Los contenidos de azúcares y ácidos orgánicos son factores importantes para el sabor de los frutos de tomate y son rasgos importantes de mejora. Aquí proporcionamos un protocolo mejorado para la cuantificación precisa de los principales azúcares, glucosa y fructosa, y de los ácidos orgánicos, ácido cítrico y ácido málico, presentes en el tomate. El extracto de tomate se adiciona con lactosa y ácido tricarbálico como estándares internos y se carga en una columna de extracción en fase sólida (SPE) de NH2. Los azúcares aparecen en el flujo y se analizan posteriormente por HPLC utilizando una columna de NH2 Nucleodur y un detector de índice de refracción. Los ácidos orgánicos se unen a la columna SPE y se eluyen con ácido fosfórico de 400 µm. Para el análisis, los ácidos orgánicos se separan por HPLC utilizando una columna Nucleodur C18ec y se detectan por absorción UV a 210 nm. El método muestra una excelente reproducibilidad interdiaria e intradiaria para la glucosa, la fructosa y el ácido cítrico, con desviaciones estándar del 1-5%. La cuantificación del ácido cítrico por HPLC y GC-MS mostró una perfecta concordancia con una desviación inferior al 3%.