Procedimientos de expresión de la proteína, purificación y ensayo de hAASS-SDH
Vector: pFB-LIC-Bse
Línea celular: DH10Bac
Etiquetas y adiciones: N-terminal, etiqueta de hexahistidina escindible por la proteasa TEV
Construir la secuencia de la proteína:
MGHHHHHHSSGVDLGTENLYFQ*SMALPDKYKYIQTLRESRERAQSLSMGTRRKVLVLGSGYISEPVLEYLSRDGNIEITVGSDMKNQIEQLGKKYNINPVSMDICKQEEKLGFLVAKQDLVISLLPYVLHPLVAKACITNKVNMVTASYITPALKELEKSVEDAGITIIGELGLDPGLDHMLAMESIDKAKEVGATIESYISYCGGLPAPEHSNNPLRYKFSWSPVGVLMNVMQSATYLLDGKVVNVAGGISFLDAVTSMDFFPGLNLEGYPNRDSTKYAEIYGISSAHTLLRGTLRYKGYMKALNGFVKLGLINREALPAFRPEANPLTWKQLLCDLVGISPSSEHDVLKEAVLKKLGGDNTQLEAAEWLGLLGDEQVPQAESILDALSKHLVMKLSYGPEEKDMIVMRDSFGIRHPSGHLEHKTIDLVAYGDINGFSAMAKTVGLPTAMAAKMLLDGEIGAKGLMGPFSKEIYGPILERIKAEGIIYTTQSTIKP
(la secuencia subrayada contiene la etiqueta His-y el sitio de corte de la proteasa TEV*)
Las células cosechadas se resuspendieron en tampón de lisis (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% de glicerol, 20 mM de imidazol pH 7,4, 0,5 mM de TCEP, 1 µL de cóctel inhibidor de proteasas por 1 mL sin EDTA).
El sedimento celular se disolvió en aproximadamente 200 mL de tampón de lisis y se rompió por homogeneización mediante 2 pases a 12.000 psi. Los restos celulares se pelletearon a 35000 x g, 1h y el sobrenadante se utilizó para la purificación en una columna Ni-NTA de flujo gravitacional (5 mL).
Los tampones utilizados se detallan a continuación;
Tampón de unión: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% Glicerol, 20 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Tampón de lavado: 50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glicerol, 40 mM Imidazol pH 7.4, 0.5 mM TCEP
Tampón de elución: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% Glicerol, 250 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
El extracto celular clarificado se añadió a 5 ml de resina Ni-NTA preequilibrada con tampón de lisis y se pasó por una columna de vidrio. A continuación, la columna se lavó con tampón de unión (2 x 50 mL) y tampón de lavado (2 x 50 mL). La proteína se eluyó con tampón de elución en fracciones de 5 x 5 mL. Las fracciones eluidas de la columna 1 se agruparon y concentraron a 5 mL con un concentrador de 30 kDa MWCO y se inyectaron en una columna S200 16/60 (preequilibrada en tampón GF (50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5% Glicerol)) a 1,0 mL/min. Se recogieron fracciones de 1,5 mL. La proteína eluida se escindió durante la noche a 4 °C con la proteasa TEV (1/20 (p/p)). Al día siguiente, la muestra de proteína se cargó en una columna de Ni-sefarosa de 0,5 ml preequilibrada con tampón GF para eliminar la proteína no escindida. Las fracciones de proteínas agrupadas se concentraron a 13 mg/mL utilizando un concentrador mwco de 30 kDa.
Ensayo de actividad y cribado
La actividad SDH de hAASS se midió siguiendo la reducción de NAD+ a NADH, aprovechando que la forma reducida de NADH es fluorescente cuando se excita con luz de 340 nm. Adoptamos el ensayo en formato de 384 pocillos, con detección mediante el lector de fluorescencia PheraStar (BMG Labtech) (Excitación/Emisión = 340/480 nm). Este ensayo dio una respuesta lineal con una concentración de proteína de hasta 150 nM. Una reacción típica consiste en 100 nM de enzima purificada, 0,2 mM de NAD+, 1,3 mM de sacaropina. El tampón de reacción está compuesto por 25 mM de HEPES pH 7,4, 100 mM de NaCl, 0,1% de BSA, 0,05% de CHAPS. Las bibliotecas de compuestos (LOPAC (Sigma) y NIH Clinical Collections I&II) se examinaron internamente a una concentración de compuesto de 20 μM.
La fluorimetría de barrido diferencial
DSF se realizó en una placa de 96 pocillos utilizando un equipo Mx3005p RT-PCR (Stratagene) con filtros de excitación y emisión de 492 y 610 nm, respectivamente. Cada pocillo constaba de 2 µl de proteína en tampón DSF 2 µM (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7,5), 2 µl de SYPRO ORANGE diluido 1000 veces en tampón DSF del stock del fabricante (Invitrogen), y (si procedía) 2 µl de ligando a varias concentraciones. Las intensidades de fluorescencia se midieron de 25 a 96°C con una tasa de rampa de 3°C/min.
Cristalización
Los cristales de Apo se prepararon mezclando 50 nL de proteína hAASS-SDH (80 mg/mL) con 100 nL de solución de reserva que contenía 20% de PEG3350, 0,1M Tris pH 7,5 y 0,2-0,33 M de malonato de sodio. Los cristales unidos a NAD+ se prepararon mezclando 100 nL de hAASS-SDH (18 mg/mL, en exceso molar de NAD+) con 50 nL de solución de depósito que contenía 25% de PEG3350, 0,2M de NaCl y 0,1M de Tris pH 8,5. Los cristales se crioprotegieron en butanodiol al 9% antes de congelarlos en nitrógeno líquido. Para la campaña de cribado de fragmentos, los cristales se empaparon con compuestos (10/50/500 mM) en la solución de cristalización suplementada con butanediol al 8% durante 5-30 min, y se congelaron en nitrógeno líquido.
Procedimientos de determinación de la estructura
Los cristales de hAASS-SDH apo y NAD+ pertenecen a diferentes grupos espaciales (P43212 vs P212121). La estructura de hAASS-SDH se resolvió por sustitución molecular con el programa PHASER, utilizando la sacaropina reductasa fúngica de S.cerevisiae (código PDB 2AXQ) como modelo de búsqueda (38% de identidad de secuencia). Se encontraron dos moléculas en la unidad asimétrica (u.a.). El modelo inicial se reconstruyó utilizando phenix.autobuild. Se identificó una molécula de NAD+ unida en el sitio activo mediante el método de diferencia de Fourier y se colocó manualmente en la densidad de electrones utilizando Coot. Para completar el modelo se realizaron ciclos iterativos de phenix.refine incluyendo el refinamiento TLS seguido de la construcción manual del modelo para los residuos que faltaban utilizando coot. No se aplicaron restricciones NCS debido a las diferencias conformacionales en el dominio III (res 278-376) de las dos copias en el a.u. Los átomos de disolvente se colocaron durante las últimas cuatro rondas de refinamiento utilizando phenix.refine. Para la campaña de cribado de fragmentos, los ligandos se identificaron mediante DIMPLE (8)(https://github.com/ccp4/dimple) utilizando mapas de densidad de diferencias. Los ligandos más débiles con baja ocupación se evaluaron utilizando PANDDA (9)(https://pandda.bitbucket.io/), basado en modelos estadísticos para encontrar la densidad del ligando presente en un conjunto de datos dado que no está presente en la mayoría de los conjuntos de datos. Las coordenadas y los factores de estructura de todos los conjuntos de datos están depositados en el RCSB Protein Data Bank. La recopilación de datos y las estadísticas de refinamiento están disponibles en las páginas del PDB.
Reactivos disponibles en el mercado
Plásmidos de knockoutCRISPR/Cas9
SCBT: Cat # sc-406408
Genscript: Cat # 10157