Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos

Julio de 2000

Principios toxicológicos para la evaluación de la seguridad de los ingredientes alimentariosRedbook 2000Capítulo IV.C.1.d. Prueba de micronúcleos en eritrocitos de mamíferos

Volver al índice del Redbook 2000

I. Introducción

Los micronúcleos son cuerpos citoplasmáticos que contienen cromatina y que se forman cuando los fragmentos cromosómicos acéntricos o los cromosomas se retrasan durante la anafase y no se incorporan a los núcleos de las células hijas durante la división celular. Dado que los daños genéticos que dan lugar a roturas cromosómicas, cromosomas estructuralmente anormales o anomalías del huso conducen a la formación de micronúcleos, la incidencia de éstos sirve como índice de estos tipos de daños. Se ha establecido que esencialmente todos los agentes que causan roturas cromosómicas de doble cadena (clastógenos) inducen micronúcleos. Dado que la enumeración de los micronúcleos es mucho más rápida y menos exigente desde el punto de vista técnico que la puntuación de las aberraciones cromosómicas, y dado que los micronúcleos surgen de dos tipos importantes de daño genético (clastogénesis y alteración del huso), el ensayo de micronúcleos se ha utilizado ampliamente para detectar sustancias químicas que causan estos tipos de daño.

Esta guía aborda el ensayo de micronúcleos in vivo más utilizado: el ensayo de micronúcleos en eritrocitos de mamíferos. Este ensayo de micronúcleos in vivo se utiliza para la detección de daños inducidos por la sustancia de ensayo en los cromosomas o en el aparato mitótico de los eritroblastos mediante el análisis de los eritrocitos muestreados en la médula ósea y/o en las células de la sangre periférica de los animales, normalmente roedores.

El objetivo de la prueba de micronúcleos es identificar las sustancias que causan daños citogenéticos que dan lugar a la formación de micronúcleos que contienen fragmentos de cromosomas rezagados o cromosomas enteros.

Cuando un eritroblasto de la médula ósea se convierte en un eritrocito policromático, el núcleo principal se extruye; los micronúcleos que se han formado pueden permanecer en el citoplasma, que de otro modo estaría enucleado. La visualización de los micronúcleos se facilita en estas células mediante técnicas de tinción específicas y porque carecen de núcleo principal. Un aumento de la frecuencia de eritrocitos policromáticos micronucleados en los animales tratados es una indicación de daño cromosómico inducido.

II. Definiciones

El centrómero (cinetocoro) es una(s) región(es) de un cromosoma con la(s) cual(es) se asocian las fibras del huso durante la división celular, permitiendo el movimiento ordenado de los cromosomas hijos hacia los polos de las células hijas.

Los micronúcleos son pequeños núcleos, separados y adicionales a los núcleos principales de las células, producidos durante la telofase de la mitosis (meiosis) por fragmentos cromosómicos rezagados o cromosomas enteros.

El eritrocito normocromático es un eritrocito maduro que carece de ribosomas y puede distinguirse de los eritrocitos inmaduros y policromáticos mediante tinciones selectivas para los ribosomas.

El eritrocito policromático es un eritrocito inmaduro, en una fase intermedia de desarrollo, que todavía contiene ribosomas y, por tanto, puede distinguirse de los eritrocitos maduros normocromáticos mediante tinciones selectivas para los ribosomas.

III. Consideraciones iniciales

La médula ósea de los roedores se utiliza rutinariamente en esta prueba, ya que en ese tejido se producen eritrocitos policromáticos. La medición de eritrocitos inmaduros micronucleados (policromáticos) en sangre periférica es igualmente aceptable en cualquier especie en la que se haya demostrado la incapacidad del bazo para eliminar los eritrocitos micronucleados, o que haya mostrado una sensibilidad adecuada para detectar agentes que causan aberraciones cromosómicas estructurales y/o numéricas. Los micronúcleos pueden distinguirse por una serie de criterios. Estos incluyen la identificación de la presencia o ausencia de un cinetocoro o de ADN centromérico en los micronúcleos. La frecuencia de micronúcleos inmaduros (policromáticos) es el principal criterio de valoración. El número de eritrocitos maduros (normocromáticos) en la sangre periférica que contienen micronúcleos entre un número determinado de eritrocitos maduros también puede utilizarse como criterio de valoración del ensayo cuando los animales son tratados de forma continua durante un periodo que supera la vida útil del eritrocito en la especie considerada (por ejemplo, 4 semanas en el ratón), siempre que no se produzca una selección esplénica significativa contra los eritrocitos micronucleados en esa especie/cepa. Las consecuencias de la selección esplénica, en caso de que se produzca, deben abordarse en su totalidad.

Este ensayo de micronúcleos in vivo en mamíferos es especialmente relevante para evaluar el peligro mutagénico, ya que permite tener en cuenta factores del metabolismo in vivo, la farmacocinética y los procesos de reparación del ADN, aunque éstos pueden variar entre especies, entre tejidos y entre puntos finales genéticos. Un ensayo in vivo también es útil para investigar más a fondo un efecto mutagénico detectado por un sistema in vitro.

Si hay pruebas de que la sustancia de ensayo, o un metabolito reactivo, no llegará al tejido diana, no es apropiado utilizar este ensayo.

IV. Principio del método de ensayo

Los animales se exponen a la sustancia de ensayo por una vía adecuada. Si se utiliza la médula ósea, los animales se sacrifican en momentos apropiados después del tratamiento, se extrae la médula ósea y se hacen preparaciones y se tiñen.(16),(17),(18),(26),(32),(41) Si se utiliza sangre periférica, se extrae la sangre en momentos apropiados después del tratamiento y se hacen preparaciones de frotis y se tiñen.(4),(5),(14),(16),(27),(28),(29),(32) Las preparaciones se analizan para detectar la presencia de micronúcleos.

V. Descripción del método

A. Preparaciones

1. Selección de la especie animal

Históricamente, se han utilizado ratones o ratas de forma rutinaria para este ensayo. Si la médula ósea es el tejido muestreado, puede utilizarse cualquier especie de mamífero apropiada (véase la sección III., arriba). Como en cualquier estudio de toxicología, la selección de la especie adecuada debe estar justificada. Cuando se utiliza sangre periférica, se recomienda utilizar ratones. Sin embargo, puede utilizarse cualquier especie de mamífero apropiada siempre que sea una especie en la que el bazo no elimine eritrocitos micronucleados o sea una especie que haya demostrado una sensibilidad adecuada para detectar agentes que causen aberraciones cromosómicas estructurales y/o numéricas. Deben emplearse cepas de laboratorio de uso común de animales jóvenes y sanos. Al comienzo del estudio, la variación de peso de los animales debe ser mínima y no superar el ±20% del peso medio de cada sexo.

2. Condiciones de alojamiento y alimentación

La temperatura en la sala de animales de experimentación debe ser la adecuada para la especie utilizada; en el caso de ratones y ratas debe ser de 22°C (±3°C). La humedad relativa debe ser al menos del 30% y preferiblemente no superar el 70%, salvo durante la limpieza de la sala, el objetivo debe ser del 50-60%. La iluminación debe ser artificial, con una secuencia de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación, pueden utilizarse dietas convencionales de laboratorio con un suministro ilimitado de agua potable. La elección de la dieta puede estar influida por la necesidad de garantizar una mezcla adecuada de una sustancia de ensayo cuando se administra por esta vía. Los animales pueden alojarse individualmente o en jaulas en pequeños grupos del mismo sexo.

3. Preparación de los animales

Los animales adultos jóvenes y sanos deben asignarse al azar a los grupos de control y de tratamiento. Los animales deben ser identificados de forma única. Los animales deben aclimatarse a las condiciones del laboratorio durante al menos cinco días. Las jaulas deben estar dispuestas de forma que se minimicen los posibles efectos debidos a la colocación de las mismas.

4. Preparación de las dosis

Las sustancias de ensayo sólidas deben disolverse o suspenderse en disolventes o vehículos adecuados y diluirse, si procede, antes de la dosificación de los animales. Las sustancias de ensayo líquidas pueden dosificarse directamente o diluirse antes de la dosificación. Deben emplearse preparaciones frescas de la sustancia de ensayo a menos que los datos de estabilidad demuestren la aceptabilidad del almacenamiento.

B. Condiciones de ensayo

1. Disolvente/vehículo

El disolvente/vehículo no debe producir efectos tóxicos a los niveles de dosis utilizados, y no debe ser sospechoso de reacción química con la sustancia de ensayo. Si se emplean disolventes/vehículos distintos de los comúnmente utilizados, su uso debe estar respaldado por datos de referencia que indiquen su compatibilidad con la sustancia de ensayo y los animales. Se recomienda que, siempre que sea apropiado, se considere en primer lugar el uso de un disolvente/vehículo acuoso.

2. Controles

En general, deben incluirse controles positivos y negativos (disolvente/vehículo) simultáneos para cada sexo en cada ensayo realizado con roedores. Sin embargo, cuando el ensayo de micronúcleos se realiza como parte de un estudio de toxicidad general de acuerdo con las directrices de las BPL, la verificación de la dosificación adecuada se realizará mediante análisis químico. En tales casos, puede no ser necesario el tratamiento concurrente de los animales con un agente de control positivo y el control de los procedimientos de tinción y puntuación puede realizarse incluyendo muestras de referencia apropiadas obtenidas previamente de animales que no forman parte del experimento actual. En los estudios con especies superiores, como los primates o los perros, pueden omitirse los controles positivos siempre que el laboratorio de pruebas haya demostrado previamente una respuesta aceptable a las sustancias de control positivo de las especies utilizadas. En todos los casos, los controles negativos concurrentes son un componente obligatorio del estudio. Salvo en el caso del tratamiento con la sustancia de ensayo, los animales de los grupos de control deben manipularse de forma idéntica a los animales de los grupos de tratamiento.

Los controles positivos deben producir micronúcleos in vivo a niveles de exposición que se espere que den un aumento detectable y estadísticamente significativo sobre el fondo. Las dosis de control positivo deben elegirse de forma que los efectos sean claros pero no revelen inmediatamente al lector la identidad de los portaobjetos codificados. Es aceptable que el control positivo se administre por una vía diferente a la de la sustancia de ensayo y se tome una sola muestra. Además, puede considerarse el uso de sustancias químicas de control positivo relacionadas con la clase química, cuando estén disponibles. Algunos ejemplos de sustancias de control positivo son

Animales de control negativo, tratados sólo con disolvente o vehículo y, por lo demás, tratados de la misma manera que los grupos de tratamiento, deben incluirse para cada tiempo de muestreo, salvo que, en circunstancias apropiadas, sea posible utilizar un animal como su propio control comparando las muestras anteriores y posteriores al tratamiento. Si se aplica el muestreo único para los controles negativos, debe justificarse el momento de muestreo elegido. Además, también deben utilizarse controles no tratados, a menos que existan (a) datos disponibles del laboratorio de ensayo, o (b) datos de control históricos o publicados que demuestren que el disolvente/vehículo elegido no induce efectos deletéreos o mutagénicos.

Si se utiliza sangre periférica, también puede aceptarse una muestra previa al tratamiento como control negativo concurrente, pero sólo en los estudios de sangre periférica de corta duración (por ejemplo, 1-3 tratamiento(s)) cuando los datos resultantes estén en el rango esperado para el control histórico y cuando se haya demostrado la ausencia de un efecto del disolvente.

VI. Procedimiento para ratas y ratones

Las siguientes secciones proporcionan orientación para los procedimientos en ratones y ratas, las especies utilizadas más comúnmente en este ensayo.

A. Número y sexo de los animales

Cada grupo tratado y de control debe incluir al menos 5 animales analizables por sexo.(12) Si en el momento del estudio se dispone de datos de estudios en la misma especie y utilizando la misma vía de exposición que demuestren que no hay diferencias sustanciales entre sexos en cuanto a la toxicidad, bastará con realizar las pruebas en un solo sexo.

B. Programa de tratamiento

Se pueden recomendar varios programas de tratamiento diferentes (es decir, 1, 2 o más tratamientos a intervalos de 24 horas). Las muestras de regímenes de dosis extendidas son aceptables siempre que se haya demostrado un efecto positivo para este estudio o, para un estudio negativo, siempre que se haya demostrado la toxicidad o se haya utilizado la dosis límite (véase la sección «D», más adelante), y se haya continuado la dosificación hasta el momento del muestreo. Esto se basa en estudios que demuestran que las exposiciones repetidas de ratones y ratas de hasta una duración subcrónica producen efectos de una magnitud similar a los obtenidos con el ensayo agudo tradicional.(1),(2),(8),(11),(19),(21),(22),(23),(25),(29),(37),(38),(44),(48),(50) Sin embargo, debido a que existe cierta preocupación por la posibilidad de que la sensibilidad se reduzca en estudios de mayor duración debido a que no se alcance una verdadera MTD, o porque pueda producirse una adaptación, actualmente se considera que el tratamiento de duración debe limitarse a cuatro semanas hasta que se confirme la sensibilidad del ensayo cuando se utilicen tratamientos más largos.(12)

Las sustancias de ensayo también pueden administrarse como una dosis dividida, es decir dos o más tratamientos en el mismo día separados por no más de unas pocas horas, para facilitar la administración de un gran volumen de material o para minimizar las fluctuaciones en los niveles sanguíneos del artículo de ensayo.

Dos formas de realizar el ensayo son:

• Los animales se tratan con la sustancia de ensayo una vez, o dos veces con un intervalo de no más de 24 horas. Se toman muestras de médula ósea al menos dos veces entre 24 y 48 horas después de la última dosis, con el intervalo o los intervalos adecuados entre las muestras. Debe justificarse el uso de tiempos de muestreo anteriores a las 24 horas después del tratamiento. Las muestras de sangre periférica se toman al menos dos veces entre 36 y 72 horas después del último tratamiento, con el(los) intervalo(s) apropiado(s) entre las muestras. Cuando se reconoce una respuesta positiva en un tiempo de muestreo, no se requiere un muestreo adicional.
• Si se utilizan tres o más tratamientos diarios (por ejemplo, tres o más tratamientos a intervalos de 24 horas), las muestras pueden recogerse una vez a más tardar 24 horas después del tratamiento final para la médula ósea y una vez a más tardar 40 horas después del tratamiento final para la sangre periférica.(12), (20)

Se pueden utilizar tiempos de muestreo adicionales, cuando sea pertinente y esté científicamente justificado.

C. Niveles de dosis

Si se realiza un estudio de búsqueda de rangos de dosis porque no se dispone de datos adecuados, debe realizarse en el mismo laboratorio, utilizando la misma especie, cepa, sexo y régimen de tratamiento que se utilizará en el estudio principal.(7) Si hay toxicidad, deben utilizarse tres niveles de dosis para el primer tiempo de muestreo. Estos niveles de dosis deben cubrir un rango que vaya desde una toxicidad clara hasta una toxicidad escasa o nula. En el último tiempo de muestreo sólo debe utilizarse la dosis más alta. La dosis más alta se define como la dosis que produce signos de toxicidad de tal manera que se espera que niveles de dosis más altos, basados en el mismo régimen de dosificación, produzcan letalidad. Las sustancias con actividades biológicas específicas a dosis bajas no tóxicas (como las hormonas y los mitógenos) pueden ser excepciones a los criterios de fijación de dosis y deben evaluarse caso por caso. La dosis más alta también puede definirse como una dosis que produce algún indicio de toxicidad de la médula ósea (por ejemplo, una reducción de la proporción de eritrocitos inmaduros entre el total de eritrocitos en la médula ósea o la sangre periférica).

D. Prueba límite

Si no se producen efectos tóxicos observables a partir de un único tratamiento con un nivel de dosis de al menos 2000 mg/kg de peso corporal, o de dos tratamientos en el mismo día, y si no cabe esperar genotoxicidad sobre la base de los datos de sustancias estructuralmente relacionadas, puede no ser necesario un estudio completo con 3 niveles de dosis. En el caso de estudios de mayor duración, la dosis límite es de 2000 mg/kg/peso corporal/día para tratamientos de hasta 14 días, y de 1000 mg/kg/peso corporal/día para tratamientos de más de 14 días. La exposición humana prevista puede indicar la necesidad de utilizar un nivel de dosis más alto en el ensayo límite.

E. Administración de las dosis

La sustancia de ensayo suele administrarse por sonda gástrica o con una cánula de intubación adecuada, o por inyección intraperitoneal. Pueden aceptarse otras vías de exposición cuando puedan justificarse. El volumen máximo de líquido que puede administrarse por sonda o inyección de una sola vez depende del tamaño del animal de experimentación. El volumen no debe superar los 2 ml/100g de peso corporal. El uso de volúmenes superiores a éstos debe estar justificado. Excepto en el caso de sustancias irritantes o corrosivas, que normalmente revelarán efectos exacerbados con concentraciones más altas, la variabilidad en el volumen de ensayo debe minimizarse ajustando la concentración para asegurar un volumen constante en todos los niveles de dosis.

F. Preparación de la médula ósea/sangre

Las células de la médula ósea suelen obtenerse de los fémures o las tibias inmediatamente después del sacrificio. Comúnmente, las células se extraen de los fémures o las tibias, se preparan y se tiñen utilizando métodos establecidos. La sangre periférica se obtiene de la vena de la cola o de otro vaso sanguíneo apropiado. Las células sanguíneas se tiñen inmediatamente por vía supravital(4),(5),(14) o se hacen preparaciones de frotis y se tiñen después. El uso de una tinción específica para el ADN (por ejemplo, naranja de acridina(15) o Hoechst 33258 más pirronina-Y(30)) puede eliminar algunos de los artefactos asociados al uso de una tinción no específica para el ADN. Esta ventaja no excluye el uso de tinciones convencionales (por ejemplo, Giemsa). Otros sistemas (p. ej, columnas de celulosa para eliminar las células nucleadas(36)) también pueden utilizarse siempre que se haya demostrado que estos sistemas funcionan adecuadamente para la preparación de micronúcleos en el laboratorio.

G. Análisis

La proporción de eritrocitos inmaduros entre el total (inmaduros + maduros) se determina para cada animal contando un total de al menos 200 eritrocitos para la médula ósea y 1000 eritrocitos para la sangre periférica.(9) Todos los portaobjetos, incluidos los de los controles positivos y negativos, deben codificarse independientemente antes del análisis microscópico. Se puntúan al menos 2.000 eritrocitos inmaduros por animal para determinar la incidencia de eritrocitos inmaduros micronucleados. Puede obtenerse información adicional puntuando los eritrocitos maduros en busca de micronúcleos. Al analizar los portaobjetos, la proporción de eritrocitos inmaduros sobre el total de eritrocitos no debe ser inferior al 20% del valor de control. Cuando los animales son tratados de forma continua durante 4 semanas o más, también se puede puntuar la incidencia de micronúcleos en al menos 2.000 eritrocitos maduros por animal. Los sistemas de análisis automatizados (análisis de imágenes o análisis de citometría de flujo de suspensiones celulares) son alternativas aceptables a la evaluación manual si se justifican y validan adecuadamente en relación con la puntuación microscópica clásica.(12)

VII. Procedimiento para especies distintas de las ratas y los ratones

La información publicada basada en estudios en ratones, ratas, hámsters, cerdos, perros, primates no humanos y humanos(3),(6),(18),(28),(31),(32),(39),(40),(45) indican que las frecuencias espontáneas e inducidas de eritrocitos micronucleados son similares en la mayoría de las especies de mamíferos, y sugieren que la medición de la incidencia de eritrocitos inmaduros micronucleados en la médula ósea es adecuada para evaluar el daño cromosómico o del huso en las especies estudiadas hasta la fecha. La aparición y desaparición de eritrocitos micronucleados en la médula ósea está en función de la cinética de la eritrogénesis y del tiempo de vida de los eritrocitos en cada especie, por lo que los regímenes de dosificación y muestreo deben modificarse de acuerdo con los parámetros adecuados de la cinética eritrocitaria para cada especie. Pueden utilizarse especies distintas de los ratones o las ratas cuando sea apropiado, pero debe incluirse la siguiente información:

• Justificación de la especie seleccionada, y los programas de dosificación y muestreo utilizados en relación con la cinética de la eritropoyesis y la vida útil de los eritrocitos en la especie utilizada;
• Evidencia de que la frecuencia de micronúcleos espontáneos es coherente con la información publicada, y/o coherente dentro del laboratorio que realiza el estudio;
• Evidencia de que los genotóxicos conocidos producen un aumento de la frecuencia de micronúcleos en las especies utilizadas, y valores de referencia para la magnitud de la respuesta inducida;
• Impacto de la eliminación selectiva esplénica de las células micronucleadas de la sangre periférica (cuando esta última sirve como tejido objeto de seguimiento).

VIII. Datos e informes

A. Resultados del tratamiento

Los datos de los animales individuales deben presentarse en forma de tabla. La unidad experimental es el animal. El número de eritrocitos inmaduros anotados, el número de eritrocitos inmaduros micronucleados y el número de inmaduros entre el total de eritrocitos deben enumerarse por separado para cada animal analizado. Cuando los animales se traten de forma continua durante 4 semanas o más, deberán indicarse también los datos de los eritrocitos maduros si se recogen. La proporción de eritrocitos inmaduros entre el total de eritrocitos y, si se considera pertinente, el porcentaje de eritrocitos maduros micronucleados deben darse para cada animal. Si no hay pruebas de una diferencia en la respuesta entre los sexos, los datos de ambos sexos pueden combinarse para el análisis estadístico.

B. Evaluación e interpretación de los resultados

Hay varios criterios para determinar un resultado positivo, como un aumento relacionado con la dosis en el número de células micronucleadas o un claro aumento en el número de células micronucleadas en un solo grupo de dosis en un solo momento de muestreo. Deben utilizarse métodos estadísticos para evaluar los resultados de la prueba.(24),(35) Los criterios estadísticos para un resultado positivo, negativo o equívoco deben indicarse claramente en el protocolo. Dado que los factores biológicos pueden modificar la interpretación, la significación estadística no debe ser el único factor determinante para llegar a una conclusión. Los resultados equívocos deben aclararse mediante pruebas adicionales, utilizando una modificación de las condiciones experimentales, si procede.

Aunque la mayoría de los experimentos darán resultados claramente positivos o negativos, en raras ocasiones el conjunto de datos impedirá emitir un juicio definitivo sobre la actividad de la sustancia de ensayo. Los resultados pueden seguir siendo equívocos o dudosos independientemente del número de veces que se repita el experimento.

Los resultados positivos en la prueba de micronúcleos indican que una sustancia induce micronúcleos, que son el resultado de un daño cromosómico o del aparato mitótico en los eritroblastos de la especie de prueba. Los resultados negativos indican que, en las condiciones de ensayo, la sustancia de ensayo no produce daños cromosómicos o del huso que den lugar a la formación de micronúcleos en los eritrocitos inmaduros de la especie de ensayo.

Debe discutirse la probabilidad de que la sustancia de ensayo o sus metabolitos lleguen a la circulación general o específicamente al tejido diana (por ejemplo, toxicidad sistémica). La demostración de una exposición adecuada del tejido diana en un ensayo de micronúcleos negativo es una consideración especialmente importante cuando hay pruebas positivas de genotoxicidad en uno o más sistemas de ensayo.

C. Informe de la prueba

El informe de la prueba debe incluir también la siguiente información:

1. Sustancia de ensayo

• datos de identificación y nº CAS, si se conoce
• naturaleza física y pureza
• propiedades fisicoquímicas relevantes para la realización del estudio
• estabilidad de la sustancia de ensayo, si se conoce

2. Disolvente/vehículo

• justificación de la elección del vehículo
• solubilidad y estabilidad de la sustancia de ensayo en el disolvente/vehículo, si se conoce

3. Soluciones dosificadoras

• horas de preparación y uso de las soluciones dosificadoras (o intervalo entre la preparación y el uso), y condiciones de almacenamiento
• datos que verifiquen la concentración de la solución dosificadora, si se conocen

4. Animales de experimentación

• especies/cepas utilizadas, incluyendo la justificación
• número, edad y sexo de los animales
• fuente, condiciones de alojamiento, dieta, etc.
• peso individual de los animales al inicio del ensayo, incluyendo el rango de peso corporal, la media y la desviación estándar de cada grupo
• información relativa a la posible influencia de la selección esplénica en la incidencia de células micronucleadas en la sangre periférica, si procede

5. Condiciones de ensayo

• datos de control positivo y negativo (vehículo/disolvente)
• datos del estudio de búsqueda de rangos, si se ha llevado a cabo
• motivos para la selección del nivel de dosis
• detalles de la preparación de la sustancia de ensayo
• detalles de la administración de la sustancia de ensayo
• motivos de la vía de administración y del régimen de dosificación
• métodos para verificar que la sustancia de ensayo llegó a la circulación general y/o al tejido diana, si procede
• conversión de la concentración de la sustancia de ensayo en la dieta/agua de bebida (ppm) a la dosis real (mg/kg de peso corporal/día), si procede
• detalles de la calidad de los alimentos y del agua
• descripción detallada de los programas de tratamiento y muestreo
• métodos de preparación de los portaobjetos
• métodos de medición de la toxicidad
• criterios para puntuar los eritrocitos inmaduros micronucleados y, si procede y es aplicable, eritrocitos maduros
• número de células analizadas por animal
• criterios para considerar los estudios como positivos, negativos o equívocos

6. Resultados

• signos de toxicidad
• proporción de eritrocitos inmaduros entre el total de eritrocitos
• número de eritrocitos inmaduros micronucleados entre el total de eritrocitos inmaduros, dado por separado para cada animal
• si procede y es aplicable, número de eritrocitos maduros micronucleados entre el total de eritrocitos maduros, se da por separado para cada animal
• media ± desviación estándar de eritrocitos inmaduros micronucleados y, si procede, de eritrocitos maduros por grupo
• relación dosis-respuesta, cuando sea posible
• análisis estadísticos y justificación del método aplicado, con la correspondiente cita bibliográfica
• datos de control negativo actuales e históricos
• datos de control positivo actuales e históricos

7. Discusión de los resultados

8. Conclusión

XI. Apéndice: Identificación de micronúcleos derivados de fragmentos acéntricos frente a cromosomas centroméricos

Los micronúcleos pueden estar formados por fragmentos acéntricos o por cromosomas enteros rezagados en la mitosis. Estos últimos micronúcleos se reconocieron por primera vez por su gran tamaño,(49) por C-banding(47) o por medición del contenido de ADN.(46) Sin embargo, estos métodos no eran muy fiables. Por lo tanto, se desarrollaron dos métodos citogenéticos moleculares para identificar la presencia de centrómeros en los micronúcleos y diferenciar así entre micronúcleos de origen clastogénico y aneugénico:(12) 1) tinción CREST inmunofluorescente y 2) hibridación in situ fluorescente (FISH) con sondas de ADN pancentromérico. Cuando es importante desde el punto de vista mecánico determinar la presencia del cinetocoro o del centrómero en los micronúcleos, pueden aplicarse estos métodos.

El método CREST aplicado a la prueba de micronúcleos de médula ósea es descrito en detalle por Miller y Adler.(33) Las células en portaobjetos (frotis de médula ósea normal) se fijan, se deshidratan, se incuban en dos pasos con SDS y Triton-X, y luego se tiñen con anticuerpos. El ADN se contratiñe con Hoechst 33258.

Con la FISH se utiliza la sonda de ADN satélite menor que hibrida cerca del centrómero(43) para identificar la región centromérica, si está presente. Un método de FISH con las sondas de ADN centromérico ha sido descrito por Pinkel et al.(34) Este método puede aplicarse a eritrocitos que contienen micronúcleos clasificados por flujo(10) o a micronúcleos aislados obtenidos de muestras de sangre periférica.(13)

En los portaobjetos de control, la tasa de micronúcleos marcados que contienen la región centromérica es de aproximadamente el 50%.(43) Aproximadamente el 70% de los micronúcleos inducidos por aneugénicos conocidos (colchicina y vinblastina) están marcados,(33) mientras que los inducidos por clastógenos (hidroquinona y mitomicina C) sólo muestran un 5-15% de micronúcleos marcados.(33) Para caracterizar la actividad clastogénica relativa frente a la aneugénica de una sustancia química, es útil utilizar como índice el número de micronúcleos de eritrocitos policromáticos por cada 1000 eritrocitos policromáticos que contienen la región centromérica.(42)

La principal deficiencia de los métodos de FISH descritos hasta la fecha es que no diferencian entre eritrocitos normocromáticos y policromáticos.(12) Por lo tanto, sólo son adecuadas para el análisis las preparaciones en las que una gran fracción de los micronúcleos presentes son inducidos por el artículo de ensayo. Por ejemplo, las muestras de sangre periférica procedentes de experimentos con exposiciones agudas en animales adultos no son nunca adecuadas para el análisis porque la población de células objetivo (eritrocitos inmaduros) es sólo el 3-5% de los eritrocitos de la muestra.

En conclusión, el etiquetado CREST o FISH se consideran métodos fiables para detectar las propiedades aneugénicas de las sustancias químicas en el ensayo de micronúcleos in vivo, siempre que se preste atención a garantizar que se utilicen las muestras adecuadas para el análisis.(12) Sin embargo, la complejidad de los métodos actuales limita su uso a aquellos casos en los que se sospecha que una sustancia química provoca una alteración del huso (p. ej, debido a la presencia de grandes micronúcleos, la inducción de la poliploidía, etc.) o cuando existan otras razones específicas para obtener esta información mecanística.

X. Referencias

1. Armstrong, M.J., Galloway, S.M. (1993). Micronuclei Induced in Peripheral Blood of mu-PIM-1 Transgenic Mice by Chronic Oral Treatment with 2-Acetylaminofluorene or Benzene but not with Diethylnitrosamine or 1,2-Dichloroethane. Mutation Res. 302:61-70.
2. Choy, W.N., MacGregor, J.T., Shelby, M.D., Maronpot, R.R. (1985). Inducción de micronúcleos por benceno en ratones B6C3F1: Retrospective Analysis of Peripheral Blood Smears from the NTP Carcinogenesis Bioassay. Mutation Res. 143:55-59.
3. Choy, W.N., Willhite, C.C., Cukierski, M.J. y Book, S.A. (1989). Primate Micronucleus Study of L-Selenomethionine. Environ. Molec. Mutagenesis 14:123-125.
4. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMS.MMS. Mutation Res. 278:83-98.
5. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol Recommended for the Short-Term Mouse Peripheral Blood Micronucleus Test. Mutagenesis 10:153-159.
6. Everson, R.B., Wehr, C.M., Erexson, G.L. y MacGregor, J.T. (1988). Association of Marginal Folate Depletion with Increased Human Chromosomal Damage In Vivo: Demonstration by Analysis of Micronucleated Erythrocytes. J. Natl. Cancer Inst. 80:25-529.
7. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J., y Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis 7:313-319.
8. Garriott M.L., Brunny J.D., Kindig D.E., Parton J.W., Schwier L.S. (1995). The In Vivo Rat Micronucleus Test: Integration with a 14-Day Study. Mutation Res. 342:71-6.
9. Gollapudi, B. y McFadden, L.G. (1995). Sample Size for the Estimation of Polychromatic to Normochromatic Erythrocyte Ratio in the Bone Marrow Micronucleus Test. Mutation Res. 347:97-99).
10. Grawé J., Nüsse M. y Adler I.-D. (1997). Quantitative and Qualitative Studies of Micronucleus Induction in Mouse Erythrocytes Using Flow Cytometry: I. Measurement of Micronucleus Induction in Peripheral Blood Polychromatic Erythrocytes by Chemicals with Known and Suspected Genotoxicity. Mutagenesis 12:1-8.
11. Hamada, S., Sutou, S., Morita, T., Wakata, A., Asanami, S., Hosoya, S., Ozawa, S., Kondo, K., Nakajima, M., Shimada, H., Osawa, K., Kondo, Y., Asano, N., Sato, S.-I., Tamura, H., Yajima, N., Marshall, R., Moore, C., Blakey, D.H., Weaver, J.L., Torus, D.K., Proudlock, R., Ito, S., Namiki, C., Hayashi, M. (1999). Evaluation of the Rodent Long-Term Micronucleus Assay: Summary of the 13th Collaborative Study by CSGMT/JEMS.MMS, Environ. Molec. Mutagenesis 37(2):93-110.
12. Hayashi, M., MacGregor, J.T., Gatehouse, D.G., Adler, I.-D., Blakey, D.H., Dertinger, S.D., Krishna, G., Morita, T., Russo, A. y Sutou, S. (2000). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay: II. Some Aspects of Protocol Design Including Repeated Treatements, Integration with Toxicity Testing, and Automated Scoring. Environ. Molec. Mutagenesis 35: 234-252.
13. Hayashi M., Mäki-Paakkanen J., Tanabe H., Honma M., Suzuki T., Matsuoka A., Mizusawa H., Sofuni T. (1994). Isolation of Micronuclei from Mouse Blood, Fluorescence In Situ Hybridization with a Mouse Centromeric DNA-Probe. Mutation Res. 307:245-251.
14. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T., e Ishidate, M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Research 245:245-249.
15. Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res. 120:241-247.
16. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. y Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res. 312:293-304.
17. Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res. 18:187-190.
18. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. y Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res. 123:61-118.
19. Henderson, L., Fedyk, J., Windebank, S., Smith, M. (1993). Induction of Micronuclei in Rat Bone Marrow and Peripheral Blood Following Acute and Subchronic Treatment with Azathioprine. Mutation Res. 291:79-85.
20. Higashikuni, N. y Sutou, S. (1995). An Optimal, Generalized Sampling Time of 30 ±6 h After Double Dosing in the Mouse Peripheral Blood Micronucleus Test. Mutagenesis 10:313-319.
21. Jauhar, P.P., Henika, P.R., MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Shelby, M.D., Murphy, S.A., Margolin, B.H. (1988). 1,3-Butadieno: Induction of Micronucleated Erythrocytes in the Peripheral Blood of B6C3F1 Mice Exposed by Inhalation for 13 Weeks. Mutation Res. 209:171-176.
22. Krishna, G., Criswell, K., Zielinski, D., Urda G., Juneau, P., Bleavins, M., Theiss, J., (1998a). Validación de la evaluación de micronúcleos en la rata mediante citometría de flujo con cinco compuestos modelo. Environ. Molec. Mutagen. 31:46.
23. Krishna, G., Urda, G., Theiss, J. (1998b). Principles and Practices of Integrating Genotoxicity Evaluation into Routine Toxicology Studies: A Pharmaceutical Industry Perspective. Environ. Molec. Mutagen. 32:115-120.
24. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. y Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays (Análisis estadístico de los ensayos citogenéticos in vivo): D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, Nueva York, Port Chester, Melbourne, Sydney pp. 184-232.
25. Luke, C.A., Tice, R.R., Drew, R.T. (1988). The Effect of Exposure Regimen and Duration on Benzene-Induced Bone-Marrow Damage in Mice. I. Sex Comparison in DBA/2 Mice. Mutation Res. 203:251-271.
26. MacGregor, J.T., Heddle, J.A., Hite, M., Margolin, G.H., Ramel C., Salamone, M.F., Tice, R.R. y Wild, D. (1987). Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes. Mutation Res. 189:103-112.
27. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., y Wehr, C.M. (1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in: «Developments in Science and Practice of Toxicology», Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell y T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.
28. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. y Gould, D.H. (1980). Clastogen-Induced Micronuclei in Peripheral Blood Erythrocytes: The Basis of an Improved Micronucleus Test. Environ. Mutagenesis 2:509-514.
29. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., y Shelby, M.E. (1990). The In Vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol. 14:513-522.
30. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., y Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res. 120:269-275.
31. Matter, B.E. and Schmid, W. (1971). Trenimon-Induced Chromosomal Damage in Bone Marrow Cells of Six Mammalian Species. Mutation Res. 12:417-425.
32. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. y Heddle, J.A. (1990). The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res. 239:29-80.
33. Miller B.M. y Adler I.-D. (1990). Application of Antikinetochore Antibody Staining (CREST Staining) to Micronuclei in Erythrocytes Induced In Vivo. Mutagenesis 5:411-415.
34. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. (1986). Cytogenetic Analysis Using Quantitative, High-Sensitivity Fluorescence Hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2934-2938.
35. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. y Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Parte I revisada. Cambridge University Press, Cambridge, Nueva York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
36. Romagna, F. y Staniforth , C.D.(1989). The Automated Bone Marrow Micronucleus Test. Mutation Res. 213:91-104
37. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1982). A Rapid Screen for Cumulative Chromosomal Damage in Mice. Accumulation of Circulating Micronucleated Erythrocytes. Mutation Res. 113:481-487.
38. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1983). The Persistence of Micronuclei in Peripheral Blood Erythrocytes: Detección de rotura cromosómica crónica en ratones. Mutatation Res. 104:367-369.
39. Schlegel, R. y MacGregor, J.T. (1984). The Persistence of Micronucleated Erythrocytes in the Peripheral Circulation of Normal and Splenectomized Fischer 344 Rats: Implicaciones para el cribado citogenético. Mutation Res. 127:169-174.
40. Schlegel, R., MacGregor, J.T. y Everson, R.B. (1986). Assessment of Cytogenetic Damage by Quantitation of Micronuclei in Human Peripheral Blood Erythrocytes. Cancer Res. 46:3717-3721.
41. Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test. Mutation Res. 31:9-15.
42. Schriever-Schwemmer G. y Adler I.-D. (1997). Differentiation of Micronuclei in Mouse Bone Marrow Cells: A Comparison between CREST Staining and Fluorescence In Situ Hybridization with Centromeric and Telomeric DNA Probes. Mutagenesis 9:333-340.
43. Schriever-Schwemmer G., Kliesch U., and Adler I.-D. (1994). Extruded Micronuclei Induced by Colchicine or Acrylamide Contain Mostly Lagging Chromosomes Identified in Paintbrush Smears by Minor and Major Mouse DNA Probes. Mutagenesis 12:201-207.
44. Tice, R.R., Furedi-Machacek, M., Satterfield, D.N.A., Udumudi, A., Vasquez, M., Dunnick, J.K. (1998). Measurement of Micronucleated Erythrocytes and DNA Damage During Chronic Ingestion of Phenolphthalein in Transgenic Female Mice Heterozygous for the p53 Gene. Environ. Molec. Mutagen. 31:113-124.
45. Tsuchimoto, T. y Matter, B.E. (1979). In Vivo Cytogenetic Screening Methods for Mutagens, with Special Reference to the Micronucleus Test. Arch. Toxicol. 42:239-248.
46. Vanderkerken K., Vanparys Ph., Verschaeve L., y Kirsch-Volders M. (1989). The Mouse Bone Marrow Micronucleus Assay Can be Used to Distinguish Aneugens from Clastogens. Mutagenesis 4:6-11.
47. Verschaeve L., Vanderkerken K., and Kirsch-Volders M. (1988). C-banding as a Simple Tool to Discriminate between Micronuclei Induced by Clastogens and Aneugens. Stain Technol. 63:351-354.
48. Witt, K.L., Gulati, D.K., Kaur, P., Shelby, M.D. (1995). Fenolftaleína: Induction of Micronucleated Erythrocytes in Mice. Mutation Res. 341:151-60.
49. Yamamoto K.I. y Kikuchi Y. (1980). A Comparison of Diameters of Micronuclei Induced by Clastogens and by Spindle Poisons. Mutation Res. 71:127-131.
50. Yamamoto K.I. y Kikuchi Y. (1981). Studies on Micronuclei Time Response and on the Effects of Multiple Treatments of Mutagens on Induction of Micronuclei. Mutation Res. 90:163-173.