Resumen
La ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa es una técnica poderosa para fraccionar macromoléculas como el ADN, el ARN y las proteínas. Para ello, una muestra que contiene una mezcla de macromoléculas de diferente tamaño se coloca en la superficie de un gradiente cuya densidad aumenta linealmente de arriba a abajo. Durante la centrifugación, las macromoléculas de diferentes tamaños se sedimentan a través del gradiente a diferentes velocidades. La velocidad de sedimentación depende, además de la fuerza centrífuga, del tamaño, la forma y la densidad de las macromoléculas, así como de la densidad y la viscosidad del gradiente. De este modo, las macromoléculas se separan por tamaño, con las más grandes sedimentando hacia el fondo y las más ligeras permaneciendo cerca de la parte superior del gradiente. El método ha sido especialmente exitoso en el fraccionamiento por tamaño de grandes moléculas de ADN y se ha utilizado ampliamente para medir la inducción y reparación de roturas de ADN tras la exposición a factores clastogénicos. Aquí describimos una adaptación de este método que puede utilizarse en el análisis del ADN recién sintetizado que se forma durante la replicación del ADN. Mediante el análisis del tamaño del ADN naciente en gradientes alcalinos de sacarosa, se pueden medir las variaciones en la actividad de replicación tras la exposición de las células a agentes que dañan el ADN. El método es especialmente útil, ya que permite distinguir entre los efectos mediados por el daño del ADN en la elongación de la cadena frente a la iniciación del replicón, lo que es esencial para un análisis en profundidad del punto de control de la fase intra-S. Esta capacidad hace que la técnica sea única y justifica su naturaleza algo intensiva en trabajo.