Aunque los ensayos proteicos tienen una variedad de usos en la investigación de las ciencias de la vida, no existe un método de ensayo único que sea adecuado para todas las aplicaciones. A pesar de todos los avances de la ciencia moderna, no existe un método de ensayo de proteínas que no se vea afectado por ningún componente no proteico o por las diferencias en la composición de las proteínas. Por esta razón, los laboratorios de proteínas consideran necesario tener más de un tipo de ensayo de proteínas para las aplicaciones de investigación.
Cada ensayo tiene sus propias ventajas y limitaciones. Por lo tanto, si desea obtener resultados precisos de su experimento, debe ser capaz de seleccionar el ensayo más adecuado para su aplicación.
Tipos de ensayos colorimétricos de proteínas
En función de la química implicada, los dos métodos más comunes para la detección y cuantificación colorimétrica de la proteína total son el ensayo de unión a colorantes de proteínas y/o el ensayo de quelación basado en iones de cobre.
Ensayos de unión a colorantes
Los ensayos de unión a colorantes, como los ensayos de proteínas de Bradford (Coomassie) y 660nm, se basan en la unión de las moléculas de proteínas al colorante Coomassie en condiciones ácidas. Una vez que las moléculas de proteína se unen al colorante, el color cambia de marrón (Amax= 465nm) a azul (Amax= 610nm). El cambio en la densidad del color (que se lee a 595 nm) es proporcional a la concentración de la proteína.
Los aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) desempeñan un papel vital en la formación de los complejos tinte-proteína y el cambio espectral resultante, mientras que las proteínas más pequeñas (menos de 3kDa) y los aminoácidos no producen cambios de color.
Ensayos basados en iones de cobre
En los ensayos de proteínas basados en iones de cobre, la solución de proteínas se mezcla con una solución alcalina de sal de cobre para facilitar la quelación de los iones cúpricos (Cu2+) con los enlaces peptídicos, y la posterior reducción de los iones cúpricos (Cu2+) a iones cuprosos (Cu+). Cualquier exceso de iones cúpricos permanecerá sin unirse a los enlaces peptídicos y estará disponible para su detección.
Los ensayos de proteínas basados en iones cúpricos pueden dividirse en dos grupos – (1) ensayos que detectan iones cúpricos reducidos (Cu+) y (2) ensayos que detectan iones cúpricos no unidos (Cu2+). Para detectar los iones cúpricos se puede utilizar el ácido bicinchonínico (BCA) o el reactivo de Folin (ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico). Tras la reducción del reactivo utilizado, se produce un color azul. La cantidad de color producida puede leerse entre 650 nm y 750 nm y es proporcional a la cantidad de enlaces peptídicos.
Nota: La presencia de tirosina, triptófano, cisteína, histidina y asparginina en la proteína aumenta la densidad de color resultante.
En los ensayos basados en la detección de iones cúpricos no unidos, el cobre alcalino se mezcla con la solución de proteína y los iones cúpricos no unidos se detectan con un reactivo que produce color y reacciona con los iones cúpricos. La cantidad de color producida es inversamente proporcional a la cantidad de enlace peptídico en la muestra.
Selección de ensayos de proteínas: Algunos factores a tener en cuenta
Hay una serie de factores que debe tener en cuenta a la hora de elegir un ensayo. Estos son algunos de ellos.
- Compatibilidad con el tipo de muestra y los componentes. La naturaleza de la muestra de proteínas y la presencia de agentes no proteicos en las soluciones de proteínas pueden afectar significativamente a los resultados de su experimento. Tenga en cuenta que la presencia de agentes reductores, agentes quelantes de metales, colorantes, aminas y azúcares interfieren con los ensayos de proteínas basados en cobre, mientras que las soluciones de proteínas que contienen detergentes interfieren con los ensayos de proteínas basados en colorantes.
- Rango de ensayo y volumen de muestra requerido. La mayoría de los ensayos colorimétricos requieren al menos 0,5µg de proteínas para una estimación fiable. Por lo tanto, para las muestras difíciles de obtener, deben considerarse los métodos que requieren la menor cantidad de muestra para una estimación fiable.
- Uniformidad entre proteínas. Los ensayos de proteínas basados en colorantes y los que implican la reducción de iones cuprosos a iones cúpricos tienen una variación significativa de proteína a proteína.
- Consideraciones de tiempo. La complejidad de la muestra y el método de ensayo elegido dictan la cantidad de tiempo que se necesita para realizar el ensayo de proteínas. Las muestras de proteínas que contienen agentes de interferencia y los ensayos que utilizan gráficos o curvas estándar consumirán más tiempo.
- Requisitos de instrumentación. La disponibilidad del espectrofotómetro o lector de placas necesario para medir el color producido (absorbancia) por el ensayo también puede afectar a su elección.
