Estructura de la α-glucosidasa lisosomal humana-una guía para el tratamiento de la enfermedad de Pompe

Resumen estructural

La AGA se sintetiza como una glicoproteína de 110 kDa, que se dirige al lisosoma a través del receptor de manosa-6-fosfato y se somete en el compartimento endosomal/lisosomal tardío a una serie de eventos proteolíticos y de procesamiento de N-glicanos para producir una forma activa madura compuesta por cuatro péptidos estrechamente asociados19,20. Dado que la cristalización de la forma comercial precursora de Myozyme® de rhGAA (Q57-C952) no permitió obtener cristales que se difractaran más allá de ~7 Å y que los predictores de desorden de la proteína21 indicaban la presencia de regiones peptídicas desordenadas, realizamos una proteólisis in situ con α-quimotripsina para eliminar los supuestos bucles superficiales flexibles que dificultaban la formación de contactos cristalinos productivos. El tratamiento proteolítico produjo un polipéptido de ~5 kDa de menor masa que el precursor del rhGAA (Fig. 2a), que cristalizó fácilmente. Esto nos permitió recoger los datos de difracción que se extienden hasta 1,9 Å y resolver la estructura del rhGAA por sustitución molecular (Tabla 1). La forma digerida proteolíticamente tenía una actividad comparable a la del precursor (2,34 ± 0,06 y 2,26 ± 0,16 U mg-1 para las formas precursora y madura, respectivamente), lo que indica que el tratamiento con α-quimotripsina no alteró la funcionalidad del rhGAA.

La estructura cristalina del rhGAA corresponde a la forma madura del GAA placentario humano y del rhGAA20 (Fig. 2b), lo que sugiere que el tratamiento con α-quimotripsina permitió la eliminación de las regiones frágiles para la proteasa (Q57-T80, G116-M122, R199-A204 y A782-R794) de forma comparable a la maduración proteolítica que se produce in vivo. La arquitectura general de la rhGAA es similar a la de los homólogos humanos de la familia de las glucósido hidrolasas GH311, las enzimas de borde de cepillo intestinal maltasa-glucoamila (MGAM)22,23 y sucresa-isomaltasa (SI)24 (Fig. 2c y Fig. 1 suplementaria). A un dominio trefoil Tipo-P N-terminal le sigue un dominio β-hoja, el barril catalítico (β/α)8 que lleva dos inserciones tras las hebras β3 (inserción I) y β4 (inserción II), y dominios β-hoja proximales y distales en el C-terminal. La forma precursora de rhGAA contiene ~14 kDa de carbohidrato y se han predicho y caracterizado siete sitios de glicosilación20. Observamos estructuras de glicanos de varias longitudes para cinco de ellos en la estructura cristalina, especialmente en N140, N233, N390, N470 y N652 (Fig. 2c y Fig. 2 suplementaria). Detectamos una densidad electrónica diferencial residual en N882, insuficiente para modelar una estructura de glicano, y no observamos una densidad electrónica diferencial cerca de N925.

Sitio activo y unión a inhibidores

El estrecho bolsillo de unión a sustrato de rhGAA está localizado cerca de los extremos C-terminales de las hebras β del dominio catalítico (β/α)8 y conformado por un bucle del dominio de hoja β N-terminal y ambos insertos I y II (Fig. 2c). Las enzimas de la familia GH31 realizan la catálisis a través de un mecanismo clásico de reacción de doble desplazamiento de Koshland con retención de la configuración anomérica del carbono en el producto. A partir de la caracterización temprana del sitio catalítico de GAA25 y por homología con los miembros disecados mecánicamente de la familia GH3126,27, el nucleófilo catalítico y el ácido/base pueden asignarse a D518 y D616, respectivamente. Para conocer la interacción del rhGAA con la documentada chaperona farmacológica 1-deoxinojirimicina16,28 y su derivado N-hidroxietil-deoxinojirimicina29 (DNJ y NHE-DNJ, respectivamente), empapamos cristales de rhGAA con estos inhibidores de iminosugar dirigidos al sitio activo y obtuvimos para ambos complejos datos de difracción que se extienden hasta una resolución de 2,0 Å (Tabla 1). DNJ se une en una conformación 4C1 en el subsitio de unión al sustrato -130 y se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno a las cadenas laterales de D404, D518, R600, D616 y H674. Otras interacciones estabilizadoras las proporcionan los contactos hidrofóbicos con W376, I441, W516, M519, W613 y F649 (Fig. 3a, b). Aparte de una inclinación de 20° en la cadena lateral de W376, no se producen cambios conformacionales importantes tras la unión de DNJ en el sitio activo de rhGAA. Este no es el caso de la unión de NHE-DNJ, que adopta la misma postura que DNJ, pero donde el sustituto hidroxietil induce cambios conformacionales sustanciales en las cadenas laterales de M519 y W481 (Fig. 3c, d). En esta conformación inducida por el ligando, el residuo W481 de rhGAA, situado en la punta del inserto I, establece una interacción estabilizadora con el sustituyente hidroxietil de NHE-DNJ. Pueden observarse cambios conformacionales similares tras la unión de NHE-DNJ a la subunidad N-terminal de MGAM (NtMGAM)31 (Fig. Suplementaria 3a).

Reconocimiento de sustrato y especificidad

Para recoger una percepción del reconocimiento de sustrato por parte de la rhGAA, adquirimos los datos de difracción que se extienden a una resolución de 2,45 Å para un cristal de rhGAA empapado con acarbosa, un análogo de sustrato α-1,4-tetrasacárido no clavable (Tabla 1). En este complejo, el anillo de valienamina alojado en el subsitio -1 adopta una conformación de media silla 2H3, pero a pesar de esta diferencia conformacional con respecto al DNJ unido en la conformación de media silla 4C1, el patrón de enlace de hidrógeno en el subsitio -1 es esencialmente idéntico para los dos compuestos (Fig. 3e, f y Fig. 3b suplementaria). El nitrógeno «interglicosídico» no hidrolizable ocupa el centro catalítico y está unido por hidrógeno al ácido/base catalítico D616. La fracción 6-deoxiglucosil del subsitio + 1 establece a través de sus grupos 2 y 3-hidroxilo enlaces de hidrógeno con el conservado R600 y con D282 que se origina en un bucle del dominio β-hoja N-terminal. Aunque no se conservan en la secuencia, los residuos de este bucle interactúan invariablemente con los ligandos de carbohidratos en todas las estructuras cristalinas disponibles de los miembros de la familia GH31. La unidad de maltosa de la acarbosa en los subsitios + 2 y + 3 no realiza ninguna interacción directa con el rhGAA y está más bien estabilizada por interacciones de empaquetamiento de la red cristalina y por un contacto mediado por agua con la cadena lateral de W618, situada en el borde del bolsillo de unión al sustrato. Esta escasez de interacciones sugiere que el rhGAA posee sólo dos sitios productivos de unión a sustrato, los subsitios -1 y + 1, pero curiosamente, la fracción de maltosa de la acarbosa unida al rhGAA adopta la misma postura general que cuando está unida al NtMGAM22, lo que sugiere un papel funcional también para los subsitios + 2 y + 3 en el rhGAA (Fig. Suplementaria. 3c).

El glucógeno es un polímero de gran tamaño formado por cadenas lineales de residuos de glucosa ligados a α-1,4 que llevan ramas ligadas a α-1,6. En el citosol la partícula de almacenamiento de energía se degrada por la acción concomitante de la glucógeno fosforilasa y de una enzima desramificadora. En el lisosoma, no hay ninguna enzima desramificadora y el GAA debe asegurar la hidrólisis de los enlaces α-1,4- y α-1,6-glicosídicos. Sin embargo, la rhGAA muestra una clara preferencia por el primer enlace, ya que la constante de especificidad sobre la maltosa es 32 veces mayor en comparación con la constante de especificidad sobre la isomaltosa (Tabla Suplementaria 2). Para descubrir la base estructural de la doble especificidad de sustrato, intentamos empapar los cristales de rhGAA con el tetrasacárido no hidrolizable glucopiranosil-α-(1,6)-tiomaltotriosa. Sin embargo, este enfoque fracasó, muy probablemente debido a que los contactos de los cristales impiden la acomodación del tetrasacárido, que en virtud del enlace α-1,6 es ligeramente más largo que la acarbosa. Se ha observado que este último apenas encaja en la hendidura de unión al sustrato y se acerca a una molécula relacionada con la simetría (Fig. 3e). Derivamos un disacárido ligado a α-1,6 dentro del sitio activo de rhGAA mediante una superposición estructural de rhGAA con el dominio catalítico (β/α)8 de Blautia obeum GAA en complejo con isomaltosa32 (rmsd de 1,50 Å para 318 posiciones Cα alineadas). El modelo revela que no se produce ningún impedimento estérico por la acomodación de un enlace α-1,6 entre los subsitios -1 y + 1 y que se mantienen los enlaces de hidrógeno productivos entre la fracción de glicopiranosa del subsitio + 1 y D282 (Fig. 4a, b). Sin embargo, debido a la mayor longitud del enlace α-1,6 con respecto a un enlace α-1,4, el enlace de hidrógeno estabilizador con R600 se debilita, lo que podría explicar una menor actividad de la enzima en las ramas con enlace α-1,6.

El dominio secundario de unión a sustrato

En el complejo rhGAA-acarbosa, pudimos observar la fracción de acarvosina de una segunda molécula de acarbosa alojada en un bolsillo dentro del dominio N-terminal del trébol Tipo-P, situado en la misma cara de rhGAA donde se encuentra el sitio activo y a 25 Å de la acarbosa unida a él (Fig. 4c). La fracción de valienamina se une por hidrógeno con sus grupos 4 y 6-hidroxilo al nitrógeno y oxígeno de la cadena principal de C127, al oxígeno de la cadena principal de A93 y a la cadena lateral de D91. Otras interacciones estabilizadoras las proporcionan las interacciones de apilamiento con P125 y W126. P125 y D91 se conservan o son reemplazados por sustituciones conservadoras en las enzimas de la familia GH31 que comprenden un dominio tipo P de trébol (Fig. Suplementaria 4a). Adyacente al sitio secundario de unión a carbohidratos, el bucle superficial G116-M122 había sido recortado por tratamiento proteolítico. Es posible que la eliminación del segmento G116-M122, único en los representantes lisosomales de la familia GH31 (Fig. suplementaria 4a, b), contribuya a la formación del bolsillo secundario de unión a sustrato. Se podría pensar que el sitio secundario de unión a la acarbosa en la rhGAA representa un verdadero sitio de unión a sustrato que posiblemente mejore la procesabilidad de la enzima. Este sitio también podría representar un farmacóforo para la búsqueda in silico de nuevas chaperonas farmacológicas. En particular, un trisacárido derivado de la acarbosa se une al dominio N-terminal de la familia GH31 α-1,4-glucano liasa de Gracilariopsis lemaneiformis 33 en una posición cercana al sitio de unión a sustrato secundario descrito aquí (Fig. 5 suplementaria).

La N-acetilcisteína es una chaperona farmacológica alostérica

Se ha demostrado que el conocido fármaco N-acetilcisteína (NAC) actúa como chaperona farmacológica alostérica mejorando la estabilidad de la GAA endógena mutada y la rhGAA utilizada para la ERT, sin afectar a la actividad catalítica18. Para aprovechar el potencial terapéutico de la NAC para la enfermedad de Pompe a través de estudios estructurales, buscamos la estructura cristalina de la rhGAA en complejo con la NAC. La estructura de 1,83 Å de resolución del complejo obtenida mediante experimentos de maceración de cristales (Tabla 1), revela dos sitios de unión a NAC alejados del sitio activo (Fig. 4d, e), proporcionando evidencia estructural de que NAC es realmente una chaperona alostérica, tal y como se anticipó en los estudios funcionales18. Hemos comprobado, mediante ensayos de actividad y fluorimetría de barrido diferencial, que el NAC estabiliza igualmente bien al rhGAA y a la enzima madurada proteolíticamente producida en este estudio, y que la chaperona es específica para el GAA, ya que el NAC no tiene ningún efecto estabilizador sobre un homólogo del GH31 del arroz (Fig. 6a, b y Tablas Suplementarias 3 y 4). En la estructura del complejo rhGAA-NAC una molécula de NAC, designada como NAC1, se encuentra a unos 30 Å del sitio activo, en la interfaz entre el barril (β/α)8 y el dominio de la lámina β distal (Fig. 4d). NAC1 se une al carboxilo de la cadena principal de H432 a través de su nitrógeno amida y la función carboxilo hace un contacto mediado por agua con la cadena lateral de D513. Los grupos Cβ-Sγ y acetilo establecen interacciones de apilamiento con el grupo guanidina de R437 y el bucle G434-G435, respectivamente. Una segunda molécula de NAC parcialmente (75%) ocupada (NAC2), se aloja en la interfaz entre el barril (β/α)8 y el dominio de la lámina β proximal a una distancia de 25 Å del sitio activo (Fig. 4e). La función carboxilo de NAC2 hace un contacto mediado por agua con el oxígeno de la cadena principal de L756, el tiol se apila contra la cadena lateral de Q757 y el grupo acetilo se apila contra la cadena lateral de H742. Las dos moléculas de NAC establecen menos interacciones y más débiles con el rhGAA que las chaperonas DNJ y NHE-DNJ. Esto refleja las mayores concentraciones de NAC necesarias para la actividad de la chaperona (mM frente a µM), como se ejemplifica en el K D de 11,57±0,74 mM que obtuvimos por fluorimetría de barrido diferencial y en el K i de 3,4 y 3,0 µM para DNJ y NHE-DNJ, respectivamente18,29. Una curva de saturación sigmoidal que se ajusta mejor a los puntos experimentales apoya los sitios de unión alostéricos de NAC totalmente (NAC1) y parcialmente (NAC2) ocupados (Fig. Suplementaria 6c). Las interacciones de apilamiento establecidas entre los grupos acetilo de NAC1 y NAC2 y el rhGAA deben contribuir significativamente a la energía de unión, ya que los aminoácidos relacionados con el NAC, como la N-acetilserina y la N-acetilglicina tienen igualmente un efecto estabilizador sobre el rhGAA, mientras que los homólogos no acetilados no tienen ningún efecto18. La estructura del complejo rhGAA-NAC muestra una disminución de los parámetros de desplazamiento térmico atómico de los residuos que rodean los sitios de unión al NAC con respecto a los del rhGAA no unido, lo que apunta a una función estabilizadora global entre dominios impulsada por el NAC (Fig. suplementaria 7a-d). En el cristal, la NAC parece ejercer también un efecto antioxidante, ya que el residuo C938 se oxida a la forma de ácido sulfénico en todas las estructuras cristalinas descritas aquí, excepto en la estructura del complejo rhGAA-NAC (Fig. suplementaria 8a, b).

La NAC y los iminoazúcares muestran diferentes perfiles de chaperonización

Algunas mutaciones que conducen a la enfermedad de Pompe responden tanto a la NAC como a los iminoazúcares DNJ y NB-DNJ, mientras que otras se dirigen específicamente a una u otra chaperona farmacológica16,17,18. La gran mayoría de los mutantes de la GAA que responden a la actividad chaperona de los iminosugars se localizan en el alcance del sitio activo o en elementos estructurales que contribuyen a su arquitectura global. En los pacientes de Pompe, en los fibroblastos y en los modelos de ratón, los mutantes GAA que más responden a la NAC (A445P, Y455F y L552P)18 se localizan en las inserciones I y II, donde los correspondientes residuos de tipo salvaje contribuyen a la estabilización del dominio. A445, junto con F487, define los límites del inserto I, y el mutante A445P probablemente desestabiliza todo el andamiaje del inserto I (Fig. suplementaria 9a). El hidroxilo de la cadena lateral de Y455 en el inserto I interactúa con un bucle largo del dominio catalítico, mientras que la cadena lateral de L552 en el inserto II realiza interacciones hidrofóbicas con residuos del dominio N-terminal de la hoja β (Fig. 9b, c). Los respectivos mutantes Y455F y L552P tienen con toda seguridad un efecto desestabilizador global, que es claramente rescatado por NAC. Por lo tanto, la acción chaperona de los iminoazúcares puede considerarse como un rescate conformacional de los sitios activos estructuralmente perturbados, mientras que el efecto de la chaperona alostérica NAC parece deberse a la estabilización de las fluctuaciones conformacionales globales o locales.