Zwei Aminosäurereste bestimmen die 2-APB-Empfindlichkeit der Ionenkanäle TRPV3 und TRPV4

Ergebnisse

Identifizierung von Mutationen, die spezifisch die 2-APB-Reaktionen beeinflussen.

Wir untersuchten eine TRPV3-Maus-Mutantenbibliothek, die aus ≈14.000 cDNA-Konstrukten besteht, die durchschnittlich 2,5 Mutationen pro Klon tragen, die durch fehleranfällige PCR erzeugt wurden. Die Mutantenkonstrukte wurden in menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293) transfiziert, und die durch Hitze (42 °C), 25 μM 2-APB und 1,75 mM Campher hervorgerufenen Kalziumreaktionen wurden mit einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät (FLIPR) überwacht. Vor kurzem haben wir die Identifizierung von Resten beschrieben, die speziell für die TRPV3-Hitzeaktivierung erforderlich sind (20). Hier konzentrierten wir uns auf den 2-APB- und Kampfer-Datensatz, um Reste zu identifizieren, die spezifisch für chemische Reaktionen erforderlich sind.

Speziell wählten wir Klone aus, die normale Reaktionen auf eine Chemikalie zeigten, aber eine deutlich reduzierte Aktivierung durch die andere (Auswahlkriterien siehe Methoden). Positive Klone wurden ausgewählt, nachgewachsen und vollständige Dosis-Wirkungs-Kurven für jeden Stimulus gemessen sowie EC50-Werte berechnet (siehe Methoden). Sieben mutierte Klone wurden als spezifisch 2-APB-defizient bestätigt und sequenziert. Bemerkenswerterweise wiesen alle 7 Klone Mutationen in 1 von 2 Resten auf. Der erste, Histidin (H) 426, befindet sich in der zytoplasmatischen N-Terminus-Region, zwischen der Ankyrin- und der Transmembrandomäne. Wir haben im Screening 4 verschiedene Substitutionen von H 426 identifiziert (Tabelle 1). Die zweite, Arginin (R) 696, befindet sich in der C-terminalen zytoplasmatischen TRP-Box (IWRLQR), einer konservierten Domäne in TRP-Kanälen (2, 3). Die 3 Mutationen an diesem Rest haben die gleiche, eng verwandte Arginin-Lysin-Substitution. Alle 7 Mutationen verursachten schwere Defizite bei 2-APB-Reaktionen, ohne die Kampfer-Reaktionen zu beeinflussen (Tabelle 1). Obwohl auch einige Campher-defiziente Klone identifiziert wurden, handelte es sich dabei um relativ subtile Mutationen, die die EC50-Werte von Campher um das ≈2-Fache oder weniger verschoben (Daten nicht gezeigt). Aus diesem Grund konzentrierten wir uns in dieser Studie auf die 2 Reste, die spezifisch >10-fachen 2-APB-Mangel verursachen.

Initiale elektrophysiologische Charakterisierung von TRPV3-H426- und TRPV3-R696-Kanälen.

FLIPR ist eine indirekte Methode zur Messung der Ionenkanalaktivität. Um unsere FLIPR-Ergebnisse zu bestätigen, verwendeten wir die Patch-Clamp-Technik und maßen die Ganzzellströme von Wildtyp-Maus-TRPV3, TRPV3-H426N und TRPV3-R696K, wenn 2-APB (1 μM bis 3 mM) oder Kampfer (0,3 bis 20 mM) in niedrigen bis hohen Konzentrationen einzeln im Bad appliziert wurden (Abb. 1 und Abb. S1). Konzentrationsabhängig aktivierte 2-APB Ströme in HEK293-Zellen, die mit Wildtyp-TRPV3 transfiziert waren, mit durchschnittlichen EC50-Werten von 25,9 ± 0,3 (nHill = 2,3) und 36,8 ± 3.6 μM (nHill = 3,3) bei +100 bzw. -100 mV (Abb. 1A; Abb. S1A); 2-APB löste in HEK293-Zellen, die mit TRPV3-H426N transfiziert waren, bis zu 100 μM keine messbaren Ströme aus. Konzentrationen von 2-APB, die für Wildtyp-TRPV3 sättigend sind (0,3 bis 3 mM), waren jedoch in der Lage, Ströme in dieser Mutante in einer konzentrationsabhängigen Weise zu aktivieren (Abb. 1A; Abb. S1A). Folglich zeigte TRPV3-H426N eine >10-fache EC50-Verschiebung der 2-APB-abhängigen Aktivierung, und die Reaktion erreichte nie eine Sättigung. In parallelen Experimenten aktivierte Kampfer auch Ströme in HEK293-Zellen, die mit Wildtyp-TRPV3 transfiziert waren, in einer konzentrationsabhängigen Weise mit EC50-Werten von 6,7 ± 0,1 (nHill = 7,8) und 7,0 ± 0,1 mM (nHill = 8,4) bei +100 bzw. -100 mV. Wichtig ist, dass in HEK293-Zellen, die mit TRPV3-H426N transfiziert wurden, wildtypähnliche Reaktionen auf Kampfer beobachtet wurden, was bestätigt, dass die Kampferaktivierung in dieser Mutante unverändert ist (Abb. 1A; Abb. S1B).

In Patch-Clamp-Experimenten mit ganzen Zellen induzierte 2-APB auch eine minimale TRPV3-R696K-Aktivierung. Bei +100 mV begann 2-APB HEK293-Zellen, die diesen mutierten Kanal exprimieren, bei ≈3 μM zu aktivieren und erreichte die Sättigung bei 30 μM, mit einer EC50 von 10,0 ± 1,3 μM (nHill = 2,1). Höhere Konzentrationen von 2-APB (>30 μM) lösten einen desensibilisierenden Strom mit einer „Off-Response“ nach Auswaschen von 2-APB aus, ein Phänomen, das weiter unten ausführlich beschrieben wird. Bei -100 mV gelang es 2-APB jedoch nicht, die Kanäle der R696K-Mutante selbst bei 1 mM zu aktivieren (Abb. 1B; Abb. S1A). Die maximale 2-APB-Antwort bei 1 mM bei -100 mV betrug -2,3 ± 1,4 pA/pF (n = 6), was signifikant kleiner ist (>10-fach) als bei Wildtyp-TRPV3-Kanälen (-482,1 ± 69,2 pA/pF bei 300 μM, n = 17), was darauf hindeutet, dass die durch 2-APB hervorgerufene maximale Kanalantwort in der TRPV3-R696K-Mutante verringert ist. Kampfer aktivierte jedoch ähnliche Reaktionen in TRPV3- und TRPV3-R696K-transfizierten HEK293-Zellen (Abb. 1B; Abb. S1B). Daher bestätigten die ersten elektrophysiologischen Daten unsere Screening-Ergebnisse, dass TRPV3-H426N- und TRPV3-R696K-Mutanten nur unzureichend auf 2-APB ansprechen, ohne die Gesamtfunktion des Kanals zu beeinträchtigen, wie sie durch ihre Fähigkeit, auf Kampfer zu reagieren, getestet wurde.

Als nächstes fragten wir, welche Seitenketteneigenschaften von H426 und R696 für die TRPV3-Aktivierung durch 2-APB entscheidend sind. Wir haben die Positionen 426 und 696 einzeln zu allen anderen Aminosäuren mutiert und die FLIPR-Dosis-Wirkungs-Kurven sowohl für 2-APB als auch für Kampfer gemessen. Interessanterweise zeigten alle H426-Mutanten verminderte Reaktionen auf 2-APB mit einem starken (>10-fachen) Anstieg der EC50-Werte (Tabelle S1). Die meisten Mutanten reagierten normal auf Kampfer, mit Ausnahme der Helix-brechenden Prolin-Substitution, die eine ≈2fache Erhöhung der Kampfer-EC50 zeigte. Diese Daten stimmen mit den Ergebnissen unseres primären Screenings überein, bei dem 4 verschiedene Substitutionen identifiziert wurden, die zu einem 2-APB-Mangel an dieser Position führen. Mutierte Kanäle, die aromatische Seitenketten F, T und W tragen, reagierten weder auf Campher noch auf 2-APB. Die meisten R696-Mutanten zeigten jedoch reduzierte 2-APB-Antworten, aber auch verringerte maximale Campher-Antworten (20 mM), was darauf hindeutet, dass diese Mutationen die gesamte Kanalexpression oder -funktion beeinflussen (Tabelle S2). Dieses Ergebnis stimmt auch mit unserem ersten Ergebnis aus dem primären Screening überein, bei dem nur die Lysin-Substitution als spezifisch erforderlich für 2-APB an diesem Rest identifiziert wurde. R696F zeigte ebenfalls ein 2-APB-spezifisches Defizit, obwohl die maximalen Kampfer-Reaktionen leicht beeinträchtigt waren. Die Mutanten R696D, R696G, R696N, R696P, R696S und R696T zeigten im Vergleich zu mit pcDNA-Vektor transfizierten Zellen keine signifikanten Reaktionen auf 2-APB oder Campher.

Die spannungsabhängige Reaktion blieb bei den 2-APB-Mutanten intakt.

Die Spannungsabhängigkeit spielt nachweislich eine wichtige Rolle bei der Aktivierung und dem Gating von TRP-Kanälen (1, 10-12, 21). In Abwesenheit chemischer Stimulatoren (z. B. Kampfer oder 2-APB) aktivierten Spannungsschritte von -120 bis +180 mV (20 mV-Schritt) keine Ströme in HEK293-Zellen, die mit Wildtyp-TRPV3 transfiziert waren, was darauf hindeutet, dass TRPV3 (im Gegensatz zu TRPV1 und TRPM8) in dem hier getesteten Bereich nicht allein durch Spannung aktiviert wird (20, 22). In Gegenwart von 30 μM 2-APB wurde jedoch ein spannungsabhängiger Strom aktiviert (Abb. S2A). Wie erwartet, war bei TRPV3-H426N kein spannungsmodulierter Strom nachweisbar, wenn es mit 30 μM 2-APB behandelt wurde (Abb. S2B). 6 mM Kampfer evozierte jedoch einen spannungsabhängigen Strom in HEK293-Zellen, die Wildtyp-TRPV3 (V1/2 von 81,3 ± 2,6 mV) (Abb. S2 A und D) und TRPV3-H426N (V1/2 von 81,3 ± 2,5 mV) exprimieren (Abb. S2 B und D). Ähnlich wie bei TRPV3-H426N war auch bei TRPV3-R696K kein spannungsmodulierter Strom nachweisbar, wenn es mit 30 μM 2-APB behandelt wurde (Abb. S2C). Kampfer aktivierte jedoch einen spannungsabhängigen Strom mit einer V1/2 von 81,1 ± 5,4 mV (Abb. S2 C und D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Spannungsmodulation in TRPV3-H426N und TRPV3-R696K intakt ist, und implizieren, dass der Verlust der Spannungsabhängigkeit wahrscheinlich nicht die Ursache für die verminderten Reaktionen auf 2-APB in diesen mutierten Kanälen ist.

Temperaturempfindlichkeit von TRPV3-H426N und TRPV3-R696K.

Temperaturempfindlichkeit ist ein Markenzeichen der TRPV3-Kanalfunktion (14, 16, 23). Daher fragten wir, ob die Temperaturaktivierung in TRPV3-H426N- und TRPV3-R696K-Klonen verändert ist. Wir haben die Temperaturaktivierung (25 bis 42 °C) von HEK293-Zellen, die mit Wildtyp-TRPV3, TRPV3-H426N oder der TRPV3-R696K-Mutante transfiziert wurden, in einem FLIPR-Assay gemessen. Die Hitzereaktionen von TRPV3-H426N waren entweder gleich oder etwas größer als die von Wildtyp-TRPV3 (n = 4 Experimente), was darauf hindeutet, dass die 2-APB- und die Hitzereaktion voneinander getrennt werden können (Abb. S2E; und Daten nicht gezeigt). Allerdings waren die Hitzereaktionen bei TRPV3-R696K im Vergleich zum Wildtyp viel kleiner (n = 3 Experimente), was darauf hindeutet, dass diese Mutante die 2-APB-Aktivierung nicht spezifisch verändert (Abb. S2E).

Kalziumabhängige Desensibilisierung von TRPV3-R696K.

Ein interessantes Merkmal der 2-APB-Antwort in TRPV3-R696K-transfizierten HEK293-Zellen ist die schnelle Desensibilisierung bei >30 μM 2-APB und eine Off-Reaktion auf 2-APB bei hohen Konzentrationen (Abb. S3). Dieses Phänomen steht im Gegensatz zum Wildtyp-TRPV3, der auf wiederholte/kontinuierliche Stimulation durch Chemikalien oder Hitze sensibilisiert (14, 16). Als Mechanismus, der der TRPV3-Sensibilisierung zugrunde liegt, wird ein Verlust der Kalziumhemmung dieses Kanals angenommen (22). Da die Desensibilisierung der meisten anderen TRP-Kanäle (wie TRPV1 und TRPA1) auf chemische oder Temperaturreize ebenfalls von extrazellulärem Kalzium abhängt (24, 25), wollten wir testen, ob extrazelluläres Kalzium eine Rolle bei den durch 2-APB ausgelösten Desensibilisierungsreaktionen in TRVP3-R696K spielt. Überraschenderweise aktivierten 100 μM 2-APB in Abwesenheit von extrazellulärem Kalzium robuste, wildtypähnliche Ein- und Auswärtsströme in TRPV3-R696K (Stromdichte von TRPV3-R696K: 755.7 ± 200,0 pA/pF bei +100 mV, -641,2 ± 133,9 pA/pF bei -100 mV (n = 5); Wildtyp TRPV3: 615,0 ± 266,7 pA/pF bei +100 mV, und -471,0 ± 83,2 pA/pF bei -100 mV, n = 9) (Abb. S4 A und B). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der Austausch eines Arginins durch ein Lysin an Position 696 in der TRP-Box von TRPV3 den Kanal bei 2-APB-Stimulation in einen desensibilisierenden Zustand versetzt, nicht aber bei Campher-Stimulation in einer calciumabhängigen Weise. Ein mutmaßlich Ca2+-bindender Rest in der Porenschleifendomäne, Aspartat 641, ist bei allen TRPV-Kanälen konserviert und für die Permeationseigenschaften der TRP-Kanäle entscheidend (26, 27). Die Mutation von D641 zu Asparagin (N) verringert nachweislich die Rutheniumrot-Blockade und die hochaffine extrazelluläre Kalziumhemmung von TRPV3 und anderen TRP-Kanälen (17, 22, 26, 27). Daher untersuchten wir, ob die D641N-Mutation den TRPV3-R696K-Klon vom kalziumabhängigen Verlust der 2-APB-Reaktion befreien könnte. In einem FLIPR-Assay hatte TRPV3-D641N eine EC50 von 2,8 ± 1,3 μM (nHill = 0,7), was etwa der Hälfte des Wertes von Wildtyp-TRPV3 (5,7 ± 1,2 μM, nHill = 1,1) entspricht. Die Doppelmutante TRVP3-D641N/R696K hatte eine EC50 von 3,3 ± 1,1 μM (nHill = 1,1), was zeigt, dass die Mutation D641N die 2-APB-Reaktion von TRPV3-R696K vollständig wiederherstellt. Wie erwartet war die Reaktion auf Kampfer bei TRPV3, TRPV3-R696K, TRPV3-D641N und TRPV3-D641N/R696K ähnlich (Abb. S4 C und D). Diese Studien zeigen, dass TRPV3-R696 nicht nur eine 2-APB-Mutation ist. Die beobachteten Defizite sind Kalzium-vermittelt und betreffen 2-APB-, aber nicht Kampfer-Reaktionen.

Die 2-APB-Empfindlichkeit in TRPV3-Orthologen.

Aminosäure-Konservierungen und -Variationen zwischen Orthologen sind nützliche Werkzeuge, um die Struktur-Funktions-Beziehungen von Proteinen, einschließlich TRP-Kanälen, zu untersuchen (28, 29). Daher fragten wir, ob diese TRPV3-Orthologe vergleichbare Reaktionen auf Kampfer und 2-APB zeigen. Tatsächlich haben TRPV3-Kanäle von Mensch, Hund und Frosch, die Histidine an der der Maus entsprechenden Position 426 aufweisen (Abb. 2A), ähnliche 2-APB-Reaktionen, wenn sie in HEK293-Zellen überexprimiert werden (obwohl die Kampfer-Reaktionen in Xenopus tropicalis TRPV3 im Vergleich zu Wildtyp-Maus-TRPV3 vermindert waren) (Abb. 2C). Als H426 in Mensch, Hund und Frosch zu N mutiert wurde, verschoben sich die Konzentrations-Wirkungs-Kurven von 2-APB in jedem dieser TRPV3-Orthologe erwartungsgemäß stark nach rechts (Abb. 2B). Auch diese Mutation verringerte die Empfindlichkeit gegenüber Kampfer nicht im Vergleich zu Wildtyp-TRPV3-Orthologen (Abb. 2C). Im Gegenteil, sowohl die menschlichen als auch die Frosch-TRPV3-H426N-Mutanten wiesen eine etwas höhere Campher-Empfindlichkeit auf als ihre Wildtyp-Pendants. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der 2-APB-Aktivierungsmechanismus von TRPV3 in verschiedenen Spezies konserviert sein könnte.

Interessanterweise ist, obwohl R696 in der TRP-Box von TRPV3 zwischen allen Spezies konserviert ist, die Position, die Maus 426 in Huhn TRPV3 (cTRPV3) entspricht, ein N (427). Wie oben gezeigt, beeinträchtigt eine H-N-Substitution an der Position 426 bei Säugetieren und Amphibien die korrekte 2-APB-Reaktion (Abb. 2A). Der EC50-Wert von 2-APB in cTRPV3 beträgt 146,8 ± 3,4 μM (nHill = 2,5) im Vergleich zu 11,5 ± 3,5 μM (nHill = 1,1) für Maus-TRPV3, was darauf hindeutet, dass dieser Rest für die 2-APB-Reaktionen wichtig ist. Auffallend ist, dass die Mutation von N427 zu H die Konzentrations-Wirkungs-Kurve von 2-APB deutlich nach links verschob (EC50 von 6,1 ± 0,9 μM, nHill = 2,3), während der EC50-Wert für Campher unverändert blieb (Abb. 3A). Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen bestätigten, dass die Konzentrations-Wirkungs-Kurve für 2-APB im Huhn TRPV3-N427H im Vergleich zum Wildtyp cTRPV3 sowohl bei +100 als auch bei -100 mV stark nach links verschoben war (Abb. 3B). Einzelkanalaufzeichnungen zeigten eine fast 200-fache Erhöhung der Kanalöffnungen gegenüber dem Basalwert durch 25 μM 2-APB in Inside-Out-Patches von cTRPV3-N427H-exprimierenden Zellen (n = 7), während in Inside-Out-Patches von Wildtyp-cTRPV3-exprimierenden HEK293-Zellen (n = 5) keine signifikanten Veränderungen beobachtet wurden. 6 mM Kampfer erhöhte jedoch die Einzelkanalöffnungen in Inside-Out-Patches von HEK293-Zellen, die entweder mit cTRPV3 vom Wildtyp oder mit der cTRPV3-N427H-Mutante transfiziert waren, in ähnlichem Maße (Abb. 3 C-E). Somit erhöht eine einzige Punktmutation in TRPV3 vom Huhn spezifisch dessen Empfindlichkeit gegenüber 2-APB.

Die 2-APB-Empfindlichkeit in verwandten ThermoTRPs: TRPV1, TRPV2 und TRPV4.

Säugetier-TRPV3 ist eng verwandt mit TRPV1 (39 % Aminosäurehomologie), TRPV2 (36 % Homologie) und TRPV4 (38 % Homologie). Interessanterweise ist 2-APB ein gemeinsamer Agonist von TRPV1, TRPV2 und TRPV3, aber nicht von TRPV4 (18). Daher stellten wir uns die Frage, ob es einen gemeinsamen Mechanismus für die Wirkung von 2-APB auf diese verwandten Ionenkanäle gibt. Die äquivalente Position von TRPV3 His-426 der Maus ist N in TRPV1 (N419), TRPV2 (N379) und TRPV4 (N456) (Abb. 4A; Abb. S5A). Die äquivalente Position des Maus-TRPV3 R696 in der TRP-Box ist auch R (R701) in TRPV1, ein konserviertes Lysin (K664) in TRPV2 und ein nicht geladenes Tryptophan (W737) in TRPV4 (Abb. 4A; Abb. S5A).

Wir konzentrierten uns auf den N-terminalen H-Rest, der speziell für korrekte 2-APB-Reaktionen bei TRPV3 von Säugetieren und Amphibien erforderlich ist, und eine N-zu-H-Mutation an diesem Rest reicht aus, um robuste 2-APB-Reaktionen in TRPV3 von Hühnern zu induzieren. Die Wildtypen TRPV1 und TRPV2 tragen Ns an der gleichen Position wie TRPV3 H426, zeigen jedoch robuste Reaktionen auf 2-APB. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass TRPV1 und TRPV2 auf 2-APB durch andere Mechanismen reagieren als TRPV3. Nichtsdestotrotz haben wir getestet, ob die Einführung eines H an dieser Position die 2-APB-Reaktionen von TRPV2 und TRPV1 spezifisch beeinflusst. Die TRPV1-N419H-Mutante zeigte verstärkte Reaktionen sowohl auf 2-APB als auch auf Capsaicin, was auf eine unspezifische Wirkung auf die Kanalexpression oder -funktion hinweist (Abb. S5B). Die entsprechende TRPV2-N379H-Mutante zeigte im Vergleich zum Wildtyp-TRPV2 ähnliche Reaktionen auf 2-APB und Probenecid (ein weiterer TRPV2-Agonist) (Abb. S5C) (30). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Mechanismus der 2-APB-Aktivierung von TRPV2 und TRPV1 nicht vollständig mit dem von TRPV3 konserviert ist (siehe Diskussion).

Wir stellten uns dann die Frage, ob die äquivalenten Reste von TRPV3-H426 und R696 für das Fehlen von 2-APB-Antworten in TRPV4 verantwortlich sind. Um diese Frage zu klären, mutierten wir die äquivalenten Aminosäurereste an N456 und W737 in TRPV4 zu H bzw. R (Abb. 4A). Wildtyp-TRPV4 und TRPV4-W737R zeigten im Vergleich zu vektortransfizierten Kontrollen nur geringe 2-APB-Reaktionen (Abb. 4B). Bemerkenswert ist jedoch, dass HEK293-Zellen, die mit TRPV4-N456H transfiziert wurden, auf 2-APB mit einer EC50 von 131,0 ± 3,3 μM (nHill = 2,4) reagierten. TRPV4 mit der Doppelmutation N456H/W737R reagierte sogar noch stärker auf 2-APB, mit einer EC50 von 10,0 ± 0,8 μM (nHill = 1,2) (nahe dem Wert von Wildtyp-Maus-TRPV3) (Abb. 4B). Die Reaktionen auf den TRPV4-Agonisten 4-α-PDD unterschieden sich nicht signifikant zwischen Wildtyp-TRPV4 und allen TRPV4-Mutanten, was darauf hindeutet, dass die erhöhten 2-APB-Reaktionen nicht auf eine erhöhte TRPV4-Expression oder einen allgemeinen Funktionsgewinn zurückzuführen sind (Abb. 4B). Aufzeichnungen in exzidierten Inside-Out-Patches, die TRPV4, TRPV4-N456H, TRPV4-W737R oder TRPV4-N456H/W737R exprimieren, zeigten eine Einzelkanalaktivität durch 150 μM 2-APB sowohl in TRPV4-N456H als auch in TRPV4-N456H/W737R, wobei letztere robustere Reaktionen zeigten (Abb. S6 B und C). Bei Wildtyp-TRPV4 und TRPV4-W737R wurde keine 2-APB-aktivierte Einzelkanalaktivität beobachtet (Abb. S6A; und Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Unterschiede an den 2 Aminosäureresten, die in unserem Screening identifiziert wurden, für die fehlende 2-APB-Empfindlichkeit von TRPV4 verantwortlich sind.