El kit ELISA de autoanticuerpos contra la 21-hidroxilasa (21-OH Ab) está destinado a ser utilizado únicamente por profesionales, para la determinación cuantitativa de 21-OH Ab en suero humano. La destrucción autoinmune de la corteza suprarrenal es la causa más común de la enfermedad de Addison y los autoanticuerpos contra la enzima específica suprarrenal 21-hidroxilasa son marcadores importantes de autoinmunidad suprarrenal. Este puede ser el caso si la enfermedad se presenta como enfermedad de Addison o como parte de los síndromes poliglandulares autoinmunes (APS) tipo I o tipo II.
En el kit ELISA de 21-OH Ab, se permite que los 21-OH Ab de los sueros de los pacientes, los calibradores y los controles interactúen con los 21-OH recubiertos en los pocillos de la placa ELISA. Después de una incubación de 16 a 20 horas, las muestras se desechan dejando el 21-OH Ab unido al 21-OH recubierto en los pocillos. Se añade 21-OH-Biotina en un segundo paso de incubación en el que, gracias a la capacidad del 21-OH Ab de actuar de forma divalente, se forma un puente entre el 21-OH inmovilizado en la placa y la 21-OH-Biotina. La cantidad de 21-OH-Biotina unida se determina entonces en un tercer paso de incubación que implica la adición de estreptavidina peroxidasa (SA-POD), que se une específicamente a la Biotina. El exceso de SA-POD no unida se lava y la adición del sustrato de peroxidasa 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) da lugar a la formación de un color azul. Esta reacción se detiene mediante la adición de una solución de parada, lo que hace que el contenido de los pocillos se vuelva amarillo. La absorbencia de la mezcla de reacción amarilla a 450 nm y 405 nm se lee entonces con un lector de placas ELISA. Una mayor absorbencia indica la presencia de 21-OH Ab en la muestra de ensayo. La lectura a 405nm permite cuantificar las absorbancias altas. Se recomienda que los valores inferiores a 1 U/ml se midan a 450 nm. Si es posible leer a una sola longitud de onda se puede utilizar 405nm. El intervalo de medición es de 0,3 – 100 U/ml (unidades arbitrarias).