Los métodos de captura de la conformación cromosómica (3C) miden las frecuencias de contacto del ADN basadas en la ligadura de proximidad nuclear, para descubrir patrones de plegado genómico in vivo. 4C-seq es un método derivado de 3C, diseñado para buscar en el genoma secuencias en contacto con un sitio genómico de interés seleccionado. 4C-seq emplea la PCR inversa y la secuenciación de nueva generación para amplificar, identificar y cuantificar sus fragmentos de ADN ligados por proximidad. Genera perfiles de contacto de alta resolución para los sitios genómicos seleccionados basándose en cantidades limitadas de lecturas de secuenciación. La 4C-seq puede utilizarse para estudiar múltiples aspectos de la organización del genoma. Principalmente sirve para identificar contactos específicos de ADN de largo alcance entre módulos individuales de ADN regulador, formando, por ejemplo, bucles de cromatina reguladora entre potenciadores y promotores, o bucles de cromatina arquitectónica entre límites de dominios asociados a cohesina y CTCF. Además, los perfiles de contacto de 4C-seq pueden revelar los contornos de los dominios de contacto y pueden identificar los dominios estructurales que coocupan el mismo compartimento nuclear. Aquí, presentamos un protocolo mejorado paso a paso para la preparación de muestras y la generación de bibliotecas de secuenciación 4C-seq, incluyendo una estrategia optimizada de PCR y purificación de plantillas 4C. Además, se proporciona una línea de procesamiento de datos que procesa las lecturas 4C-seq multiplexadas directamente desde los archivos FASTQ y genera archivos compatibles con los navegadores genómicos estándar para la visualización y el posterior análisis estadístico de los datos, como la llamada de picos utilizando peakC. Los protocolos y el pipeline presentados deberían permitir fácilmente a cualquiera generar, visualizar e interpretar sus propios conjuntos de datos de contactos 4C de alta resolución.