Diagnostic power of laboratory tests for hereditary spherocytosis: a comparison study in 150 patients grouped according to molecular and clinical characteristics

Abstract

Taustaa Perinnöllisen sferosytoosin laboratoriodiagnostiikka perustuu tavallisesti NaCl-pohjaisiin tai glyserolipohjaisiin punasolujen osmoottisen haurauskyvyn testeihin; hiljattain on ehdotettu suoraan perinnöllisen sferosytoosin molekyyliseen vikaan kohdistuvaa testiä (eosiini-5′-maleimidinsitoutumistesti). Mikään käytettävissä olevista testeistä ei tunnista kaikkia perinnöllisen sferosytoosin tapauksia.Suunnittelu ja menetelmät Vertailimme eosiini-5′-maleimidisidostestin, NaCl-osmoottisen haurauskyvyn tutkimisen tuoreella ja inkuboidulla verellä, glyserolilyysitestin, happamoitetun glyserolilyysitestin ja Pink-testin suorituskykyä 150:llä perinnöllistä sferosytoosia sairastavalla potilaalla, jotka oli ryhmitelty kliinisen fenotyypin ja proteiinivirheen mukaan, lopullisena tavoitteena löytää testien yhdistelmä, jolla on suurin diagnostinen teho myös lievimmissä perinnöllisen sferosytoosin tapauksissa.Tulokset Eosiini-5′-maleimidisidostestin herkkyys oli 93 % ja spesifisyys 98 % perinnöllisen sferosytoosin toteamisessa: herkkyys oli riippumaton molekyylivirheen tyypistä ja määrästä sekä kliinisestä fenotyypistä. Happamoitetun glyserolin lyysitesti ja Pink-testi osoittivat vertailukelpoista herkkyyttä (95 % ja 91 %). NaCl-osmoottisen herkkyystestin, jota pidetään yleisesti kultaisena standardina perinnöllisen sferosytoosin diagnosoinnissa, herkkyys oli 68 % tuoreella verellä ja 81 % inkuboidulla verellä, ja se laski edelleen kompensoituneissa tapauksissa (53 % ja 64 %). Eosiini-5′-maleimidisidostestin ja happaman glyserolilyysitestin yhdistelmän avulla voitiin tunnistaa kaikki perinnöllistä sferosytoosia sairastavat potilaat. Eosiini-5′-maleimidisidontatesti osoitti suurinta tautispesifisyyttä.Johtopäätökset Kukaan testityyppi ei pysty diagnosoimaan joitakin perinnöllisen sferosytoosin tapauksia. Eosiini-5′-maleimidisidontatestin ja happamoitetun glyserolilyysitestin yhdistelmä mahdollisti kaikkien perinnöllistä sferosytoosia sairastavien potilaiden tunnistamisen tässä sarjassa, ja näin ollen se edustaa nykyisin tehokasta diagnoosistrategiaa perinnöllisen sferosytoosin diagnosoimiseksi, myös lievissä/kompensoiduissa tapauksissa.

Esittely

Perinnöllinen sferosytoosi on yleisin synnynnäinen hemolyyttinen anemia valkoihoisilla, ja sitä sairastaa noin 1 henkilö 1000-2000:sta1,2 . Molekyylinen vika on hyvin heterogeeninen ja koskee spektriiniä, ankyriinia, bändi 3:a ja proteiinia 4 koodaavia geenejä.2,3 Hemolyysin aste vaihtelee suuresti täysin kompensoituneesta verensiirroista verensiirroista riippuvaiseen anemiaan.

Tyypillinen laboratoriotutkimuksissa todettava perinnöllisen sferosytoosin tunnusmerkki, vaikkei se olekaan spesifinen, on sferosyyttien esiintyminen perifeerisessä verikokeessa, ja ne ovat havaittavissa 97 %:lla potilaista.4 Joillakin potilailla sferosyyttejä voi kuitenkin olla hyvin vähän4,5 , minkä vuoksi niiden havaitseminen edellyttää ammattitaitoa; lisäksi punasolujen mikroskooppinen tutkiminen jää yhä useammin pois laboratorioautomaation aikakaudella. Perinnöllisen sferosytoosin laboratoriodiagnostiikka perustuu sen vuoksi yleensä testeihin, joissa hyödynnetään pinta-alan ja tilavuuden suhdetta, joka on tyypillisesti pienempi pallomaisissa erytrosyyteissä, erityisesti punasolujen osmoottiseen haurauteen liittyviin testeihin, jotka tehdään eri natriumkloridipitoisuuksilla (NaCl) tuoreessa ja inkuboidussa veressä6 , sekä testeihin, joissa mitataan puskuroidussa glyseroliliuoksessa suspendoitujen punaisten verirakkuloiden lyysauksen laajuutta tai nopeutta, esim.glyserolilyysitesti (GLT)7 , happamoitunut glyserolilyysitesti (AGLT)8 ja Pink-testi9 . Näillä testeillä ei kuitenkaan havaita vaihtelevaa osaa perinnöllisen sferosytoosin tapauksista, varsinkaan lievimpiä tapauksia6,10-12 , eikä niillä voida erottaa perinnöllistä sferosytoosia sekundaarisesta sferosytoosista, joka liittyy muihin sairauksiin, lähinnä autoimmuuniperäisiin hemolyyttisiin anemioihin13 .-15

Viime aikoina on ehdotettu uusiksi menetelmiksi perinnöllisen sferosytoosin tunnistamiseksi kryohemolyysi-testiä,16,17 joka perustuu havaintoon, jonka mukaan perinnöllistä sferosytoosia sairastavien potilaiden punasolut ovat erityisen herkkiä jäähdytykselle 0 °C:n lämpötilassa hypertonisissa olosuhteissa, ja virtaussytometristä analyysia eosiini-5′-maleimidilla leimatuista ehjistä punasoluista (EMA-sitoutumistesti)18 . 19 Erityisesti jälkimmäinen on osoittautunut herkäksi ja spesifiseksi perinnöllisen sferosytoosin diagnostiseksi testiksi12,18,20-29, joka kohdistuu suoraan tämän taudin rakenteelliseen vaurioon, koska fluoresoiva koetin, eosiini-5′-maleimidi, on vuorovaikutuksessa proteiinibändi-3-kompleksin kanssa.30

Käytettävissä olevien suorien tai epäsuorien diagnostisten testien suorituskyky on useimmiten arvioitu yksilöllisesti ja rajallisella määrällä tapauksia. Testien herkkyys vaihtelee suuresti, ja kukin menetelmä epäonnistuu useiden perinnöllistä sferosytoosia sairastavien potilaiden tunnistamisessa.4,6,12 Tässä tutkimuksessa verrattiin EMA-sitoutumisen, tuoreen ja inkuboidun veren NaCl:n aiheuttaman osmoottisen haurausherkkyyden, GLT-, AGLT- ja Pink-testien suorituskykyä 150:llä perinnöllistä sferosytoosia sairastavalla potilaalla, jotka oli ryhmitelty kliinisen fenotyypin ja molekulaarisen vaurion mukaan, ja lopullisena tavoitteena oli löytää testien yhdistelmä, jolla on suurin diagnostinen teho perinnöllisen sferosytoosin diagnosoinnissa, mukaan luettuina lievät tapaukset, jotka ovat tavallisesti vaikeita diagnosoida.

Suunnittelu ja menetelmät

Koehenkilöt

Tutkittiin sataviisikymmentä peräkkäistä perinnöllistä sferosytoosia sairastavaa potilasta (79 miestä ja 71 naista, mediaani-ikä 26 vuotta, vaihteluväli 0-79 vuotta), jotka kuuluivat 128:aan toisiinsa liittymättömään perheeseen. Tutkimushetkellä 22 potilasta oli splenektomoitu ja 128 potilasta ei ollut splenektomoitu.

Kaikille potilaille tehtiin kliininen ja fyysinen arviointi sekä seuraavat laboratoriokokeet: täydellinen verenkuva, veren preparaattitutkimus, retikulosyyttien määrä, bilirubiini- ja haptoglobiinipitoisuuden määritykset, rautatilanteen arviointi, suora antiglobuliinitesti (DAT), epänormaalien tai epästabiilien hemoglobiinien seulonta, NaCl-osmoottinen haurastuvuuskoe tuoreelle ja inkuboidulle verenkuvalle, GLT- ja AGLT-testit, vaaleanpunaiset testitulokset (Pink-koe) ja EMA-sitoutumistesti. Joissakin tapauksissa tutkittiin tärkeimpien glykolyyttisten ja pentoosifosfaattiradan entsyymien aktiivisuutta. Muutamille potilaille tehtiin myös mitogeenistimuloitu DAT31, jotta voitiin sulkea pois DAT-negatiivisen hemolyyttisen anemian diagnoosi.

Hereditaarinen sferosytoosi diagnosoitiin kroonisen hemolyysin kliinisten ja laboratorio-oireiden, sferosyyttien esiintymisen perifeerisen veren preparaattitutkimuksessa, vähintään yhden punasolujen fragiliteettitestin positiivisuuden, mahdollisen perinnöllisen sferosytoosin suvussa esiintyvän anamneesin ja sekundaarisen sferosytoosin muiden syiden poissulkevan vaikutuksen perusteella.19 Anemia määriteltiin vaikeaksi (Hb<8 g/dl), keskivaikeaksi (Hb 8-10 g/dl), lieväksi (Hb>10 ja <11,5 g/dl naisilla ja Hb>10 ja <13,5 g/dl miehillä) ja kompensoiduksi (Hb>11,5 g/dl naisilla ja >13,5 g/dl miehillä).

Kaikilta potilailta otetuille näytteille tehtiin natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) punasolukalvoproteiinien analysoimiseksi, ja ne jaettiin sen mukaan, oliko kyseessä bändin 3, spektriinin tai ankyriinin puutos, yhdistetty spektriini- ja ankyriinipuutos vai ei havaittavaa puutosta.4

Viisisataa seitsemänkymmentäviisi tervettä verenluovuttajaa ja 84 tapausta, joilla oli muu hemolyyttinen anemia kuin perinnöllinen sferosytoosi (17:llä autoimmuunihemolyyttinen anemia, 10:llä punasoluentsyymihäiriö, 10, joilla oli perinnöllinen elliptosytoosi, 15, joilla oli synnynnäinen dyserytropoieettinen anemia, 9, joilla oli paroksismaalinen yöllinen hemoglobinuria, 3, joilla oli stomatosytoosi, 3, joilla oli mekaaninen anemia, ja 17, joilla oli tuntemattomasta syystä johtuva anemia).

Hematologiset määritykset

Perifeerinen veri kerättiin potilailta ja kontrolleilta diagnostisten toimenpiteiden aikana sen jälkeen, kun oli saatu tietoon perustuva suostumus ja hyväksyntä laitoksen ihmistutkimuskomitealta. Noudatetut menettelyt olivat Helsingin kansainvälisten ihmiskokeita koskevien eettisten standardien mukaisia. Suurin osa näytteistä kerättiin laitoksessamme; muista keskuksista kerätyt näytteet lähetettiin 4 °C:n lämpötilassa, ja ne käsiteltiin aina 24 tunnin kuluessa. Kenellekään potilaalle ei ollut tehty verensiirtoa tutkimusta edeltävien 3 kuukauden aikana. Hematologiset parametrit määritettiin automaattisella hematologisella analysaattorilla (Automatic Beckman Coulter LH-750, CA, USA). Rutiininomaiset hematologiset tutkimukset tehtiin Dacie & Lewisin mukaan.32 Bilirubiini-, haptoglobiini- ja ferritiinipitoisuudet määritettiin Integra 800 -mittarilla (Roche, Mannheim, Saksa). Perifeerisen veren sferosyyttien määrän arvioi kaksi riippumatonta ja asiantuntevaa operaattoria. Punasolujen osmoottinen hauraus arvioitiin suorittamalla NaCl-osmoottinen haurauskoe sekä tuoreelle että inkuboidulle verelle,6 standardi GLT,7 AGLT8 ja Pink-testi9 kunkin potilaan näytteille.

EMA-sidontakoe suoritettiin Kingin ym.18 kuvaamalla tavalla pienin muutoksin. Erityisesti fluoresenssin intensiteetti, ilmaistuna kanavan fluoresenssin mediaanina, määritettiin 10 000 tapahtumalle FL-1-kanavassa Becton Dickinson FACSCanto II -virtaussytometrillä (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). EMA-väriaineen kantaliuos varastoitiin pieninä annoksina -80 °C:ssa 6 kuukauden ajan. Testi suoritettiin kerran viikossa ryhmittelemällä kaikki tapaukset samalle päivälle25 sen jälkeen, kun tulosten toistettavuus oli varmistettu verinäytteillä, jotka oli säilytetty jopa 6 päivää 4 °C:ssa.

Tutkimuksen sisäisen vaihtelun vähentämiseksi potilaiden näytteitä verrattiin kuuden normaalin kontrollin näytteisiin. Tulokset ilmaistiin potilasnäytteen fluoresenssin vähenemisen prosenttiosuutena verrattuna kuuden normaalikontrollin keskimääräiseen fluoresenssiin Girodonin ym. ehdottamalla tavalla.25 Logistiseen regressioanalyysiin perustuvaa vastaanottimen toimintaominaiskäyrää (ROC) käytettiin määrittämään perinnöllistä sferosytoosia sairastavilta potilailta saatujen arvojen ja normaaleilta yksilöiltä saatujen arvojen välinen optimaalinen rajaarvo. ROC-käyräanalyysin mukaan optimaalinen fluoresenssin vähenemä, joka erottaa normaalit henkilöt perinnöllistä sferosytoosia sairastavista potilaista, oli 11 prosenttia. Näissä olosuhteissa testin spesifisyys 575 terveellä koehenkilöllä laskettuna oli 98 %.

Punasolujen haamut valmistettiin 24 tunnin kuluessa verinäytteenotosta käyttäen Dodgen ym.33 kuvaamaa menetelmää pienin muutoksin.4 Punasolujen kalvoproteiinit analysoitiin 15 päivän kuluessa haamujen valmistuksesta SDS-PAGE:lla käyttäen 4-12 %:sta 12 %:iin nousevaa akryyliamidigradienttia Fairbanksin ym.34 mukaan ja Laemmlin35 epäjatkuvapohjaista puskurisysteemiä käyttäen 6-14 %:iin nousevaa suoraviivaista akryyliamidigradienttia aiemmin kuvatulla menetelmällä.4 Glykolyyttisten ja pentoosifosfaattireittien entsyymien aktiivisuudet määritettiin Beutlerin kuvaamilla menetelmillä.36

Tulokset

Taulukossa 1 esitetään perinnöllistä sferosytoosia sairastavien potilaiden hematologiset ja biokemialliset tiedot ryhmiteltynä sen mukaan, oliko heitä ei oltu splenektomoitu vai oliko heidät oltu leikattu splenektomoituna ennen tutkimusajankohtaa ja kliinisen fenotyypin mukaan (vain splenektomoimattomissa olevilla potilailla). Suurimmalla osalla splenektomoimattomista tutkittavista hemolyysi oli lievää tai kompensoitua; 18 prosentilla oli hyvin vähän sferosyyttejä (≤3 %). Yleisimmät proteiinipoikkeavuudet olivat spektriini- ja band 3 -puutokset sekä splenektomoimattomilla että splenektomoiduilla potilailla. Kalvoproteiinivirhettä ei voitu osoittaa yhdeksällä (7 %) ei-splenektomoidulla henkilöllä, joista seitsemällä oli positiivinen perinnöllisen sferosytoosin sukuhistoria; lopuilla kahdella esiintyi lievää anemiaa, retikulosytoosia ja 5 % sferosyyttejä ilman muita kroonisen hemolyyttisen anemian syitä.

Taulukossa 2 verrataan perinnöllisen sferosytoosin diagnostisten laboratoriokokeiden herkkyyttä. EMA-sitoutumisella ei pystytty tunnistamaan 10/150 (7 %) tapausta (4:llä oli bändi 3:n puutos, 5:llä spektriinin puutos ja 1:llä havaitsematon vika). Fluoresenssin keskimääräinen lasku oli 27 % ± 10 % perinnöllistä sferosytoosia sairastavilla potilailla verrattuna 0 % ± 8 % vertailuhenkilöillä (P<0,001). Fluoresenssin prosentuaalinen väheneminen oli suoraan yhteydessä sferosyyttien lukumäärään ja epäsuorasti keskimääräiseen korpuskulaariseen tilavuuteen; korrelaatiota hemoglobiinipitoisuuden, retikulosyyttien absoluuttisen lukumäärän tai punasolujakauman leveyden kanssa ei havaittu. Testin herkkyys oli riippumaton molekyylivian tyypistä ja määrästä, vaikkakin se oli hieman alhaisempi potilailla, joilla oli havaitsematta jäänyt vika ja joilla fluoresenssin mediaanin lasku oli pienin (15 % verrattuna 30 %:iin bändi 3:n ja 28 %:iin spektriinin puutoksessa). On syytä huomata, että EMA-sitoutumistestin herkkyys oli hieman korkeampi splenektomoituneilla kuin ei-splenektomoituneilla potilailla (kuva 1).

Tutkittujen eri punasolujen haurausmääritysten herkkyys oli hyvin vaihteleva ja yleensä korkeampi splenektomoituneilla kuin ei-splenektomoituneilla perinnöllisen ferosytoosin potilailla ja alhaisempi (lukuun ottamatta AGLT-testiä) potilailla, joilla oli havaitsematon vika, kuin potilailla, joilla oli havaittavissa oleva vika (taulukko 2A). NaCl-osmoottisen haurauskokeen herkkyys oli suurempi, kun se tehtiin inkuboidulle verelle kuin tuoreelle verelle. Kaiken kaikkiaan NaCl-osmoottisen haurauskyvyn testeillä (sekä tuoreella että inkuboidulla verellä) oli alhaisempi herkkyys kuin yleisemmin käytetyillä glyserolipohjaisilla testeillä. Näistä jälkimmäisistä testeistä AGLT:n herkkyys oli korkein, myös niissä tapauksissa, joissa vikoja ei ollut havaittu, ja se oli verrattavissa EMA-sitoutumistestin herkkyyteen.

Taulukko 1. Perinnöllistä sferosytoosia sairastavien potilaiden hematologiset ja biokemialliset tiedot ryhmiteltynä sen mukaan, oliko potilaille tehty splenektomia vai ei.

Kaikki perinnöllistä sferosytoosia sairastavat potilaat olivat positiivisia vähintään kahdessa eri testissä lukuun ottamatta kahta potilasta (1 potilaalla, jolla oli bändi 3:n puutos, ja 1 potilaalla, jolla oli spektriinin puutos), jotka olivat positiivisia vain EMA:ta sitovassa testissä. Havaitsimme, että EMA:n ja AGLT:n yhdistelmä mahdollisti kaikkien perinnöllistä sferosytoosia sairastavien potilaiden tunnistamisen (taulukko 2B). Erityisesti 133/150 (88 %) perinnöllistä sferosytoosia sairastavista oli EMA-positiivisia ja AGLT-positiivisia, 7/150 (5 %) EMA-positiivisia ja AGLT-negatiivisia ja 10/150 (7 %) EMA-negatiivisia ja AGLT-positiivisia.

Kun eri testien suorituskykyä analysoitiin splenektomoimattomilla potilailla kliinisen fenotyypin funktiona, EMA-sitoutuminen, AGLT- ja Pink-testi säilyttivät korkean herkkyyden eri kliinisissä alaryhmissä, kun taas NaCl-osmoottisen haurauskokeen herkkyys tuoreessa veressä ja inkubaation jälkeen laski selvästi kompensoiduissa tapauksissa (kuva 1).

Kuvassa 2 on esitetty eri testien tulokset 84 potilaalla, joilla oli muita hemolyyttisiä sairauksia kuin perinnöllinen sferosytoosi. EMA-sitoutuminen osoitti suurempaa tautispesifisyyttä ollen negatiivinen kaikilla potilailla, joilla oli autoimmuunihemolyyttinen anemia, jopa silloin, kun esiintyi merkittävää sferosytoosia.

Keskustelu

Tämä on ensimmäinen laaja vertailututkimus nykyisin käytetyimmistä laboratoriomenetelmistä perinnöllisen sferosytoosin diagnosoimiseksi, ja se on tehty suurella joukolla potilaita, jotka on ryhmitelty molekyylisen defektin, hemolyysin voimakkuuden ja pernan esiintymisen tai puuttumisen mukaan. Koska puolet tutkituista potilaista kärsi lievästä/kompensoidusta anemiasta ja oli näin ollen vaikeampi diagnosoida ja koska 18 prosentilla potilaista oli hyvin vähän sferosyyttejä perifeerisen veren näytteessä, tutkittu populaatio soveltuu erityisen hyvin herkkyystutkimuksiin. Emme ottaneet kryohemolyysitestiä17 mukaan tähän tutkimukseen, koska perinnöllisen sferosytoosin punasolujen jäähdytysherkkyyden perusteita ei ole toistaiseksi selvitetty ja mielipiteet sen rutiinikäytöstä perinnöllisen sferosytoosin diagnostiikassa ovat ristiriitaisia.4,5,16,17,19,37,38.

Taulukko 2. (A) Yksittäisten testien herkkyys perinnöllistä sferosytoosia (HS) sairastavilla potilailla, jotka on ryhmitelty biokemiallisen vian mukaan. (B) Yhdistettyjen testien herkkyys kaikilla HS-tapauksilla. Luku edustaa positiivisten tapausten ja kokonaistapausten suhdetta, suluissa prosenttiarvot.

Kuvio 1. Eri diagnostisten testien herkkyys 22:lla splenektomoidulla ja 128:lla splenektomoimattomalla potilaalla, joilla oli perinnöllinen sferosytoosi (HS). HS:ää sairastavat ei-splenektomoidut potilaat jaettiin kliinisen fenotyypin mukaan.

Huomioon otetuista diagnostisista menetelmistä kiinnostavin on varmasti hiljattain ehdotettu EMA-sitoutumistesti, jota erikoislaboratoriot käyttävät yhä useammin korkean herkkyytensä ja spesifisyytensä vuoksi.12,18,23-29 Tämä menetelmä kohdistuu suoraan taudin rakenteellisiin vaurioihin, sillä fluoresoiva koetin eosiini-5′-maleimidi on vuorovaikutuksessa transmembraaniproteiinien band 3, Rh-proteiinin, Rh-glykoproteiinin ja CD47:n kanssa, jotka ovat vähentyneet perinnöllistä sferosytoosia sairastavien potilaiden punasoluissa;30 muiden sytoskelettiproteiinien, kuten spektriinin ja proteiini 4:n, puutteet.2, aiheuttavat myös fluoresenssin voimakkuuden vähenemisen, todennäköisesti siksi, että ne aiheuttavat pitkän kantaman modulaatiovaikutuksen väriaineen sitoutumiskohtaan kaistan 3 proteiinissa.39 EMA-sitoutumistestin herkkyys on tässä sarjassa korkeampi kuin Crispin ym. hiljattain raportoima herkkyys,12 ja samankaltainen kuin mitä muut ovat havainneet;18,23-29 lisäksi testin suorituskyky näyttää olevan riippumaton punasolukalvoproteiinien puutostyypistä, ja se heikkenee vain hieman perinnöllistä pallosytoosia sairastavilla potilailla, joilla vikaa ei ole havaittavissa, mikä on samansuuntaista kuin Kingin ym. ja Girodonin ym. havainnot.25 Mielenkiintoista on se, että herkkyys on riippumaton kliinisestä ilmiötyypistä, ja että se on korkealla tasolla myös potilailla, joilla on kompensoitu anemia. Erillinen analyysi splenektomoimattomista ja splenektomoituneista potilaista, joilla on perinnöllinen ferosytoosi, osoitti, että herkkyys lisääntyi jälkimmäisessä ryhmässä, mikä on yleisesti ottaen yhteinen havainto kaikille tutkituille testeille; tämä havainto osoittaa, että potilaiden kliiniset ominaisuudet on määriteltävä tarkasti, kun testataan perinnöllisen ferosytoosin diagnostiikkamenetelmien suorituskykyä, ja että analyysi on mahdollisesti rajoitettava koskemaan vain splenektomoimattomia potilaita. EMA-sitoutumistestin etuna on myös se, että kuljetus tai varastointi ei vaikuta tuloksiin kuuteen päivään asti, kuten kuvasta 3 käy ilmi, mikä mahdollistaa näytteiden kuljetuksen, kuten Girodon ja muut raportoivat.25 Lisäksi äskettäiset verensiirrot eivät vaikuta tuloksiin, koska menetelmä erottaa toisistaan erilaiset punasolupopulaatiot.20

Kuvio 2. Yksittäisten diagnostisten testien tulokset potilailla, joilla on muita hemolyyttisiä anemioita kuin perinnöllinen sferosytoosi (HS), verrattuna potilaisiin, joilla on HS. Tummennettu alue edustaa normaaleja vertailuvälejä. CDA: synnynnäinen dyserytropoieettinen anemia; AIHA: autoimmuuninen hemolyyttinen anemia; HE: perinnöllinen elliptosytoosi; PNH: paroxysmal noctural hemoglobinuria

NaCl-osmoottisen haurauskyvyn testien osalta havaitsimme, että ne eivät tunnistaneet lähes neljäsosaa potilaista, joilla oli perinnöllinen sferosytoosi, mikä vahvistaa muiden tutkijoiden tulokset,12,13,19,40,41 ja että niiden herkkyys oli yleisesti ottaen alhaisempi kuin muiden diagnostisten laboratoriotestien herkkyys, jotka arvioitiin tässä sarjassa. Tästä huolimatta inkuboitua NaCl-osmoottista haurautta pidetään edelleen yleisesti kultaisena standardina perinnöllisen sferosytoosin diagnosoinnissa potilailla, joilla on Coombsin negatiivinen hemolyyttinen anemia5,11,42 . Kirjallisuuden analyysi paljastaa, että tämän testin herkkyyttä koskevia järjestelmällisiä tutkimuksia ei ole aikaisemmin tehty ja että väite, jonka mukaan se on paras menetelmä perinnöllisen sferosytoosin diagnosoimiseksi, perustuu tutkimuksiin, jotka on tehty rajallisella määrällä potilaita, joiden kliiniset ominaisuudet eivät ole selkeästi määriteltyjä; lisäksi NaCl-osmoottisen haurauskäyrien tulkinta voi olla vaikeaa vähemmän tyypillisissä tapauksissa.8. Tässä sarjassa tarkasteltujen potilaiden suuri määrä mahdollisti sen, että NaCl-osmoottisen haurauskyvyn testin suorituskykyä voitiin suhteuttaa taudin kliiniseen ilmenemiseen: havainto siitä, että kompensoituneessa perinnöllisessä sferosytoosissa osmoottisen haurauskyvyn testien herkkyys laski lähes 60 prosenttiin, mikä on paljon enemmän kuin Koronesin & Pearsonin raportoima arvo13 , rajoittaa entisestään tämän menetelmän käyttökelpoisuutta kaikkein lievimmissä ja epätyypillisimmissä tapauksissa. Tämän vahvistaa myös havainto, että herkkyys laskee 30 prosenttiin perinnöllistä sferosytoosia sairastavilla potilailla, joilla ei ole havaittavissa olevaa biokemiallista vikaa.

Glyserolipohjaiset punasolujen fragiliteettitestit ovat alkuperäistä versiota GLT:tä lukuun ottamatta herkempiä kuin NaCl-osmoottinen fragiliteettitesti; erityisesti AGLT:n herkkyys oli tässä testisarjassa 95 %, mikä on samankaltainen kuin muiden havaintojen mukaan1,15,43,44 ja korkeampi kuin Cynoberin ym. raportoima herkkyys.10 ja Bucx ym.45 AGLT:n herkkyys oli korkea myös kompensoiduissa tapauksissa ja tapauksissa, joissa biokemiallista vikaa ei ollut havaittu. Lisäksi on syytä huomata, että AGLT tunnisti kymmenen EMA-negatiivista perinnöllisen sferosytoosin tapausta.

EMA-sitoutumisen ja AGLT:n yhdistäminen mahdollisti kaikkien tässä sarjassa esiintyneiden perinnöllisen sferosytoosin tapausten tunnistamisen; koska virtaussytometriä ei ole saatavilla kaikissa diagnostisissa laboratorioissa, on syytä mainita, että AGLT:n ja inkuboidulle verelle tehdyn NaCl-osmoottisen haurauskokeen yhdistäminen nostaa diagnostisen herkkyyden 97 %:iin, mikä on samankaltainen kuin aiemmin raportoitu suuremmassa potilassarjassa4: Tämä arvo on joka tapauksessa korkeampi kuin EMA-sitoutumisen ja kryohemolyysi-testin yhdistelmällä saatu arvo, kuten Crisp ja muut äskettäin raportoivat.12

Kuva 3. (A) Keskimääräiset kanavien fluoresenssiarvot normaaleilla kontrolleilla ja perinnöllistä sferosytoosia (HS) sairastavilla potilailla eri säilytyspäivinä. (B-C) EMA-sitoutumistestin tulokset 150 HS-potilaan näytteissä ryhmiteltynä lähetyksen (B) ja ennen testausta vietettyjen varastointipäivien (C) mukaan. ■ Kontrollit, – HS ei lähetetty, ○ HS lähetetty.

Kuvio 4. Perinnöllisen sferosytoosin (HS) laboratoriodiagnoosin vuokaavio.

Yrinnöllisen sferosytoosin diagnostisten testien tautispesifisyyttä arvioitiin ottamalla mukaan suuri joukko potilaita, joilla oli erityyppisiä hemolyyttisiä anemioita, joissa saattaa esiintyä perinnöllisen sferosytoosin kaltaisia morfologisia ja laboratorio-ominaisuuksia. Odotetusti EMA-sitoutumisen tulokset fluoresenssin prosentuaalisena vähenemisenä ilmaistuna olivat suoraan yhteydessä sferosyyttien määrään vain perinnöllistä sferosytoosia sairastavilla potilailla, mutta eivät autoimmuunista hemolyyttistä anemiaa sairastavilla potilailla, ei edes niillä, joilla oli selvä sferosytoosi: tämä havainto on linjassa muiden raportoiman tämän testin korkean tautispesifisyyden kanssa.19-21,25 Havaitsimme, että muut määritykset, erityisesti glyserolipohjaiset määritykset, eivät ole yhtä spesifisiä kuin EMA-sitoutuminen, sillä kuten aiemmin on raportoitu,8,9,14,15,46 ne ovat usein positiivisia myös hankituissa hemolyyttisissä anemioissa. On syytä mainita, että mikään saatavilla olevista perinnöllisen sferosytoosin suorista tai epäsuorista diagnostisista testeistä ei erota perinnöllistä sferosytoosia tyypin II synnynnäisestä dyserytropoieettisesta anemiasta. Vaikka tämä jälkimmäinen sairaus on harvinaisempi kuin perinnöllinen sferosytoosi, se voi jäljitellä perinnöllisen sferosytoosin kliinistä taudinkuvaa, punasolujen morfologiaa ja lisääntynyttä punasolujen osmoottista haurautta, ja sen tunnistaminen saattaa edellyttää SDS-PAGE-analyysiä: Mariani et al. raportoivat, että 13 prosenttia vertailulaboratorioon lähetetyistä tapauksista, jotka oli alustavasti luokiteltu perinnölliseksi sferosytoosiksi, osoittautui SDS-PAGE-analyysillä tutkittaessa tyypin II synnynnäiseksi dyserytropoieettiseksi anemiaksi47 .

Britannian hematologian standardointikomitean (British Committee for Standards in Hematology)19 toistaiseksi ainoat saatavilla olevat perinnöllisen sferosytoosin diagnostiikkaohjeet suosittelevat seulontamenetelmäksi joko EMA:n sitomista tai kryohemolyysi-testiä16 , ja valinnan ratkaisevana tekijänä on virtaussytometrin saatavuus. Suuntaviivoissa ei täsmennetä, olisiko epäselvissä tai rajallisissa tuloksissa tehtävä molemmat testit. Joka tapauksessa jopa näiden kahden testin yhdistelmällä saadaan 93 prosentin herkkyys, joka on samanlainen kuin EMA-sitoutumisen tai AGLT:n herkkyys yksinään käytettynä ja paljon alhaisempi kuin EMA-sitoutumisen ja AGLT:n yhdistelmällä saatu herkkyys.

Kuten kuviosta 4 nähdään, potilaan, jolla on DAT-negatiivinen krooninen hemolyysi, jossa on sferosyyttejä, ollessa kyseessä, sekä EMA:n että AGLT:n negatiivinen tuloksellisuus antaa mahdollisuuden poissulkea perinnöllisen sferosytoosin. EMA-sitoutumisen positiivisuus (joko positiivisen tai negatiivisen AGLT:n kanssa) johtaa perinnöllisen sferosytoosin diagnoosiin lukuun ottamatta niitä ei-dominantteja tapauksia, joissa retikulosytoosi on riittämätön11 ja joissa tarvitaan SDS-PAGE-analyysi, jotta voidaan sulkea pois tyypin II synnynnäinen dyserytropoieettinen anemia. SDS-PAGE-analyysiä saatetaan tarvita myös harvinaisissa EMA-negatiivisissa, AGLT-poistivisissa tapauksissa, joilla on negatiivinen sukuhistoria, koska AGLT:n tautispesifisyys on vähäisempi.

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että mikään yksittäinen testi ei pysty tunnistamaan kaikkia perinnöllisen sferosytoosin tapauksia. EMA-sitoutumisen, joka kohdistuu suoraan perinnöllisen sferosytoosin rakennevirheeseen, ja AGLT:n, joka hyödyntää punasolujen pinta-alan ja tilavuuden suhdetta, yhdistelmä mahdollisti kaikkien perinnöllistä sferosytoosia sairastavien potilaiden tunnistamisen tässä sarjassa, ja se edustaa näin ollen erittäin tehokasta perinnöllisen sferosytoosin diagnoosistrategiaa myös lievissä/kompensoiduissa tapauksissa. On kuitenkin korostettava, että perinnöllisen sferosytoosin diagnoosi on viimeinen vaihe diagnostisessa tutkimuksessa, joka perustuu laboratoriokokeiden lisäksi kliiniseen tutkimukseen, omaan sukuhistoriaan ja sekundaarisen sferosytoosin mahdollisten syiden poissulkemiseen.

Footnotes

• Rahoitus: Tätä työtä on tuettu Milanon IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico -säätiön myöntämällä apurahalla, RC2009 160/01 ja ENERCA III -hankkeella, EY 2008, sopimus n. 210.
• Kirjoittajuus ja tiedonantovelvollisuutta koskevat tiedot Kirjoittajina ja kiitoskirjeissä lueteltujen henkilöiden osallistumisesta on saatavilla tämän artikkelin koko tekstin yhteydessä osoitteessa www.haematologica.org.
• Tekijöiden ICMJE:n (www.icmje.org) Uniform Format for Disclosure of Competing Interests (www.haematologica.org) -standardia käyttäen antamat taloudelliset ja muut tiedot ovat myös saatavilla osoitteessa www.haematologica.org.

• Vastaanotettu 4. elokuuta 2011.
• Revision received October 11, 2011.
• Accepted October 26, 2011.

1. Eber SW, Pekrun A, Neufeldt A, Schröter W. Prevalence of increased osmotic fragility of erythrocytes in German blood donors: seulonta käyttäen modifioitua glyserolilyysitestiä. Ann Hematol. 1992; 64(2):88-92. PubMedhttps://doi.org/10.1007/BF01715351Google Scholar
2. Tse WT, Lux SE. Punasolujen kalvojen häiriöt. Br J Haematol. 1999; 104(1):2-13. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1999.01130.xGoogle Scholar
3. Gallagher PG. Punasolujen kalvojen häiriöt. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2005;13-8. Google Scholar
4. Mariani M, Barcellini W, Vercellati C, Marcello AP, Fermo E, Pedotti P. Kliiniset ja hematologiset ominaisuudet 300:lla perinnöllistä sferosytoosia sairastavalla potilaalla, jotka on ryhmitelty kalvoproteiinivian tyypin mukaan. Haematologica. 2008; 93(9):1310-7. PubMedhttps://doi.org/10.3324/haematol.12546Google Scholar
5. Hematology of infancy and childhood. Saunders: Philadelphia; 2009. Google Scholar
6. Parpart AK, Lorenz PB, Parpart ER, Gregg JR, Chase AM. Ihmisen punasolujen osmoottinen resistenssi (hauraus). J Clin Invest. 1947; 26(4):636-40. PubMedhttps://doi.org/10.1172/JCI101847Google Scholar
7. Gottfried EL, Robertson NA. Inkuboitujen erytrosyyttien glyserolilyysaika perinnöllisen sferosytoosin diagnostiikassa. J Lab Clin Med. 1974; 84(5):746-51. PubMedGoogle Scholar
8. Zanella A, Izzo C, Rebulla P, Zanuso F, Perroni L, Sirchia G. Acidified glycerol lysis test: a screening test for spherocytosis. Br J Haematol. 1980; 45(3):481-6. PubMedGoogle Scholar
9. Vettore L, Zanella A, Molaro GL, De Matteis MC, Pavesi M, Mariani M. Uusi testi sferosytoosin laboratoriodiagnoosiin. Acta Haematol. 1984; 72(4):258-63. PubMedGoogle Scholar
10. Cynober T, Mohandas N, Tchernia G. Red cell abnormalities in hereditary spherocytosis: relevance to diagnosis and understanding of the variable expression of clinical severity. J Lab Clin Med. 1996; 128(3):259-69. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0022-2143(96)90027-XGoogle Scholar
11. Perrotta S, Gallagher PG, Mohandas N. Hereditary spherocytosis. Lancet. 2008; 372(9647):1411-26. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0140-6736(08)61588-3Google Scholar
12. Crisp RL, Solari L, Vota D, García E, Miguez G, Chamorro ME. Prospektiivinen tutkimus, jossa arvioitiin perinnöllisen sferosytoosin ennustearvoa viiden laboratoriotestin (kryohemolyysi-testi, eosiini-5′-maleimidivirtaussytometria, osmoottinen haurauskoe, autohemolyysi-testi ja SDS-PAGE) avulla 50:ssä perinnöllisen sferosytoosin perheessä Argentiinassa. Ann Hematol. 2011; 90(6):625-34. PubMedhttps://doi.org/10.1007/s00277-010-1112-0Google Scholar
13. Korones D, Pearson HA. Normaali erytrosyyttien osmoottinen hauraus perinnöllisessä sferosytoosissa. J Pediatr. 1989; 114(2):264-6. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0022-3476(89)80794-2Google Scholar
14. Apel D, Maria ska B, Maj S. Hapotetun glyserolilyysitestin (AGLT) diagnostinen arvo perinnöllisessä sferosytoosissa ja eräissä hematologisissa sairauksissa. Acta Haematol Pol. 1993; 24(3):267-71. PubMedGoogle Scholar
15. Brabec V, Marík T, Feixová H, Slavíková V. Uudet testit sferosytoosin laboratoriodiagnostiikassa. Vnitr Lek. 1991; 37(11-12):883-7. PubMedGoogle Scholar
16. Iglauer A, Reinhardt D, Schröter W, Pekrun A. Kryohemolyysi-testi perinnöllisen sferosytoosin diagnostisena välineenä. Ann Hematol. 1999; 78(12):555-7. PubMedhttps://doi.org/10.1007/s002770050557Google Scholar
17. Streichman S, Gescheidt Y. Kryohemolyysi perinnöllisen sferosytoosin toteamisessa: korrelaatiotutkimukset osmoottisen fragiliteetin ja autohemolyysin kanssa. Am J Hematol. 1998; 58(3):206-12. PubMedhttps://doi.org/10.1002/(SICI)1096-8652(199807)58:3<206::AID-AJH8>3.0.CO;2-VGoogle Scholar
18. King MJ, Behrens J, Rogers C, Flynn C, Greenwood D, Chambers K. Nopea läpivirtaussytometrinen testi membraanisytoskeletoniin liittyvän hemolyyttisen anemian diagnosoimiseksi. Br J Haematol. 2000; 111(3):924-33. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2000.02416.xGoogle Scholar
19. Bolton-Maggs PH, Stevens RF, Dodd NJ, Lamont G, Tittensor P, King MJ, Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis. Br J Haematol. 2004; 126(4):455-74. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2004.05052.xGoogle Scholar
20. King MJ, Telfer P, MacKinnon H, Langabeer L, McMahon C, Darbyshire P, Dhermy D. Using the eosin-5-maleimide binding test in the differential diagnosis of hereditary spherocytosis and hereditary pyropoikilocytosis. Cytometry B Clin Cytom. 2008; 74(4):244-50. PubMedGoogle Scholar
21. King MJ, Bruce L, Whiteway A. Kaakkois-Aasian ovalosytoosissa esiintyvä mutantti erytrosyyttien band 3 -proteiini ei sido eosiini-5-maleimidia. Int J Lab Hematol. 2009; 31(1):116-7. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2007.01019.xGoogle Scholar
22. King MJ, Jepson MA, Guest A, Mushens R. Perinnöllisen pyropoikilosytoosin havaitseminen eosiini-5-maleimidia (EMA) sitovalla testillä johtuu EMA:n kanssa reagoivien transmembraaniproteiinien merkittävästä vähenemisestä. Int J Lab Hematol. 2011; 33:205-211. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2010.01270.xGoogle Scholar
23. Kedar PS, Colah RB, Kulkarni S, Ghosh K, Mohanty D. Experience with eosin-5′-maleimide as a diagnostic tool for red cell membrane cytoskeleton disorders. Clin Lab Haematol. 2003; 25(6):373-6. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.0141-9854.2003.00557.xGoogle Scholar
24. Stoya G, Gruhn B, Vogelsang H, Baumann E, Linss W. Virtaussytometria perinnöllisen sferosytoosin diagnostisena välineenä. Acta Haematol. 2006; 116(3):186-91. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000094679Google Scholar
25. Girodon F, Garçon L, Bergoin E, Largier M, Delaunay J, Fénéant-Thibault M. Usefulness of the eosin-5′-maleimide cytometric method as a first-line screening test for the diagnosis of hereditary spherocytosis: comparison with ektacytometry and protein electrophoresis. Br J Haematol. 2008; 140(4):468-70. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2007.06944.xGoogle Scholar
26. Kar R, Mishra P, Pati HP. Eosiini-5-maleimidivirtaussytometrisen testin arviointi perinnöllisen sferosytoosin diagnostiikassa. Int J Lab Hematol. 2010; 32(1 Pt 2):8-16. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2008.01098.xGoogle Scholar
27. Riley CH, Nikolajsen K, Kjaersgaard E, Klausen TW, Mourits-Andersen T, Clausen N, Lausen B, Rosthøj S, Birgens H. Virtaussytometrinen diagnostiikka perinnöllisessä sferosytoosissa. Ugeskr Laeger. 2009; 171(49):3610-4. PubMedGoogle Scholar
28. D’Alcamo E, Agrigento V, Sclafani S, Vitrano A, Cuccia L, Maggio A. EMA-sidontatestin luotettavuus perinnöllisen sferosytoosin diagnostiikassa italialaisilla potilailla. Acta Haematol. 2011; 125(3):136-40. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000322253Google Scholar
29. Tachavanich K, Tanphaichitr VS, Utto W, Viprakasit V. Rapid flow cytometric test using eosin-5-maleimide for diagnosis of red blood cell membrane disorders. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2009; 40(3):570-5. PubMedGoogle Scholar
30. King MJ, Smythe JS, Mushens R. Eosin-5-maleimidin sitoutuminen bändi 3:een ja Rh:hen liittyviin proteiineihin muodostaa perustan perinnöllisen sferosytoosin seulontatestille. Br J Haematol. 2004; 124(1):106-13. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2003.04730.xGoogle Scholar
31. Barcellini W, Clerici G, Montesano R, Taioli E, Morelati F, Rebulla P, Zanella A. Punaisten verisolujen vasta-ainetuotannon in vitro-kvantifiointi idiopaattisessa autoimmuunisessa hemolyyttisessä anemiassa: mitogeeni- ja sytokiinistimulaation vaikutus. Br J Haematol. 2000; 111(2):452-60. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2000.02380.xGoogle Scholar
32. Dacie JV, Lewis SM. Practical Haematology. Churchill Livingston: London; 2001. Google Scholar
33. Dodge JT, Mitchell C, Hanahan Dj. Ihmisen erytrosyyttien hemoglobiinittomien haamujen valmistus ja kemialliset ominaisuudet. Arch Biochem Biophys. 1963; 100:119-30. PubMedhttps://doi.org/10.1016/0003-9861(63)90042-0Google Scholar
34. Fairbanks G, Steck TL, Wallach DF. Elektroforeettinen analyysi ihmisen erytrosyyttikalvon tärkeimmistä polypeptideistä. Biochemistry. 1971; 10(13):2606-17. PubMedhttps://doi.org/10.1021/bi00789a030Google Scholar
35. Laemmli UK. Rakenneproteiinien pilkkoutuminen bakteriofagi T4:n pään kokoamisen aikana. Nature. 1970; 227(5259):680-5. PubMedhttps://doi.org/10.1038/227680a0Google Scholar
36. Beutler E. Red cell metabolism: a manual of biochemical methods. Grune &amp; Stratton Inc: New York, NY; 1984. Google Scholar
37. Iolascon A, Avvisati RA. Genotyypin ja fenotyypin korrelaatio perinnöllisessä sferosytoosissa. Haematologica. 2008; 93(9):1283-8. PubMedhttps://doi.org/10.3324/haematol.13344Google Scholar
38. Romero RR, Poo JL, Robles JA, Uriostegui A, Vargas F, Majluf-Cruz A. Kryohemolyysi-testin hyödyllisyys perinnöllisen sferosytoosin diagnostiikassa. Arch Med Res. 1997; 28(2):247-51. PubMedGoogle Scholar
39. Golan DE, Corbett JD, Korsgren C, Thatte HS, Hayette S, Yawata Y, Cohen CM. Bändi 3:n lateraalisen ja rotaatioliikkuvuuden kontrollointi bändi 4.2:lla ehjissä erytrosyyteissä: bändi 3:n oligomeerien vapautuminen matala-affiniteettisista sitoutumiskohdista. Biophys J. 1996; 70(3):1534-42. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0006-3495(96)79717-5Google Scholar
40. Godal HC, Gjønnes G, Ruyter R. Does preincubation of the red blood cells contribute to the capability of the osmotic fragility test to detect very mild forms of hereditary spherocytosis?. Scand J Haematol. 1982; 29(1):89-93. PubMedGoogle Scholar
41. Käytännön hematologia. Churchill Livingstone; 1991. Google Scholar
42. Iolascon A, Miraglia del Giudice E, Perrotta S, Alloisio N, Morlé L, Delaunay J. Hereditary spherocytosis: from clinical to molecular defects. Haematologica. 1998; 83(3):240-57. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000015191Google Scholar
43. Mittler U, Radig K, Kluba U, Aumann V, Röppnack R. Kokemuksia glyserolilyysitestistä happamassa väliaineessa perinnöllisen sferosytoosin diagnostiikassa. Kinderarztl Prax. 1993; 61(6):219-22. PubMedGoogle Scholar
44. Hoffmann JJ, Swaak-Lammers N, Breed WP, Strengers JL. Esiinkuboidun happamoitetun glyserolilyysitestin diagnostinen hyödyllisyys hemolyyttisissä ja ei-hemolyyttisissä anemioissa. Eur J Haematol. 1991; 47(5):367-70. PubMedGoogle Scholar
45. Bucx MJ, Breed WP, Hoffmann JJ. Happamoitetun glyserolilyysitestin, Pink-testin ja osmoottisen haurauskokeen vertailu perinnöllisessä sferosytoosissa: inkuboinnin vaikutus. Eur J Haematol. 1988; 40(3):227-31. PubMedGoogle Scholar
46. Rutherford CJ, Postlewaight BF, Hallowes M. An evaluation of the acidified glycerol lysis test. Br J Haematol. 1986; 63(1):119-21. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1986.tb07501.xGoogle Scholar
47. Mariani M, Vercellati C, Bianchi P, Marzorati S, Caneva L, Soligo C. Congenital dyserythropoietic anemia type II (CDA II) mimicking hereditary spherocytosis (HS): report of 12 cases detected by SDSPAGE. Hematol J. 2002; 3:353. Google Scholar

.