- Abstract
- 1. Introducción
- 2. Materiales y métodos
- 2.1. Población del estudio
- 2.2. Preparación del plasma y del ADN
- 2.3. La estimación de los niveles plasmáticos de 8-Hidroxi 2′-Deoxiguanosina
- 2.4. Las muestras de ADN se secuenciaron para los dos polimorfismos comunes del gen LOXL1 (rs1048661 y rs3825942) utilizando los cebadores y las condiciones de amplificación descritas en otra parte. Análisis estadístico
- 3. Resultados
- 3.1. Población de estudio y niveles de 8-OHdG
- 3.2. Niveles de 8-OHdG y riesgo de PXG
- 3.3. Investigamos además el efecto del genotipo de los polimorfismos rs1048661 (g.5758 G>T) y rs3825942 (g.5758 G>A) en el gen LOXL1 sobre los niveles de 8-OHdG en los casos y controles de PXG. En general, como se muestra en la Tabla 3, no hubo diferencias significativas entre los niveles de 8-OHdG y los diferentes genotipos para ambos polimorfismos de LOXL1 (Figuras 1(c) y 1(d)). Genotipos de LOXL1 8-OHdG ng/mL, media (SD) valor Controles Casos rs1048661 G/G 18.55 (12,04) 30,16 (17,90) 0,236 G/T 13,71 (8,16) 21,99 (19,31) 0.617 T/T 7,84 – – G/T + T/T 13,26 (7,98) 21,99 (19,31) 0.469 rs3825942 G 18.53 (10,68) 28,89 (30,97) 0,369 G/A 12.93 (11,46) 11,83 – A 16,13 (11.33) – – G/A + A 14,00 (11,11) 11.83 – Nota. los valores probados dentro de los grupos utilizando G/G como referencia mediante la prueba U de Mann-Whitney tampoco fueron significativos (). Tabla 3 Niveles de 8-hidroxi-deoxiguanosina (8-OHdG) según los polimorfismos de LOXL1 rs1048661 y rs3835942 en los casos y controles de glaucoma de pseudoexfoliación. Para el rs1048661, G/G fue el genotipo más común, seguido de G/T y T/T. No se observó ninguna homocigosidad T/T en el grupo de pacientes en comparación con sólo una en los controles. Se observó que los niveles medios de 8-OHdG eran más altos en los genotipos G/G en comparación con los grupos G/T, T/T o G/T + T/T. Sin embargo, estos niveles no variaron significativamente tanto dentro de las comparaciones de los grupos de estudio como entre ellas. De forma similar, para el rs383592, G/G fue el genotipo más prevalente, seguido de los genotipos G/A y A/A, estando este último ausente en los pacientes PXG. G/G fue el genotipo más común que mostró los niveles más altos de 8-OHdG en comparación con los grupos G/A, A/A o G/A + A/A. Los niveles no variaron significativamente entre los casos y los controles para los genotipos G/G (). Además, una comparación dentro del grupo en los controles tampoco mostró ningún efecto significativo del genotipo en la 8-OHdG para G/A (), A/A, () y G/A + A/A () en comparación con el genotipo G/G. 3.4. Niveles de 8-OHdG y otros factores de riesgo
- 3.5. Correlación entre la 8-OHdG y otros índices de glaucoma en pacientes con PXG
- 3.6. Curva ROC y 8-OHdG
- 4. Discusión
- 5. Conclusión
- Disponibilidad de datos
- Aprobación ética
- Consentimiento
- Conflictos de intereses
- Agradecimientos
Abstract
Objetivo. Para investigar el daño sistémico del ADN inducido por el estrés oxidativo en pacientes con glaucoma de pseudoexfoliación (PXG), estimamos los niveles plasmáticos de 8-hidroxi-2′-deoxiguanosina (8-OHdG) como marcador del daño oxidativo del ADN en comparación con los controles. Además, también examinamos un efecto combinado del estado del polimorfismo de la lisil oxidasa 1 (LOXL1) y los niveles de 8-OHdG sobre el riesgo de PXG. Materiales y métodos. Se realizó un estudio retrospectivo de casos y controles para estimar los niveles plasmáticos de 8-OHdG en 41 pacientes con PXG y 45 controles no laucomatosos utilizando el ensayo inmunoenzimático (ELISA). El ensayo se realizó por duplicado en un analizador ELISA automatizado. Dos polimorfismos comunes (rs1048661 y rs3835942) en el gen LOXL1 fueron genotipados mediante secuenciación Sanger. Resultados. Los niveles medios y medianos de 8-OHdG estaban significativamente aumentados en los casos de PXG () y en los sujetos masculinos (). Los sujetos con niveles superiores al tercer cuartil (percentil del 75%) mostraron un aumento significativo del riesgo de PXG (odds ratio = 4,06, intervalo de confianza del 95% (IC = 1,11-14,80, )). Las comparaciones dentro y entre grupos mostraron que los niveles medios eran mayores en los individuos portadores de la variante de riesgo LOXL1 (G/G), pero no fueron estadísticamente significativos. En el análisis de regresión logística, tanto la 8-OHdG () como el rs3835942 () mostraron un efecto estadísticamente significativo sobre el resultado de la PXG. Sin embargo, el efecto se perdió cuando se incluyeron la edad, el sexo y el rs1048661. Se observó una correlación positiva significativa entre los niveles de 8-OHdG y la presión intraocular (, ) y la relación copa/disco (, ). Además, en el análisis de las características operativas del receptor, el área bajo la curva fue estadísticamente significativa () con un valor de 0,635 (IC del 95% = 0,518-0,751). Conclusiones. El estudio demuestra una asociación de aumento de los niveles plasmáticos de 8-OHdG en pacientes con PXG, apoyando el papel del estrés oxidativo, y el aumento del daño oxidativo del ADN en el desarrollo de PXG.
1. Introducción
El glaucoma es una de las principales causas de ceguera irreversible en todo el mundo , incluyendo en Arabia Saudí . Como resultado de la obstrucción del flujo de salida del humor acuoso en la malla trabecular (MT), la presión intraocular (PIO) elevada se considera un factor de riesgo primario que desencadena la muerte de las células ganglionares de la retina (CGR) y la pérdida progresiva de los axones de las CGR, causando la neuropatía óptica glaucomatosa . El glaucoma de pseudoexfoliación (PXG) suele caracterizarse por la acumulación de materiales extraceulares fibrilares anormales en el segmento anterior del ojo, principalmente a lo largo del borde pupilar, lo que se considera un sello patológico de la enfermedad. En comparación con el glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA) más común, los pacientes con PXG suelen mostrar un curso clínico más agresivo, con una PIO más alta, una copa más grande, defectos graves del campo visual y un peor pronóstico con una rápida progresión de la enfermedad . Faltan estudios epidemiológicos sistemáticos en la literatura para conocer la prevalencia exacta del PXG en Arabia Saudí. Sin embargo, se ha observado que de aproximadamente 600 nuevos casos de glaucoma registrados en nuestra unidad de glaucoma del Hospital Universitario Rey Abdulaziz de Riad, menos del 10% de estos casos son diagnosticados de PXG.
El PXG representa una enfermedad compleja y multifactorial de inicio en la edad adulta. La enfermedad implica tanto factores genéticos como ambientales que contribuyen a la fisiopatología etiológica de la enfermedad . La lisil oxidasa 1 (LOXL1) es un fuerte gen candidato que contribuye al riesgo de desarrollo de PXG en múltiples grupos étnicos, incluidos los árabes saudíes. LOXL1 está implicado en la formación y estabilidad de la matriz extracelular. Existen sólidas líneas de evidencia que sugieren el papel de los mecanismos de estrés oxidativo en la patogénesis del PXG. El estrés oxidativo se induce generalmente a través de la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) como el superóxido, el peróxido y los radicales hidroxilos que pueden iniciar y propagar los radicales libres . La acumulación de niveles de ROS en las células induce el daño oxidativo en macromoléculas como los lípidos, las proteínas, el ARN, el ADN y las mitocondrias, lo que provoca su disfunción celular y/o apoptosis . Se ha demostrado que el estrés oxidativo provoca un aumento de la PIO al iniciar la degeneración de la MT, dificultando así la vía de salida del agua. Las mutaciones, los haplogrupos y la disminución de las actividades respiratorias en las mitocondrias también se han asociado a varios tipos de glaucoma . Además, un polimorfismo en el gen de la glutatión S-transferasa (GST), una enzima que participa en la desintoxicación de lípidos peroxidados y diversas toxinas nocivas, también se ha asociado al glaucoma . La reducción de la actividad de la GST puede interferir en la desintoxicación de los metabolitos oxidativos y agravar los efectos perjudiciales del estrés oxidativo en el nervio óptico. El estado antioxidante total (TAS) de las muestras biológicas es un importante indicador del estrés oxidativo y una herramienta útil para predecir el estado oxidativo . Nuestro estudio anterior ha demostrado que los niveles de TAS en plasma eran significativamente bajos en los pacientes con PXG en comparación con los controles, apoyando el papel del estrés oxidativo en la patogénesis del PXG . Además, también informamos de un efecto combinado de los alelos LOXL1 y la disminución de la TAS que puede contribuir al riesgo general de PXG. En humanos, los experimentos in vivo han demostrado que el daño oxidativo del ADN es significativamente más abundante en las células de la MT de los pacientes con glaucoma. Además, tanto el aumento de la PIO como el daño en el campo visual estaban significativamente relacionados con la cantidad de daño oxidativo en el ADN que afectaba a las células TM . El estrés oxidativo/ROS puede inducir roturas o modificaciones de las bases del ADN que dan lugar a la liberación de productos de oxidación del ADN, incluida la 8-hidroxi-2′-deoxiguanosina (8-OHdG) . La 8-OHdG es uno de los múltiples productos de la oxidación del ADN que puede cuantificarse fácilmente y se utiliza habitualmente como biomarcador para evaluar el daño oxidativo del ADN .
El objetivo de este estudio fue investigar el daño sistémico del ADN inducido por el estrés oxidativo en pacientes con PXG. Estimamos los niveles plasmáticos de 8-OHdG como marcador del daño oxidativo del ADN y lo comparamos con los controles sanos no glaucomatosos. Además, también investigamos el efecto combinado del estado del polimorfismo LOXL1 y el nivel de 8-OHdG sobre el riesgo de PXG.
2. Materiales y métodos
2.1. Población del estudio
El estudio se adhirió a los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por la junta de revisión institucional y el comité de ética de investigación (número de aprobación # 08-657). Tras el consentimiento informado por escrito, se reclutaron para el estudio participantes de origen saudí con diagnóstico clínico establecido de PXG () y controles sanos emparejados étnicamente () en el Hospital Universitario Rey Abdulaziz de Riad, Arabia Saudí. Los criterios de inclusión-exclusión de los pacientes y controles se han descrito previamente.
2.2. Preparación del plasma y del ADN
Las muestras de plasma se obtuvieron a partir de sangre con EDTA tras centrifugación a 5500 ×g durante 5 min. El ADN se extrajo de la capa buffy utilizando el kit illustra blood genomicPrep Mini Spin (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). Se almacenó a -80°C hasta su uso.
2.3. La estimación de los niveles plasmáticos de 8-Hidroxi 2′-Deoxiguanosina
La estimación de los niveles de 8-OHdG se realizó utilizando un kit comercial (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA) basado en un ensayo inmunoenzimático competitivo tipo sándwich (ELISA). El ensayo se realizó por duplicado en un analizador ELISA automatizado ChemWell-T (Awareness Technology Inc., FL, EE.UU.), según las instrucciones del fabricante. Los niveles de 8-OHdG se establecieron utilizando la curva estándar y se expresaron en ng/mL.
2.4. Las muestras de ADN se secuenciaron para los dos polimorfismos comunes del gen LOXL1 (rs1048661 y rs3825942) utilizando los cebadores y las condiciones de amplificación descritas en otra parte. Análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± DE y mediana para las variables continuas y como recuentos y porcentajes para las variables categóricas. La prueba de normalidad para los niveles de 8-OHdG se realizó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Las diferencias de medias entre grupos se comprobaron mediante la prueba t de Student. La prueba U de Mann-Whitney se utilizó para comparar los valores medios entre los pacientes y los controles. Las variables categóricas se analizaron mediante la prueba de la chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher cuando procedía. Las pruebas de correlación se realizaron mediante el método de Pearson. Se realizó un análisis de regresión logística binaria para estimar el impacto y el efecto de los niveles medios de 8-OHdG y otros factores de riesgo en el resultado de la enfermedad. Se generó una curva de características operativas del receptor (ROC) y el valor del área bajo la curva (AUC) se analizó mediante la prueba de Mann-Whitney. Se calculó la odds ratio (OR) y se estableció un intervalo de confianza (IC) del 95%. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras, y un valor inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS versión 19.0 (IBM Corp., Armonk, Nueva York, EE.UU.) y el programa StatView versión 5.0 (SAS Institute, Cary, NC).
3. Resultados
3.1. Población de estudio y niveles de 8-OHdG
Como se muestra en la Tabla 1, no hubo diferencias significativas entre los casos de PXG y los controles en cuanto a la edad, el sexo, el estado de la enfermedad sistémica, el tabaquismo y los antecedentes familiares de glaucoma. Las pruebas de normalidad para los niveles de 8-OHdG mostraron una distribución sesgada (). Tanto la media como la mediana de los niveles de 8-OHdG fueron significativamente elevados en los casos de PXG y en los sujetos masculinos en comparación con los controles (Tabla 1). Las figuras 1(a) y 1(b) muestran la representación de los niveles de 8-OHdG según el estado de la enfermedad y la distribución por sexos, respectivamente.
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Notas. aPrueba t de muestras independientes (de dos colas); bPrueba de la cuadrícula dechi; cPrueba U de Mann-Whitney.
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(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. Niveles de 8-OHdG y riesgo de PXG
Para evaluar el riesgo de PXG asociado al aumento de los niveles de 8-OHdG, se dicotomizaron las concentraciones de 8-OHdG (sin categorizar como casos y controles) en el percentil 50 (o valor mediano) y por cuartiles (Tabla 2). La mediana global del nivel de 8-OHdG fue de 17,68 ng/mL. Aunque los casos mostraron un mayor riesgo de enfermedad en este nivel (OR = 1,76; IC del 95% = 0,75-4,15), la diferencia no fue significativa (). Asimismo, utilizando la distribución por cuartiles, se identificaron dos niveles de corte: 10,08 ng/mL (el primer cuartil o el percentil 25) y 27,72 ng/mL (el tercer cuartil o el percentil 75). Utilizando estos dos valores de corte, los sujetos se clasificaron en tres grupos: menos del primer cuartil, el intercuartil y más del tercer cuartil (Tabla 2). En general, no hubo un efecto aditivo significativo de los niveles crecientes de 8-OHdG y el resultado de PXG (χ2 = 4,87, df = 2; ). Además, en comparación con los niveles de 8-OHdG inferiores al primer cuartil (<10,08 ng/mL), los sujetos con niveles intercuartiles mostraron un aumento no significativo del riesgo de enfermedad (OR = 2,50; IC 95% = 0,81-7.63, ), mientras que los sujetos con niveles superiores al tercer cuartil (percentil 75) mostraron un aumento significativo del riesgo de PXG (OR = 4,06, IC 95% = 1.11-14,80, ).
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Nota. aTest de Chi-cuadrado; †primer cuartil (<percentil 25); intercuartil (percentil 25-75); tercer cuartil (>percentil 75).
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3.3. Investigamos además el efecto del genotipo de los polimorfismos rs1048661 (g.5758 G>T) y rs3825942 (g.5758 G>A) en el gen LOXL1 sobre los niveles de 8-OHdG en los casos y controles de PXG. En general, como se muestra en la Tabla 3, no hubo diferencias significativas entre los niveles de 8-OHdG y los diferentes genotipos para ambos polimorfismos de LOXL1 (Figuras 1(c) y 1(d)).
Genotipos de LOXL1
8-OHdG ng/mL, media (SD)
valor
Controles
Casos
rs1048661
G/G
18.55 (12,04)
30,16 (17,90)
0,236
G/T
13,71 (8,16)
21,99 (19,31)
0.617
T/T
7,84
–
–
G/T + T/T
13,26 (7,98)
21,99 (19,31)
0.469
rs3825942
G
18.53 (10,68)
28,89 (30,97)
0,369
G/A
12.93 (11,46)
11,83
–
A
16,13 (11.33)
–
–
G/A + A
14,00 (11,11)
11.83
–
Nota. los valores probados dentro de los grupos utilizando G/G como referencia mediante la prueba U de Mann-Whitney tampoco fueron significativos ().
Tabla 3
Niveles de 8-hidroxi-deoxiguanosina (8-OHdG) según los polimorfismos de LOXL1 rs1048661 y rs3835942 en los casos y controles de glaucoma de pseudoexfoliación.
Para el rs1048661, G/G fue el genotipo más común, seguido de G/T y T/T. No se observó ninguna homocigosidad T/T en el grupo de pacientes en comparación con sólo una en los controles. Se observó que los niveles medios de 8-OHdG eran más altos en los genotipos G/G en comparación con los grupos G/T, T/T o G/T + T/T. Sin embargo, estos niveles no variaron significativamente tanto dentro de las comparaciones de los grupos de estudio como entre ellas.
De forma similar, para el rs383592, G/G fue el genotipo más prevalente, seguido de los genotipos G/A y A/A, estando este último ausente en los pacientes PXG. G/G fue el genotipo más común que mostró los niveles más altos de 8-OHdG en comparación con los grupos G/A, A/A o G/A + A/A. Los niveles no variaron significativamente entre los casos y los controles para los genotipos G/G (). Además, una comparación dentro del grupo en los controles tampoco mostró ningún efecto significativo del genotipo en la 8-OHdG para G/A (), A/A, () y G/A + A/A () en comparación con el genotipo G/G.
3.4. Niveles de 8-OHdG y otros factores de riesgo
Con el fin de examinar el efecto de la edad, el sexo, los polimorfismos de LOXL1 y los niveles de 8-OHdG en pacientes con PXG, se realizó un análisis de regresión logística binaria utilizando como variable dependiente (resultado) el estar enfermo/sin estarlo. El análisis mostró que tanto la 8-OHdG () como el rs3835942 () tienen un efecto estadísticamente significativo en el resultado de la enfermedad. Sin embargo, en un análisis combinado con la edad, el sexo, la 8-OHdG, el rs1048661 y el rs3835942, ninguno de estos factores de riesgo mostró un impacto significativo sobre la PXG (Tabla 4).
Variables de riesgo
Valor de la odds ratio (intervalo de confianza del 95%)
Edad
1.035 (0,964-1,112)
0,345
Sexa
1,150 (0,352-3,762)
0,817
8-OHdGb
1.035 (0,985-1,053)
0,292
rs1048661c
–
0.599
rs3835942c
–
0,073
Nota. aMujeres como referencia; b 8-OHdG, 8-hidroxi-deoxiguanosina; c genotipos G/G como referencia.
Tabla 4
Análisis de regresión logística binaria de las variables de riesgo sobre el resultado de la enfermedad.
3.5. Correlación entre la 8-OHdG y otros índices de glaucoma en pacientes con PXG
Se observó una correlación positiva significativa entre la 8-OHdG y la PIO (, ) y la relación copa/disco (, ), frente a ninguna con la edad (, ) y el número de medicación antiglaucomatosa (, ).
3.6. Curva ROC y 8-OHdG
El análisis de la curva ROC de los niveles de 8-OHdG en pacientes y controles de PXG reveló un AUC de 0,635 (IC del 95% = 0,518-0,751) que fue estadísticamente significativo (, ), indicando que los niveles plasmáticos de 8-OHdG podían discriminar satisfactoriamente entre pacientes y controles de PXG.
4. Discusión
El aumento de ROS, el daño oxidativo y el desequilibrio entre el estado prooxidante y el estado antioxidante son factores críticos que contribuyen significativamente a la neurodegeneración glaucomatosa . Este estudio informa de un aumento de los niveles de 8-OHdG sistémica, un marcador de daño del ADN inducido por el estrés oxidativo, en pacientes con PXG.
El daño del ADN puede ser infligido por agentes extrínsecos e intrínsecos como las radiaciones ionizantes, la luz ultravioleta, los productos químicos tóxicos / iones metálicos, y ROS generados como consecuencia del metabolismo celular normal de oxígeno . Los procesos endógenos que pueden contribuir a un daño continuo del ADN in vivo incluyen la metilación oxidativa, la depuración y la desaminación. Los daños inducidos por las ROS incluyen lesiones en las bases y los azúcares, enlaces cruzados de proteínas y ADN, y roturas de una o dos cadenas. Además, la base guanina es la más susceptible a las modificaciones oxidativas debido a su menor potencial redox . El subproducto más común que se forma debido a la modificación oxidativa de la guanina por el radical hidroxilo es la 8-hidroxiguanina (8-OH-Gua) y su equivalente 2′-desoxinucleósido, 8-OHdG, que se propone como un excelente marcador del daño oxidativo del ADN . Varios estudios han aportado pruebas sólidas de la asociación entre el aumento de los niveles de 8-OHdG y la neuropatía óptica glaucomatosa.
Los primeros estudios sobre muestras de TM humana obtenidas durante la cirugía de filtración han demostrado la presencia de niveles elevados de 8-OHdG en pacientes con glaucoma . En un estudio realizado por Sorkhabi et al. que incluyó a 15 pacientes con GPAA y 13 con PXG, tanto los niveles de 8-OHdG en el humor acuoso (AH) como en el suero eran elevados en los pacientes en comparación con los controles . Del mismo modo, se han notificado niveles elevados de 8-OHdG en suero en pacientes con glaucoma primario de ángulo cerrado en comparación con sujetos normales. Yuki y Tsubota informaron de que un mayor nivel de 8-OHdG/creatinina en orina se asociaba con la progresión del campo visual glaucomatoso en sujetos con glaucoma de tensión normal . Asimismo, en otro estudio reciente realizado por Mohanty et al., los niveles de 8-OHdG en plasma y en la orina eran significativamente mayores en los pacientes con GPAA en comparación con los controles de cataratas. Este efecto se atribuyó a una menor expresión de las enzimas de reparación del ADN de la vía de reparación de escisión de bases . Además, el estudio también informó de una fuerte correlación positiva entre los niveles sistémicos (plasma) de 8-OHdG y los niveles de AH 8-OHdG, lo que sugiere que los niveles sistémicos de 8-OHdG podrían ser predictivos de los niveles locales de 8-OHdG en el ojo.
El papel exacto de la 8-OHdG y/o el estrés oxidativo que conduce al desarrollo y la progresión de la neuropatía óptica glaucomatosa es todavía especulativo. El 8-OHdG se encuentra entre las lesiones oxidativas mejor caracterizadas, y puede dar lugar a mutaciones de transversión C : G a A : T . Algunas lesiones en el ADN están sujetas a la reparación celular mediante mecanismos de reparación del ADN in vivo que escinden el ADN dañado . Sin embargo, el fracaso en la reparación de estos daños puede tener graves implicaciones biológicas y puede conducir a la carcinogénesis o al desarrollo de trastornos neurodegenerativos . El 8-OHdG también puede inducir de forma significativa el acortamiento de los telómeros, lo que puede contribuir a las condiciones fisiológicas y patológicas in vivo. Además, se ha sugerido que la 8-OHdG puede tener un papel regulador de tipo epigenético en las células sometidas a estrés oxidativo en la regulación de la transcripción de genes . Además, los efectos anormales del estrés oxidativo y las ERO en la patogénesis del glaucoma a través del aumento de la PIO y/o la hipoxia, la degeneración de la TM, el daño de las células gliales, la autofagia, el daño del ADNmt, la activación del núcleo-kappa B, el estrés por peroxinitrito y la hemodinámica ocular que estimula la apoptosis y las vías inflamatorias para promover la muerte de las CGR y el daño del nervio óptico han sido bien documentados. El aumento de los niveles de 8-OHdG observado en nuestro estudio puede contribuir a la patogénesis de la PXG por mecanismos similares.
Una fuerte asociación de dos variantes de sentido erróneo, rs1048661 y rs3825942, en el gen LOXL1 con la PXG se ha replicado consistentemente en múltiples grupos étnicos, incluyendo los árabes saudíes . Todavía no se conoce una comprensión completa de esta asociación genética con la patología de la PXG; sin embargo, se han postulado varios mecanismos. Estos incluyen su efecto en la formación de elastina, la expresión alterada de LOXL1, el efecto de empalme, o la posibilidad de su asociación/vinculación con un alelo funcional actual no identificado . Se investigaron los efectos del genotipo de estas dos variantes comunes en la 8-OHdG y su efecto combinado en el riesgo de PXG. No se encontró que los genotipos influyeran en los niveles de 8-OHdG, aunque los niveles eran altos en las variantes de riesgo (G/G). Tanto la 8-OHdG como el rs3835942 resultaron ser factores de riesgo significativos para la PXG. Sin embargo, esta significación se perdió en un análisis combinado que también incluía la edad, el sexo y los genotipos del rs1048861. Una falta de números suficientes en cada grupo de genotipos podría ser una explicación probable a esta pérdida y ausencia de cualquier efecto significativo.
Un aumento de la PIO y el daño del campo visual se han correlacionado significativamente con la cantidad de daño oxidativo del ADN en las células TM . Del mismo modo, la PIO y la relación copa/disco también mostraron una correlación positiva significativa con los niveles de 8-OHdG en nuestro estudio, lo que sugiere su posible utilidad como marcador de la gravedad de la enfermedad. Además, varios informes han apoyado la existencia de una relación inversa entre los mecanismos de defensa antioxidante y el estrés oxidativo en la fisiopatología del glaucoma. Nuestro grupo también ha informado previamente de una reducción significativa del estado antioxidante total (TAS) en plasma en pacientes con PXG en comparación con los controles. Curiosamente, los niveles de TAS estaban disponibles para los pacientes de PXG (no para los controles; datos no mostrados) incluidos en este estudio que mostró una correlación negativa significativa entre 8-OHdG y TAS en los pacientes de PXG (, ), apoyando el papel plausible del aumento del estrés oxidativo y la disminución de los mecanismos de defensa antioxidante en PXG.
Los hallazgos de este estudio requieren una interpretación cautelosa debido a sus ciertas limitaciones. En primer lugar, tenemos que reconocer el hecho de que el aumento sistémico de 8-OHdG puede no reflejar exactamente la situación en la cámara anterior del ojo, donde las células/los tejidos están constantemente expuestos a una mayor cantidad de insultos de los radicales libres y, por lo tanto, están más directamente involucrados en el desarrollo y la progresión del glaucoma a través de los mecanismos de estrés oxidativo. Esto requeriría una validación adicional en muestras de AH. En segundo lugar, el estudio es de naturaleza puramente descriptiva y no aporta ninguna prueba temporal o mecanicista ni sugiere ninguna implicación causal de la elevación de la 8-OHdG en la PXG. Por último, en este estudio se ha examinado un número relativamente pequeño de muestras. Una réplica en una cohorte mucho mayor reforzaría sin duda las observaciones de este estudio. No obstante, considerando una diferencia media (tamaño del efecto) de 13 ng/mL en la concentración de 8-OHdG observada entre los casos de PXG y los controles, con una desviación estándar media de 20 y un error de tipo I de 0,05 (de dos caras), el estudio presenta una potencia de >80%.
5. Conclusión
Para concluir, el estudio demuestra un nivel aumentado de 8-OHdG sistémico en pacientes con PXG, apoyando una asociación de este marcador con la PXG, y el papel plausible del estrés oxidativo y el aumento del daño oxidativo del ADN en la etiología de la PXG.
Disponibilidad de datos
Los datos que apoyan las conclusiones de este artículo se presentan todos dentro del artículo.
Aprobación ética
El estudio se adhirió a los principios de la Declaración de Helsinki y recibió la aprobación de la Junta de Revisión Institucional y el Comité de Ética de la Investigación de la Facultad de Medicina, Universidad Rey Saud, Riad, Arabia Saudí.
Consentimiento
Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de su inclusión en este estudio.
Conflictos de intereses
Los autores no informan de ningún conflicto de intereses. El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, en la recogida, el análisis y la interpretación de los datos, ni en la redacción del manuscrito. Los autores son los únicos responsables del contenido y la redacción del artículo.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la Cátedra del Vicedecanato de Investigación Científica y a la Cátedra de Investigación del Gluacoma en Oftalmología de la Universidad Rey Saud a través de la cual se apoyó este trabajo.
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Nota. los valores probados dentro de los grupos utilizando G/G como referencia mediante la prueba U de Mann-Whitney tampoco fueron significativos ().
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Para el rs1048661, G/G fue el genotipo más común, seguido de G/T y T/T. No se observó ninguna homocigosidad T/T en el grupo de pacientes en comparación con sólo una en los controles. Se observó que los niveles medios de 8-OHdG eran más altos en los genotipos G/G en comparación con los grupos G/T, T/T o G/T + T/T. Sin embargo, estos niveles no variaron significativamente tanto dentro de las comparaciones de los grupos de estudio como entre ellas.
De forma similar, para el rs383592, G/G fue el genotipo más prevalente, seguido de los genotipos G/A y A/A, estando este último ausente en los pacientes PXG. G/G fue el genotipo más común que mostró los niveles más altos de 8-OHdG en comparación con los grupos G/A, A/A o G/A + A/A. Los niveles no variaron significativamente entre los casos y los controles para los genotipos G/G (). Además, una comparación dentro del grupo en los controles tampoco mostró ningún efecto significativo del genotipo en la 8-OHdG para G/A (), A/A, () y G/A + A/A () en comparación con el genotipo G/G.
3.4. Niveles de 8-OHdG y otros factores de riesgo
Con el fin de examinar el efecto de la edad, el sexo, los polimorfismos de LOXL1 y los niveles de 8-OHdG en pacientes con PXG, se realizó un análisis de regresión logística binaria utilizando como variable dependiente (resultado) el estar enfermo/sin estarlo. El análisis mostró que tanto la 8-OHdG () como el rs3835942 () tienen un efecto estadísticamente significativo en el resultado de la enfermedad. Sin embargo, en un análisis combinado con la edad, el sexo, la 8-OHdG, el rs1048661 y el rs3835942, ninguno de estos factores de riesgo mostró un impacto significativo sobre la PXG (Tabla 4).
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Nota. aMujeres como referencia; b 8-OHdG, 8-hidroxi-deoxiguanosina; c genotipos G/G como referencia.
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3.5. Correlación entre la 8-OHdG y otros índices de glaucoma en pacientes con PXG
Se observó una correlación positiva significativa entre la 8-OHdG y la PIO (, ) y la relación copa/disco (, ), frente a ninguna con la edad (, ) y el número de medicación antiglaucomatosa (, ).
3.6. Curva ROC y 8-OHdG
El análisis de la curva ROC de los niveles de 8-OHdG en pacientes y controles de PXG reveló un AUC de 0,635 (IC del 95% = 0,518-0,751) que fue estadísticamente significativo (, ), indicando que los niveles plasmáticos de 8-OHdG podían discriminar satisfactoriamente entre pacientes y controles de PXG.
4. Discusión
El aumento de ROS, el daño oxidativo y el desequilibrio entre el estado prooxidante y el estado antioxidante son factores críticos que contribuyen significativamente a la neurodegeneración glaucomatosa . Este estudio informa de un aumento de los niveles de 8-OHdG sistémica, un marcador de daño del ADN inducido por el estrés oxidativo, en pacientes con PXG.
El daño del ADN puede ser infligido por agentes extrínsecos e intrínsecos como las radiaciones ionizantes, la luz ultravioleta, los productos químicos tóxicos / iones metálicos, y ROS generados como consecuencia del metabolismo celular normal de oxígeno . Los procesos endógenos que pueden contribuir a un daño continuo del ADN in vivo incluyen la metilación oxidativa, la depuración y la desaminación. Los daños inducidos por las ROS incluyen lesiones en las bases y los azúcares, enlaces cruzados de proteínas y ADN, y roturas de una o dos cadenas. Además, la base guanina es la más susceptible a las modificaciones oxidativas debido a su menor potencial redox . El subproducto más común que se forma debido a la modificación oxidativa de la guanina por el radical hidroxilo es la 8-hidroxiguanina (8-OH-Gua) y su equivalente 2′-desoxinucleósido, 8-OHdG, que se propone como un excelente marcador del daño oxidativo del ADN . Varios estudios han aportado pruebas sólidas de la asociación entre el aumento de los niveles de 8-OHdG y la neuropatía óptica glaucomatosa.
Los primeros estudios sobre muestras de TM humana obtenidas durante la cirugía de filtración han demostrado la presencia de niveles elevados de 8-OHdG en pacientes con glaucoma . En un estudio realizado por Sorkhabi et al. que incluyó a 15 pacientes con GPAA y 13 con PXG, tanto los niveles de 8-OHdG en el humor acuoso (AH) como en el suero eran elevados en los pacientes en comparación con los controles . Del mismo modo, se han notificado niveles elevados de 8-OHdG en suero en pacientes con glaucoma primario de ángulo cerrado en comparación con sujetos normales. Yuki y Tsubota informaron de que un mayor nivel de 8-OHdG/creatinina en orina se asociaba con la progresión del campo visual glaucomatoso en sujetos con glaucoma de tensión normal . Asimismo, en otro estudio reciente realizado por Mohanty et al., los niveles de 8-OHdG en plasma y en la orina eran significativamente mayores en los pacientes con GPAA en comparación con los controles de cataratas. Este efecto se atribuyó a una menor expresión de las enzimas de reparación del ADN de la vía de reparación de escisión de bases . Además, el estudio también informó de una fuerte correlación positiva entre los niveles sistémicos (plasma) de 8-OHdG y los niveles de AH 8-OHdG, lo que sugiere que los niveles sistémicos de 8-OHdG podrían ser predictivos de los niveles locales de 8-OHdG en el ojo.
El papel exacto de la 8-OHdG y/o el estrés oxidativo que conduce al desarrollo y la progresión de la neuropatía óptica glaucomatosa es todavía especulativo. El 8-OHdG se encuentra entre las lesiones oxidativas mejor caracterizadas, y puede dar lugar a mutaciones de transversión C : G a A : T . Algunas lesiones en el ADN están sujetas a la reparación celular mediante mecanismos de reparación del ADN in vivo que escinden el ADN dañado . Sin embargo, el fracaso en la reparación de estos daños puede tener graves implicaciones biológicas y puede conducir a la carcinogénesis o al desarrollo de trastornos neurodegenerativos . El 8-OHdG también puede inducir de forma significativa el acortamiento de los telómeros, lo que puede contribuir a las condiciones fisiológicas y patológicas in vivo. Además, se ha sugerido que la 8-OHdG puede tener un papel regulador de tipo epigenético en las células sometidas a estrés oxidativo en la regulación de la transcripción de genes . Además, los efectos anormales del estrés oxidativo y las ERO en la patogénesis del glaucoma a través del aumento de la PIO y/o la hipoxia, la degeneración de la TM, el daño de las células gliales, la autofagia, el daño del ADNmt, la activación del núcleo-kappa B, el estrés por peroxinitrito y la hemodinámica ocular que estimula la apoptosis y las vías inflamatorias para promover la muerte de las CGR y el daño del nervio óptico han sido bien documentados. El aumento de los niveles de 8-OHdG observado en nuestro estudio puede contribuir a la patogénesis de la PXG por mecanismos similares.
Una fuerte asociación de dos variantes de sentido erróneo, rs1048661 y rs3825942, en el gen LOXL1 con la PXG se ha replicado consistentemente en múltiples grupos étnicos, incluyendo los árabes saudíes . Todavía no se conoce una comprensión completa de esta asociación genética con la patología de la PXG; sin embargo, se han postulado varios mecanismos. Estos incluyen su efecto en la formación de elastina, la expresión alterada de LOXL1, el efecto de empalme, o la posibilidad de su asociación/vinculación con un alelo funcional actual no identificado . Se investigaron los efectos del genotipo de estas dos variantes comunes en la 8-OHdG y su efecto combinado en el riesgo de PXG. No se encontró que los genotipos influyeran en los niveles de 8-OHdG, aunque los niveles eran altos en las variantes de riesgo (G/G). Tanto la 8-OHdG como el rs3835942 resultaron ser factores de riesgo significativos para la PXG. Sin embargo, esta significación se perdió en un análisis combinado que también incluía la edad, el sexo y los genotipos del rs1048861. Una falta de números suficientes en cada grupo de genotipos podría ser una explicación probable a esta pérdida y ausencia de cualquier efecto significativo.
Un aumento de la PIO y el daño del campo visual se han correlacionado significativamente con la cantidad de daño oxidativo del ADN en las células TM . Del mismo modo, la PIO y la relación copa/disco también mostraron una correlación positiva significativa con los niveles de 8-OHdG en nuestro estudio, lo que sugiere su posible utilidad como marcador de la gravedad de la enfermedad. Además, varios informes han apoyado la existencia de una relación inversa entre los mecanismos de defensa antioxidante y el estrés oxidativo en la fisiopatología del glaucoma. Nuestro grupo también ha informado previamente de una reducción significativa del estado antioxidante total (TAS) en plasma en pacientes con PXG en comparación con los controles. Curiosamente, los niveles de TAS estaban disponibles para los pacientes de PXG (no para los controles; datos no mostrados) incluidos en este estudio que mostró una correlación negativa significativa entre 8-OHdG y TAS en los pacientes de PXG (, ), apoyando el papel plausible del aumento del estrés oxidativo y la disminución de los mecanismos de defensa antioxidante en PXG.
Los hallazgos de este estudio requieren una interpretación cautelosa debido a sus ciertas limitaciones. En primer lugar, tenemos que reconocer el hecho de que el aumento sistémico de 8-OHdG puede no reflejar exactamente la situación en la cámara anterior del ojo, donde las células/los tejidos están constantemente expuestos a una mayor cantidad de insultos de los radicales libres y, por lo tanto, están más directamente involucrados en el desarrollo y la progresión del glaucoma a través de los mecanismos de estrés oxidativo. Esto requeriría una validación adicional en muestras de AH. En segundo lugar, el estudio es de naturaleza puramente descriptiva y no aporta ninguna prueba temporal o mecanicista ni sugiere ninguna implicación causal de la elevación de la 8-OHdG en la PXG. Por último, en este estudio se ha examinado un número relativamente pequeño de muestras. Una réplica en una cohorte mucho mayor reforzaría sin duda las observaciones de este estudio. No obstante, considerando una diferencia media (tamaño del efecto) de 13 ng/mL en la concentración de 8-OHdG observada entre los casos de PXG y los controles, con una desviación estándar media de 20 y un error de tipo I de 0,05 (de dos caras), el estudio presenta una potencia de >80%.
5. Conclusión
Para concluir, el estudio demuestra un nivel aumentado de 8-OHdG sistémico en pacientes con PXG, apoyando una asociación de este marcador con la PXG, y el papel plausible del estrés oxidativo y el aumento del daño oxidativo del ADN en la etiología de la PXG.
Disponibilidad de datos
Los datos que apoyan las conclusiones de este artículo se presentan todos dentro del artículo.
Aprobación ética
El estudio se adhirió a los principios de la Declaración de Helsinki y recibió la aprobación de la Junta de Revisión Institucional y el Comité de Ética de la Investigación de la Facultad de Medicina, Universidad Rey Saud, Riad, Arabia Saudí.
Consentimiento
Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de su inclusión en este estudio.
Conflictos de intereses
Los autores no informan de ningún conflicto de intereses. El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, en la recogida, el análisis y la interpretación de los datos, ni en la redacción del manuscrito. Los autores son los únicos responsables del contenido y la redacción del artículo.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la Cátedra del Vicedecanato de Investigación Científica y a la Cátedra de Investigación del Gluacoma en Oftalmología de la Universidad Rey Saud a través de la cual se apoyó este trabajo.