- Abstract
- 1. Introducción
- 2. Estudio de caso (descripción clínica)
- 3. Métodos
- 3.1. Modelado estructural
- 4. Resultados
- 4.1. Estudios de estructura-función
- 4.2. Efectos de la formación de dímeros
- 5. Discusión
- 6. Conclusión
- Abreviaturas
- Disponibilidad de los datos
- Consentimiento
- Conflictos de intereses
- Contribuciones de los autores
- Financiación
- Agradecimiento
Abstract
Antecedentes. La proteína de cassette de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1) es un semitransportador peroxisomal que permite la degradación de los ácidos grasos de cadena muy larga (VLCFA). Las variantes patogénicas de ABCD1 hacen que los AGCML se acumulen en diversos tejidos y fluidos corporales, lo que da lugar a un trastorno denominado adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X (ALD). Este trastorno suele caracterizarse por una insuficiencia corticosuprarrenal y una elevada concentración de AGVC, y presenta distintos niveles de afectación neurológica en función del fenotipo. Por ejemplo, la forma de X-ALD que se limita a Addison no tiene impacto neurológico, mientras que la forma cerebral de X-ALD suele causar una pérdida sensorial grave, deterioro de la función motora, deterioro cognitivo y muerte. Métodos. Se analizó una variante patogénica recientemente caracterizada y sospechosa en ABCD1 utilizando nuestra plataforma informática de proteínas (PIP). Se completaron estudios moleculares personalizados a nivel de proteínas sobre los datos de las pruebas genéticas, complementando el análisis y el estudio clínico. Resultados. Se presenta un caso de adrenomieloneuropatía de inicio en la edad adulta (AMN) y una nueva variante en ABCD1. Se discute la singularidad de la proteína ABCD1 y se compara el caso del probando con los informes existentes de AMN. Conclusiones. La fusión de datos de múltiples fuentes se combinó en un enfoque integral que produjo una evaluación enriquecida de la enfermedad y el pronóstico del paciente. Se realizó una modelización molecular de la variante para caracterizar mejor su importancia clínica y confirmar su patogenicidad.
1. Introducción
La proteína cassette de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1) forma parte de la superfamilia de transportadores de cassette de unión a ATP, que consiste en proteínas transmembrana responsables de pasar lípidos, metabolitos y otras moléculas entre células o estructuras intracelulares. Está codificado por ABCD1, un gen localizado en Xq28. ABCD1 es un semitransportador peroxisomal que importa ácidos grasos de cadena muy larga (VLCFA) al peroxisoma mediante la unión de ATP. El ABCD1 disfuncional es incapaz de trasladar los AGCML al peroxisoma para su degradación, lo que da lugar a la acumulación de AGCML en los fluidos y tejidos corporales. Este nivel anormal de AGCML sirve como biomarcador característico de la adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X (ALD), el trastorno peroxisomal más común. La ALD-X es una enfermedad genética asociada principalmente a la desmielinización, la neurodegeneración y la insuficiencia adrenocortical. Se han descrito más de 800 variantes en el gen ABCD1. A pesar de ello, no se han observado correlaciones claras entre el genotipo y el fenotipo.
Los varones hemicigotos suelen presentar los síntomas más significativos, mientras que las mujeres heterocigotas suelen desarrollar un grado menor de discapacidad más adelante. Los tres fenotipos clásicos son la enfermedad de Addison únicamente, la adrenomieloneuropatía (AMN) y la ALD cerebral. Los individuos con la forma de la enfermedad de Addison únicamente suelen presentar insuficiencia corticosuprarrenal entre los 2 y los 7 años de edad. La degeneración neurológica no está presente inicialmente, pero suele desarrollarse a medida que el individuo envejece. La AMN suele aparecer en la tercera o cuarta década de la vida y afecta principalmente a la médula espinal. La característica clínica de presentación suele ser la rigidez y la debilidad progresivas de las piernas. La insuficiencia suprarrenal se encuentra en aproximadamente 2/3 de los pacientes con AMN, y los cambios cerebrales afectan a la mitad de ellos. La ALD cerebral es el fenotipo más grave, en el que la desmielinización cerebral provoca un rápido deterioro de la audición, la vista, la función motora y la cognición. Esta variante de la ALD X, que se da con mayor frecuencia en niños o adolescentes, suele provocar la muerte en los 2-4 años siguientes a la presentación de los síntomas.
Este informe detalla la historia de un probando diagnosticado en la treintena con ALD. El análisis molecular del gen ABCD1 identificó una variante de significado incierto en este individuo. Curiosamente, esta variante ha sido reportada como patogénica en la base de datos de mutaciones de ALD, pero la información relativa al caso clínico no fue publicada. El caso clínico de nuestro probando se incluye para apoyar mejor la patogenicidad de esta variante ABCD1. Se utilizó la plataforma informática de proteínas (PIP) para el modelado molecular exhaustivo con el fin de caracterizar aún más la importancia de esta variante y aclarar el diagnóstico del probando.
2. Estudio de caso (descripción clínica)
El probando era un varón de 31 años que se presentó para la evaluación de una condición neurológica progresiva. Los síntomas de esta afección aparecieron por primera vez hace 2 años, cuando el probando empezó a tropezar cada vez con más frecuencia. Posteriormente, experimentó debilidad y rigidez muscular generalizada, junto con una mayor disfunción de la marcha. Para combatir esto, el probando había utilizado un andador para ayudar a la deambulación durante los últimos 7 meses. También había desarrollado incontinencia urinaria. Además, informó de niebla cerebral, pérdida de memoria, déficit de atención, ansiedad y fatiga. Como resultado, las tareas mentales básicas tardaban más en completarse. Según el probando, el consumo de alcohol exacerbaba estos déficits. Por último, el probando perdió 9 kilos desde el inicio de su enfermedad y no pudo recuperar el peso a pesar de los esfuerzos realizados para hacerlo. Esta pérdida de peso se debía en parte a los síntomas de náuseas y vómitos, que eran más frecuentes por la mañana.
Durante la exploración física, el probando era incapaz de levantarse de una posición sentada sin usar las manos. Se identificó una disartria atáxica leve. Las pruebas de fijación visual revelaron sacudidas de onda cuadrada poco frecuentes. Las persecuciones suaves eran sacádicas, y demostró sacadas lentas y completas tanto vertical como horizontalmente. Los reflejos de estiramiento eran patológicamente rápidos en las extremidades superiores. El probando también tenía reflejos de estiramiento mitóticos patológicamente rápidos en las extremidades inferiores, incluyendo clonus sostenido en los tobillos. La propiocepción de los dedos gordos de los pies estaba moderadamente deteriorada. Se observó una leve debilidad en la distribución de las neuronas motoras superiores en las extremidades inferiores, que no afectaba al iliopsoas. La prueba del talón a la espinilla reveló disinergia. Durante la deambulación, el paciente miraba sus pies y se movía con una zancada reducida. Sus rodillas se hiperextendían, tendía a caminar de puntillas, y ocasionalmente deslizaba sus pies. El signo de Romberg estaba presente. Mientras estaba de pie, había movimientos temblorosos en las piernas, predominantemente en los cuádriceps. El paciente giraba 360 grados en 3 pruebas, lo que requería de 9 a 15 pasos por vuelta. Sus reflejos posturales eran anormales, y la prueba del «tirón» era de -3.
La resonancia magnética del cerebro era normal, y la resonancia magnética de la columna cervical reveló hallazgos sugestivos de atrofia leve y difusa de la médula espinal. No había evidencia de degeneración combinada subaguda u otra enfermedad medular adquirida (Figura 1). Había recibido tratamiento para la enfermedad de Lyme, ya que sus títulos de IgM de Lyme eran positivos, pero no se había registrado ninguna mejora significativa. Su líquido cefalorraquídeo se describía como acelular. La evaluación del VIH, HTLV1, hepatitis C, hepatitis B y citomegalovirus resultó negativa. No pudieron establecerse antecedentes familiares de síntomas similares, ya que el conocimiento de los antecedentes médicos del probando era limitado (Figura 2).
El perfil de ácidos grasos peroxisomales del probando se obtuvo después de las pruebas e imágenes anteriores. Había concentraciones anormales de C26 : 0, C24/C22 y C26/C22, lo que sugería una hemizigosidad para la adrenomieloneuropatía ligada al cromosoma X. La hormona adrenocorticotrópica midió 528 pg/mL (RR: 7,2-63). Se completó la secuenciación y el análisis de deleción/duplicación del gen ABCD1. El probando era hemizigoto para una variante de significado incierto en ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Esta variante no estaba presente en la base de datos online de ExAC, aunque aparecía como patógena en la base de datos de mutaciones de ALD. Dos variantes similares, c.1596A>G (p.Lys533Glu) y c.1598A>G (p.Lys533Arg), también se han notificado previamente como clínicamente significativas.
3. Métodos
3.1. Modelado estructural
La secuencia del miembro 1 de la subfamilia D del casete de unión a ATP humano (conocido como ABCD1) es probablemente una proteína transportadora, que tiene una región de unión a nucleótidos con un pliegue que puede actuar como una subunidad de unión a ATP con actividad ATPasa. Se sabe que se requiere una dimerización correcta para formar un transportador activo. ABCD1 es un miembro de la subfamilia ALD que participa en la importación de ácidos grasos peroxisomales a los orgánulos. Estos transportadores ABC peroxisomales son «medio transportadores», lo que significa que requieren una media molécula transportadora asociada: la forma funcional es siempre homodimérica o heterodimérica. Se supone que ABCD1 es la clave para el transporte peroxisomal o el catabolismo de los ácidos grasos de cadena muy larga. Se sabe que ABCD1 interactúa con PEX19, y está codificado por el gen ABCD1, que fue tomado de la Secuencia de Acceso de Referencia del NCBI: NP_000024: versión NP_000024.2, que está codificado para la secuencia de aminoácidos; y se utilizó para el modelado asistido por ordenador. Se realizaron simulaciones de Monte Carlo en el mutante para permitir cambios regionales locales para los 745 aminoácidos de longitud completa.
El refinamiento de rayos X para Monte Carlo se construyó utilizando el método YASARA SSP/PSSM . La estructura se relajó en el campo de fuerza YASARA/Amber utilizando potenciales basados en el conocimiento dentro de YASARA. Las cadenas laterales y los rotámeros se ajustaron con potenciales basados en el conocimiento, recocido simulado con disolvente explícito y pequeñas simulaciones de equilibrio utilizando el protocolo de refinamiento de YASARA. Se modeló toda la estructura de longitud completa, rellenando cualquier hueco o porción no resuelta de los rayos X.
El refinamiento de los modelos finalizados se completó utilizando el módulo de Schrodinger basado en LC-MOD Monte Carlo o los protocolos NAMD2. Estos refinamientos comenzaron con el refinamiento inicial generado por YASARA y la variante . La superposición y posterior refinamiento de las regiones superpuestas da lugar a un modelo completo para el ABCD1. Las estructuras finales se sometieron a una optimización energética con gradiente conjugado PR con un dieléctrico dependiente de R.
Se comprobó la consistencia de los átomos para todos los 745 aminoácidos (12.201 átomos) del modelo de longitud completa de tipo salvaje (WT) y 745 aminoácidos (12.221 átomos) para la variante, verificando la corrección del nombre de la cadena, los diedros, los ángulos, las torsiones, los no enlaces, la electrostática, la tipificación de los átomos y los parámetros. Se predice un modelo de dímero, que consta de 24.402 átomos, incluyendo cofactores e iones. Cada modelo se exportó a los siguientes formatos: Maestro (MAE), y YASARA (PDB). La manipulación del modelo se realizó con Maestro (Macromodel, versión 9.8, Schrodinger, LLC, Nueva York, NY, 2010), o Visual Molecular Dynamics (VMD) . Los análisis se enfatizaron en la región N-terminal que contiene los primeros 350 aminoácidos dada la longitud y la distancia C-terminal desde el sitio de la mutación.
La búsqueda de la dinámica de Monte Carlo (MC híbrida o a través de mejorar el muestreo MDS) se completó en cada modelo para el muestreo conformacional, utilizando métodos previamente descritos en la literatura . Brevemente, cada sistema de variante ABCD1 se minimizó con restricciones relajadas utilizando Steepest Descent o Conjugate Gradient PR, y luego se permitió someterse a los criterios de búsqueda MC, como se muestra en la literatura . El propósito principal de MC, en este escenario, es examinar cualquier variabilidad conformacional que pueda ocurrir con diferentes mutaciones en la región cercana a la mutación y el posible efecto sobre la unión del ADN o el procesamiento con el ABCD1.
4. Resultados
4.1. Estudios de estructura-función
Para el WT frente a la variante p.K533E, encontramos que la estabilidad del objeto a partir de cálculos energéticos para ΔG por aminoácido se mantiene relativamente igual, de forma que el WT tiene una estabilidad del objeto de 114,67 kcal/mol∗Å2. La variante p.K533E provoca un aumento neto de la energía libre de 2,321 kcal/aa∗mol∗Å2, que podría ser desestabilizador para la región local . Esta estabilidad del objeto fue positiva indicando que algunos cambios dinámicos son probables con una simulación molecular para el muestreo conformacional. Así, examinamos los residuos locales y determinamos que un cálculo electrostático puede ser útil para explicar el cambio de función. El modelo molecular para la estructura completa y su forma variante se da (Figura 3(a)) utilizando nuestros métodos de vanguardia, que han sido establecidos . El modelo dimérico es crítico para la función y muestra importantes interacciones en el lugar de la mutación que se ven interrumpidas por la mutación variante.
Los residuos locales dentro del corte de 12 Å cerca del sitio de la variante (p.K533E) incluyen residuos de ambos monómeros. El monómero que contiene la variante (monómero 1, carbones grises) tiene los siguientes residuos cercanos con la posición 533-interacciones: E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 y K624 (Figura 3(b)). Se analizó la estructura de esta variante (p.Lys533Glu) y se observó una alteración más directa del entorno local a partir de la carga positiva de la lisina (+), que pasó a ser un ácido glutámico negativo (-) que alteró bastante los residuos cargados adyacentes (arriba). En particular, los residuos K624, E499 e Y532 se colocan en diferentes interacciones (Figura 3(b)). El ΔG local por aminoácido aumenta un valor neto positivo que corresponde a una estabilidad desfavorable en el bolsillo y se necesitaría una dinámica más larga para determinar el efecto global, pero se puede esperar que sea desestabilizador. El residuo K533E tiene interesantes interacciones con Q472, I474, I475 y E499. K533E se encuentra en una región de hélice-hélice en la que su cadena lateral cargada se posiciona hacia el exterior de las especies con carga opuesta; también hay cierta interacción hélice-hélice con las hélices adyacentes (Figuras 3(b) y 3(c)). Los mismos residuos están implicados en la variante, pero la posición está cambiada para varios de los residuos, incluyendo P534, P535 y K624 (Figura 3(c)). Esta interacción podría explicar la alteración de la función debido al cambio en el comportamiento dinámico para la estabilidad estructural local (Figura 3(c)). Se completaron los cálculos electrostáticos para un análisis más profundo (Figura 4). En particular, los residuos K624, E499, y Y532 se colocan en diferentes interacciones (Figura 3(b)). El ΔG local por aminoácido aumenta un valor neto positivo que corresponde a una estabilidad desfavorable en el bolsillo y se necesitaría una dinámica más larga para determinar el efecto global, pero se puede esperar que sea desestabilizador.
4.2. Efectos de la formación de dímeros
El mapeo de la electrostática se realizó utilizando el cálculo de Poisson-Boltzmann para la solvatación en toda la estructura de 745 aminoácidos. Los efectos de los cambios fueron muy pronunciados en la distribución electrostática con un corte de +3 KT/E para ambos. La partícula WT (todos los 745 aa) muestra una distribución de carga distinta alrededor de K533, que muestra pocas regiones cargadas negativamente y grandes bolsas neutras debido a los ricos residuos hidrofóbicos que se encuentran en las hélices mencionadas anteriormente. La mutación de la treonina parece cambiar la distribución de las cargas y aleja la posición de las cargas negativas, al tiempo que aumenta el tamaño de las regiones con carga neutra (Figuras 4(a) y 4(b)). La región local p.K533E está cargada para que el residuo de lisina positivo coincida con los residuos de ácido glutámico adyacentes (en un radio de 6 Å) (Figura 4(b)). Por el contrario, el residuo K533 tiene cargas positivas que son impactadas por los residuos dentro de 6 Å, a saber, E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535, y K624 (Figura 4(a)) . La variante p.K533E no parece tener ningún efecto sobre el propio dímero (Figuras 3 y 4), ya que la variante se encuentra distal a la interfaz entre los monómeros. Sin embargo, hay una alteración significativa en la vecindad local donde la lisina está insertada de forma nativa en un bolsillo con sus residuos cercanos que están cargados de forma opuesta y participan en enlaces H e interacciones de puente salino, que se pierde con la carga negativa de la sustitución del ácido glutámico (Figura 3).
5. Discusión
Para los pacientes con AMN, las opciones de tratamiento son actualmente limitadas. Sin embargo, recientes investigaciones con modelos de ratón plantean una posible solución. En los pacientes con ALD-X, la acumulación de AGCV va acompañada de un aumento de los niveles de especies radicales de oxígeno. Estos radicales impulsan la progresión de la enfermedad, dañando los tejidos y provocando, en última instancia, la aparición de síntomas neurológicos. Los ratones con análogos de X-ALD han sido tratados con éxito con una mezcla de antioxidantes, lo que ha permitido controlar los niveles de radicales y detener este proceso patógeno. Si los ensayos posteriores siguen siendo prometedores, es posible que nuestro probando y otros pacientes con AMN puedan ser tratados algún día de forma similar.
Aunque nuestro probando presentaba una variante poco conocida en ABCD1, su caso no difería significativamente del fenotipo típico de AMN. Los síntomas comenzaron a finales de los veinte años, lo que encaja perfectamente en el rango de edad esperado de 20 a 40 años. La AMN suele tener una afectación de la médula espinal, algo que fue confirmado por las resonancias magnéticas del probando. La debilidad en las piernas y las anomalías en la marcha son características de la enfermedad, al igual que la incontinencia urinaria. Los vómitos y las náuseas se asocian a la insuficiencia suprarrenal, mientras que las anomalías mentales y del habla del probando podrían asociarse a cambios cerebrales. A pesar de ello, hay que decir que un paciente con la misma variante ABCD1 expresada por nuestro probando podría presentar síntomas diferentes. Las variantes patogénicas en ABCD1 rara vez dan lugar a fenotipos predecibles, incluso cuando los miembros de la familia poseen una versión idéntica.
La informática proteica derivada de los cálculos de mecánica estadística aplicada al modelado molecular para las variantes frente al tipo salvaje nos da una clara indicación de la disfunción del comportamiento normal de la proteína a nivel molecular que impactaría en la función. Por ejemplo, encontramos que la variante p.K533E provoca un aumento neto de la energía libre de 2,321 kcal/aamolÅ2, que desestabiliza la región local dentro de los 12 Å del residuo K533. Debido al cambio estructural local mitigado a través de los residuos de la columna vertebral y los cambios de interacción de la estructura secundaria (red de enlaces H no mostrada) permiten que el movimiento correlacionado se propague a través de la estructura frustrando aún más la formación adecuada del dímero.
Debido a la rareza de la variante ABCD1 de nuestro probando, el laboratorio comercial no fue capaz de nombrar con confianza la variante patógena. Además, los problemas logísticos y el pequeño tamaño de la familia del probando hicieron que el análisis de segregación familiar fuera poco práctico. Como resultado, este proceso no pudo completarse para ayudarnos a comprender mejor la importancia de su variante. Afortunadamente, la modelización molecular nos brindó otra oportunidad. El modelado molecular de proteínas apoyó las sospechas de que esta variante afectaría a la función de la proteína de una manera clínicamente significativa. No había ninguna sospecha de que esta variante no hubiera sido clasificada como patogénica dada la gran alteración de la estructura, que estaba fuertemente apoyada por el análisis PIP.
6. Conclusión
En conclusión, informamos de un probando con una variante rara en ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). La falta de información sobre esta variante impidió que la empresa de pruebas genéticas clasificara su variante como patógena, pero las cargas moleculares parecen indicar que esta región de la proteína está significativamente perturbada del equilibrio (Figura 3(b)). La utilización de la modelización de la proteína también proporcionó información para incorporar al cuadro clínico más amplio del probando. Además, un caso de patogenicidad de esta variante aparece en la base de datos de mutaciones de ALD. La combinación de estas pruebas permitió un diagnóstico seguro de AMN. Nuestro probando tenía síntomas típicos de AMN, pero la variabilidad fenotípica inherente a ABCD1 podría dar lugar a una presentación diferente de X-ALD para otros individuos que poseen esta variante.
Abreviaturas
| ABCD1: | Casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (gen) |
| VLCFA: | Ácidos grasos de cadena muy larga |
| ALD-X: | Adrenoleucodistrofia ligada a X |
| AMN: | Adrenomieloneuropatía. |
Disponibilidad de los datos
Los conjuntos de datos y los materiales se detallan en el manuscrito.
Consentimiento
Todos los procedimientos seguidos se ajustaron a las normas éticas del comité responsable de la experimentación humana (institucional y nacional) y a la Declaración de Helsinki de 1975, revisada en 2000 (5). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes para ser incluidos en el estudio.
Conflictos de intereses
Todos los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Contribuciones de los autores
Todos los autores arriba mencionados hicieron contribuciones sustanciales a la concepción o diseño del trabajo; o a la adquisición, análisis o interpretación de los datos para el trabajo Y a la redacción del trabajo o a la revisión crítica del mismo por consentimiento intelectual importante Y dieron la aprobación final de la versión que se publicará Y aceptaron ser responsables de todos los aspectos del trabajo para asegurar que las cuestiones relacionadas con la exactitud o integridad de cualquier parte del trabajo se investiguen y resuelvan adecuadamente.
Financiación
La financiación fue proporcionada por el Centro de Medicina Individualizada de la Clínica Mayo, que proporcionó fondos para completar este estudio.
Agradecimiento
TC agradece al Centro de Medicina Individualizada de la Clínica Mayo de Jacksonville el apoyo a la investigación.