Biosíntesis de trans-4-hidroxiprolina por cepas recombinantes de Corynebacterium glutamicum y Escherichia coli

Construcción de cepas recombinantes productoras de trans-Hyp

Hay varios genes que se especulan como gen putativo de L-prolina 4-hidroxilasa en la base de datos, incluyendo genes en Pseudomonas stutzeri , Janthinobacterium sp., Bordetella bronchiseptica RB50, Bradyrhizobium japonicum, Achromobacter xylosoxidans C54 y Dactylosporangium. sp. Mediante PCR, clonamos y obtuvimos los genes putativos de la P4H de P. stutzer y B. bronchiseptica RB50, denominados p4hP y p4hB. Se ligaron a los plásmidos correspondientes después de la digestión y se convirtieron en C. glutamicum y E. coli, respectivamente. La longitud de p4hP era de 918 pb, mientras que la de p4hB era de 924 pb. Estas secuencias eran 100% idénticas a los genes reportados en el NCBI. El gen de la trans-P4H de Dactylosporangium sp. (p4hD) se ha expresado con éxito en E. coli y puede transformar la L-prolina con buenas propiedades enzimáticas. La longitud de p4hD era de 816 bps y codificaba un polipéptido de 272 aminoácidos con un peso molecular de 29.715 daltons. En este estudio, el p4hD se aplicó con algunas modificaciones en las bases nucleares. Se analizó la secuencia original del gen p4hD (http://www.kazusa.or.jp/codon/) y los resultados mostraron que había algunos codones raros tanto para C. glutamicum como para E. coli. Se ha informado de que los codones raros están fuertemente asociados con un bajo nivel de expresión de la proteína. Se ha demostrado que la optimización de codones para la expresión de proteínas heterólogas aumenta drásticamente la expresión de proteínas. Así, se sustituyeron los codones raros del gen p4hD por los utilizados con alta frecuencia en C. glutamicum y se ajustó el contenido de GC del 73% al 61% mediante la conversión sinónima, que se aproximó al de C glutamicum. El gen modificado de p4hD se sintetizó de acuerdo con las modificaciones anteriores (archivo adicional 1).

La expresión de P4H es uno de los aspectos importantes en la construcción de la vía biosintética de la trans-Hyp. La figura 2 muestra el SDS-PAGE de las trans-P4Hs expresadas en C. glutamicum recombinante y en E. coli. Todas las trans-P4Hs recombinantes se expresaron como proteínas solubles sin cuerpos de inclusión. Es evidente que las trans-P4Hs recombinantes en E. coli se expresaron mucho más que las de C. glutamicum (Figura 2). Son muchos los factores que influyen en la expresión de proteínas extrañas, como los promotores, el sistema huésped-vector y las condiciones de cultivo, etc. Al ser la primera vez que se expresan trans-P4Hs en C. glutamicum, en nuestros futuros trabajos se considerarán estudios más exhaustivos como la selección de promotores y la optimización de las condiciones de cultivo.

Comparación de las actividades de la P4H

Las oxigenasas se aplican ampliamente en la industria ya que pueden catalizar la oxifuncionalización altamente específica de enlaces C-H no activados en condiciones suaves, especialmente transfiriendo oxígeno molecular a un sustrato . La P4H pertenece a una familia de dioxigenasas dependientes de 2-oxoácidos, que es una proteína monomérica y utiliza los sustratos monoméricos en lugar de los poliméricos . En este estudio se midieron las actividades de las trans-P4Hs utilizando células enteras recombinantes (Tabla 1). Nuestros datos indicaron que el nivel de proteína expresada y la actividad enzimática fueron mayores a 30°C. Los resultados también mostraron que los plásmidos eran muy estables, ya que las estabilidades de los plásmidos de las cepas recombinantes de E. coli y C. glutamicum eran todas superiores al 98% al final de la fermentación.

Las células recombinantes con expresión de diferentes genes mostraron diferentes niveles de actividades catalíticas hacia la L-prolina. La actividad de la trans-P4H expresada por E. coli BL21/ pET28a-p4hD fue la más alta entre todas las cepas recombinantes construidas. Los nuevos genes clonados y expresados de P. stutzeri y B. bronchiseptica también mostraron actividades interesadas. En cuanto a las diferentes cepas huésped, E. coli representó mejor que C. glutamicum, lo que puede estar relacionado con el rendimiento del plásmido correspondiente. Se utilizaron cuatro cepas productoras de L-prolina de C. glutamicum como cepas huésped de expresión y las cepas recombinantes resultantes mostraron diferentes actividades enzimáticas. La mayor actividad enzimática específica entre las cepas de C. glutamicum fue de 40,7 U/mg – célula húmeda por C. glutamicum ATCC13032/pEC-XK99E-p4hB. Sin embargo, la actividad enzimática específica de la E. coli recombinante/pET28a -p4hD fue de hasta 60,4 U/mg – célula húmeda. El crecimiento de las tres cepas recombinantes de E. coli fue similar. Pero hubo una diferencia significativa entre las cepas recombinantes de C. glutamicum. Las cepas recombinantes de C. glutamicum con mayores actividades enzimáticas específicas crecieron menos que las que tenían menores actividades enzimáticas específicas. Además, la actividad enzimática de E. coli BL21 /pET28a -p4hD era similar a la de E. coli W1485/pWFH1 y superior a la de E. coli BL21/pET24-p4h1 de . La p4hD de E. coli W1485/pWFH1 era la original de Dactylosporangium sp., mientras que la p4hD de E. coli BL21/pET24-p4h1 estaba modificada. Aunque la optimización del codón en este estudio se diseñó para C. glutamicum, los resultados indicaron que también tuvo éxito en E. coli.

Producción de trans-Hyp en matraces

La producción de trans-Hyp por diferentes cepas recombinantes de C. glutamicum y E. coli también se mostró en la Tabla 1. Los rendimientos de trans-Hyp por estas cepas recombinantes dependían tanto de la actividad enzimática de la P4H como del crecimiento celular. E. coli BL21/ pET28a-p4hD tuvo el mayor rendimiento, que coincidió con su actividad enzimática específica. Aunque las cepas recombinantes de E. coli crecieron de forma similar en el medio de producción, hubo una diferencia significativa en la producción de trans-Hyp que no mantuvo el mismo nivel con las actividades enzimáticas específicas. La producción de trans-Hyp por parte de las cepas recombinantes de C. glutamicum fue también mucho menor que la de E. coli BL21/pET28a-p4hD. Esto se debió tanto a la menor expresión de trans-P4H como al menor crecimiento celular de C. glutamicum. La producción de L-prolina de cuatro cepas de C. glutamicum también fue inferior a 1 g/L. Hubo poca diferencia de producción de trans-Hyp entre las cepas recombinantes de C. glutamicum con el mismo gen p4hD, a pesar de que algunas cepas tenían mejor rendimiento enzimático y producción de prolina.

El uso de las cepas recombinantes para sintetizar directamente trans-Hyp a partir de glucosa mediante fermentación se logró ya que tanto las enzimas como los precursores necesarios en el proceso estaban disponibles. Las trans-P4Hs extranjeras sobreexpresadas catalizaron la hidroxilación de la L-prolina en la posición trans-4, mientras que el 2- cetoglutarato fue suministrado por la glucosa a través del ciclo TCA y luego descarboxilado oxidativamente a succinato (Figura 1). Se informó de que la prolina era demandada en la producción de Hyp por E. coli recombinante sólo con el gen p4h. El carbono de la prolina añadida durante la fermentación sólo fluyó hacia los aminoácidos sintetizados a partir de los intermediarios del ciclo TCA y no hacia la gluconeogénesis . Sin embargo, el Hyp acumulado estaba en un nivel relativamente alto incluso sin la adición de prolina en este estudio. Se podría entender que Corynebacterium tenía la poderosa vía biosintética de la prolina . La vía biosintética de la prolina también se ha identificado en E. coli, lo que podría contribuir a la síntesis de trans-Hyp por parte de las cepas recombinantes de E. coli. La modificación de la vía de la prolina en E. coli mejoró el rendimiento de Hyp, mientras que la formación de Hyp también puede aliviar la inhibición por retroalimentación de la prolina . La cantidad de prolina (0-4 mM) promovió la producción de trans-Hyp. Sin embargo, la adición continua de L-prolina no mejoró significativamente el rendimiento de la producción (Tabla 2). En este estudio, el tiempo de cultivo fue significativamente menor que los reportados en las literaturas, lo que podría atribuirse a los diferentes medios utilizados y también indicó que había un gran potencial con la optimización. De hecho, se produjeron 2,28 g/L de trans-Hyp por E. coli recombinante sin añadir L-prolina en frascos con una pequeña modificación de los medios y se lograron 6,72 g/L suplementando sólo 4 mM de L-prolina.

Con el fin de aumentar aún más la biosíntesis de trans-Hyp por C. glutamicum recombinante y E. coli, se deben considerar también enfoques alternativos. En E. coli, debe superarse la degradación de la prolina. Aunque la producción de trans-Hyp por un mutante putA de E. coli no se mejoró más, el rendimiento basado en la prolina utilizada se incrementó en gran medida. Tanto en C. glutamicum como en E. coli, la expresión de la P4H recombinante como una de las oxigenasas está implicada en el metabolismo fisiológico de las células huésped, incluyendo el cofactor, el co-sustrato y el oxígeno. Además, sin una potente vía de síntesis de prolina en E. coli, la disponibilidad y el transporte de sustrato limitarán seriamente la transformación.