode gemessen werden.
- Proteine mit ähnlichem Molekulargewicht können aufgrund des unterschiedlichen Tryptophan- und Tyrosingehalts unterschiedliche Absorptionswerte aufweisen.
- Die UV-Absorption wird auch durch die Proteinstruktur beeinflusst. So können Bedingungen, die sich auf die Struktur auswirken (wie Temperatur, pH-Wert, Ionenstärke oder das Vorhandensein von Detergenzien), die Fähigkeit der aromatischen Reste, Licht bei 280 nm zu absorbieren, beeinflussen und den Wert des Extinktionskoeffizienten des Proteins verändern.
- Die lokale Umgebung der aromatischen Aminosäuren kann sich auf ihre Spektren auswirken. Das bedeutet, dass Tryptophan einen Emissionspeak bei niedrigeren Wellenlängen hat, wenn es in den hydrophoben inneren Bereichen eines Proteins vergraben ist, während Tyrosin seine Energie häufig auf benachbarte Tryptophan-Aminosäuren überträgt. Ionisiertes Tyrosinat, das sich bildet, wenn Protonen aus Tyrosin infolge eines steigenden pH-Wertes verloren gehen, zeigt ähnliche Wellenlängen wie Tryptophan.