Estudios de estabilidad del tiocolchicósido a granel y en cápsulas utilizando RP-HPTLC/Densitometría

Abstracto

Se desarrolló y validó un nuevo método cromatográfico de capa fina de alto rendimiento con indicación de estabilidad (RP-HPTLC) para el análisis densitométrico del tiocolchicósido. Los cromatogramas se desarrollaron utilizando placas de aluminio pre-recubiertas con gel de sílice 60 RP-18 F254S como fase estacionaria y metanol : agua (70 : 30 ) como fase móvil. La banda compacta para el tiocolchicósido se observó en el valor de a una longitud de onda de absorción de 377 nm. Los datos de regresión lineal para los gráficos de calibración () se encontraron con respecto al área del pico en el rango de concentración de 100-600 ng por banda. El límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) fueron 9,77 ng y 29,63 ng, respectivamente. El fármaco se expuso a condiciones de hidrólisis ácida y alcalina, oxidación, fotodegradación y calor seco. Los picos de los productos de degradación se separaron bien del pico del fármaco estándar con valores significativamente diferentes. El análisis estadístico demostró que el método RP-HPTLC establecido es reproducible, selectivo y preciso para la determinación del tiocolchicósido en sus formulaciones. El método puede separar eficazmente el fármaco de sus productos de degradación, y puede considerarse como un ensayo indicador de estabilidad.

1. Introducción

El tiocolchicósido es químicamente 2-demetoxi-2-glucosidoxitolchicina (Figura 1) . El tiocolchicósido es un derivado sulfúrico semisintético del colchicósido, un glucósido natural presente en la planta Gloriosa superba. Clínicamente, el tiocolchicósido se utiliza como relajante muscular, antiinflamatorio y analgésico. Se han establecido pocos métodos de LC-MS-MS para la evaluación de la bioequivalencia del tiocolchicósido como componente único y en un comprimido combinado de dosis fija con lornoxicam .

Figura 1

Estructura química del tiocolchicósido.

Se han establecido algunos métodos analíticos, como LC-ESI-MS RP-HPLC y UV-Espectrofotométrico para la determinación de tiocolchicósido solo en formulaciones a granel y farmacéuticas.

El tiocolchicósido está disponible en combinación con muchos otros fármacos; por lo tanto, se han estudiado varios métodos como el UV-Espectrofotométrico, el RP-HPLC y el HPTLC para la determinación del tiocolchicósido en formas farmacéuticas combinadas.

Las directrices de la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) tituladas «Pruebas de estabilidad de nuevas sustancias y productos farmacéuticos» exigen que se lleven a cabo pruebas de estrés para dilucidar las características de estabilidad inherentes a la sustancia activa. Un método ideal para indicar la estabilidad es aquel que resuelve el fármaco estándar así como sus productos de degradación . Por lo tanto, es necesario desarrollar un método de determinación fiable y rápido, que también pueda utilizarse para obtener la separación óptima de los componentes de degradación del compuesto original. Sin embargo, hasta donde sabemos, no se ha mencionado en la literatura ningún artículo relacionado con la determinación por RP-HPTLC del tiocolchicósido que indique estabilidad. El objetivo del trabajo descrito en este artículo es establecer las condiciones para la identificación y el análisis cuantitativo del tiocolchicósido en presencia de sus productos de degradación para evaluar la pureza del fármaco a granel y la estabilidad de sus formas farmacéuticas. La idoneidad del método RP-HPTLC indicador de estabilidad para la determinación cuantitativa del tiocolchicósido se demostró mediante la validación de acuerdo con los requisitos de las directrices de la ICH.

2. Experimental

2.1. Productos químicos y reactivos

El tiocolchicósido se obtuvo como muestra de regalo de Ajanta Pharma. Ltd, Mumbai, India. El metanol de grado HPLC, el HCl, el NaOH y el H2O2 se compraron a Merck Chemicals, India.

2.2. Instrumentos de HPTLC Instrumentación HPTLC

El estándar del fármaco y las muestras se mancharon en forma de bandas de 6 mm de anchura con una jeringa de microlitros CAMAG Linomat (100 μL, Hamilton, Bunaduz, Suiza) utilizando un aplicador de 5 muestras CAMAG Linomat (CAMAG Muttenz, Suiza) con una velocidad de aplicación constante, 150 nL por segundo. Las placas se lavaron previamente con metanol y se activaron a 100°C durante 10 minutos antes de la cromatografía. La cromatografía se llevó a cabo en placas de aluminio precubiertas con gel de sílice 60 RP-18 F254S (20 × 10 cm, E. Merck, Alemania). El desarrollo lineal ascendente con metanol: agua (70 : 30 v/v) como fase móvil se realizó en una cámara de vidrio de doble canal de 20 × 10 cm (CAMAG Muttenz, Suiza). El tiempo de saturación de la cámara optimizado para la fase móvil fue de 30 minutos a temperatura ambiente (28 ± 2°C). La longitud del recorrido del cromatograma fue de aproximadamente 80 mm. El tiempo de desarrollo de la placa fue de 25 min. Tras el desarrollo, las placas se secaron en corriente de aire mediante un secador de aire. La detección de las manchas se realizó a 377 nm con un CAMAG TLC Scanner 3 en modo de absorbancia operado por el software winCATS versión 1.3.0. La fuente de radiación fue una lámpara de deuterio. Las dimensiones de la hendidura fueron de 6 mm × 0,45 mm, y la velocidad de barrido, de 20 mm por segundo.

2.3. Preparación del estándar de reserva

Solución estándar de reserva de 1 mg/mL de tiocolchicósido en metanol.

2.4. Estudio de linealidad

Se transfirió una solución estándar en el rango de 0,2 a 1,2 mL a seis matraces volumétricos separados de 10 mL y se completó el volumen con metanol. De cada una de las soluciones anteriores, se aplicaron 5 μL en placas RP-HPTLC para obtener la concentración en el rango de 100 a 600 ng por banda. El gráfico de calibración para el método se construyó como área de pico frente a la concentración del fármaco.

2.5. Preparación de la solución de muestra

Para determinar el contenido de tiocolchicósido en cápsula, se pesaron veinte cápsulas (MYORIL, declaración de la etiqueta: 8 mg de tiocolchicósido por cápsula); se retiró el contenido de las cápsulas y se determinó el peso medio. Una cantidad equivalente a 8 mg de tiocolchicósido se transfirió a un matraz volumétrico de 100 mL que contenía 50 mL de metanol y se sonicó durante 10 minutos; el volumen se ajustó a la marca y se filtró usando papel de filtro Whatmann No. 41. Un volumen de 5 mL se diluyó a 10 mL con metanol; la solución resultante de 5 μL se aplicó en la placa RP-HPTLC para el ensayo de tiocolchicósido. Las placas se revelaron y escanearon como se ha descrito anteriormente.

2.6. Validación del método

El método se validó para los siguientes parámetros según las directrices de la ICH.

2.6.1. Precisión

La repetición de la aplicación de la muestra y la medición del área del pico se realizaron utilizando seis réplicas de la concentración del ensayo (400 ng por banda de tiocolchicósido). La variación intra e interdiaria para la estimación del tiocolchicósido se llevó a cabo utilizando tres réplicas a tres niveles de concentración diferentes (200, 300 y 500 ng por banda).

2.6.2. Límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ)

Para determinar el límite de detección y cuantificación, se utilizaron concentraciones de tiocolchicósido en la parte inferior del rango lineal de la curva de calibración. A partir de la solución patrón madre, se aplicaron por triplicado 100, 120, 140, 160, 180 y 200 ng de tiocolchicósido por banda en la placa RP-HPTLC y se calcularon el LOD y el LOQ mediante las siguientes ecuaciones: donde «» es la desviación estándar de las áreas de los picos de los fármacos (), tomada como medida del ruido y «» es la pendiente de la curva de calibración correspondiente.

2.6.3. Especificidad

La especificidad del método se comprobó analizando el estándar del fármaco y la muestra. La banda del tiocolchicósido en la muestra se confirmó comparando los valores y los espectros de la banda con los del estándar del fármaco. La pureza del pico del tiocolchicósido se confirmó comparando los espectros en tres niveles diferentes, es decir, las posiciones de inicio de pico (), de ápice de pico () y de final de pico () de la banda.

2.6.4. Resistencia Robustez

La robustez del método se realizó analizando 400 ng de tiocolchicósido por dos analistas diferentes manteniendo las mismas condiciones experimentales y ambientales.

2.6.5. Exactitud

Se aplicaron en placa nueve bandas de solución de muestra de tiocolchicósido (200 ng por banda) y, a continuación, se aplicó por triplicado la cantidad conocida de tiocolchicósido al 80, 100 y 120% (160, 200 y 240 ng por banda) de la concentración de la muestra (200 ng por banda) y se volvió a analizar mediante el método propuesto. Esto se realizó para evaluar el estudio de recuperación del fármaco a diferentes niveles en las formulaciones.

2.6.6. Robustez

Haciendo pequeñas modificaciones en la composición de la fase móvil, la cantidad de fase móvil, el tiempo desde la aplicación hasta el desarrollo y el tiempo desde el desarrollo hasta el escaneo se examinaron los efectos en los resultados. Se probaron fases móviles con diferentes composiciones de metanol: agua (72 : 28 v/v) y metanol: agua (68 : 32 v/v) y se realizaron cromatogramas. Las placas se lavaron previamente con metanol y se activaron a 80 ± 5°C durante 2, 5 y 8 minutos antes de la cromatografía. La robustez del método se realizó utilizando seis réplicas de la misma mancha (400 ng por banda de tiocolchicósido).

2.7. 2.7. Degradación forzada del tiocolchicósido

2.7.1. Hidrólisis ácida y básica

Una cantidad pesada con precisión de 10 mg de tiocolocósido se disolvió por separado en 10 mL de solución metanólica de HCl 1,0 M y NaOH 0,5 M, respectivamente, y se sometió a reflujo durante 30 min a 60°C en la oscuridad para evitar el probable efecto degradante de la luz. Se tomó por separado un volumen de 1,0 mL de las soluciones anteriores, se neutralizó y se diluyó hasta 10 mL con metanol. Las soluciones resultantes se aplicaron en las placas RP-HPTLC por triplicado (5 μL cada una, es decir, 500 ng por banda). Los cromatogramas se revelaron y escanearon como se ha descrito anteriormente.

2.7.2. Degradación oxidativa

Para la degradación oxidativa, se disolvió por separado una cantidad exactamente pesada de 10 mg de tioclochicósido en 10 mL de solución metanólica de H2O2 al 1% v/v y H2O2 al 3% v/v, respectivamente, y se mantuvo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min. Después de 30 minutos, se tomaron 1,0 mL de cada una de las soluciones anteriores y se diluyeron hasta 10 mL con metanol. Las soluciones resultantes se aplicaron en placas RP-HPTLC por triplicado (5 μL cada una, es decir, 500 ng por banda). Los cromatogramas se revelaron y escanearon como se ha descrito anteriormente.

2.7.3. Degradación por calor seco

Una cantidad pesada con precisión de 10 mg de tiocolchicósido se almacenó a 70°C durante 8 h en un horno. Se transfirió a un matraz volumétrico de 10 mL que contenía metanol y se completó el volumen hasta la marca. Se tomó 1,0 mL de la solución anterior y se diluyó hasta 10 mL con metanol. La solución resultante se aplicó en la placa RP-HPTLC por triplicado (5 μL cada uno, es decir, 500 ng por banda). El cromatograma se reveló y escaneó como se ha descrito anteriormente.

2.7.4. Foto Degradación

Se disolvió una cantidad exactamente pesada de 10 mg de tiocolchicósido en 10 mL de metanol y las soluciones se mantuvieron durante un periodo de 24 h en la luz. Se tomó un volumen apropiado de 1,0 mL de la solución anterior y se diluyó hasta 10 mL con metanol. La solución resultante se aplicó en la placa RP-HPTLC por triplicado (5 μL cada uno, es decir, 500 ng por banda). El cromatograma se reveló y escaneó como se ha descrito anteriormente.

3. Resultados y discusión

3.1. Desarrollo de la fase móvil óptima

Para la selección de la fase móvil apropiada para la separación del tiocolchicósido, se realizaron varias ejecuciones utilizando fases móviles que contenían disolventes de distintas polaridades, a diferentes niveles de concentración. Entre las diferentes combinaciones de fases móviles empleadas, la fase móvil consistente en metanol: agua (70 : 30 v/v) dio un pico nítido y bien definido con un valor de 0,60 ± 0,02 (Figura 2). Las bandas bien definidas se encontraron cuando la cámara se saturó con la fase móvil durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Figura 2

Cromatograma del estándar de tiocolchicósido con ( 0,60 ± 0,02) a 377 nm en metanol: agua (70 : 30 v/v) como fase móvil.

3.2. Curva de calibración Curva de calibración

Los datos de regresión lineal para las curvas de calibración () mostraron una buena relación lineal en el rango de concentración de 100-600 ng por banda. La ecuación de regresión lineal resultó ser , = 0,9984 (Figura 3).

Figura 3

Curva de calibración de tiocolchicósido (100-600 ng por banda).

3.3. Validación del método

El método desarrollado se validó según las directrices de la ICH.

La precisión del método se reveló en términos de % de desviación estándar relativa (% RSD) del área del pico. Los resultados (Tabla 1) personificaron la precisión de los sonidos del método que se determinaron a partir de la pendiente de la parte más baja del gráfico de calibración. El LOD y el LOQ resultaron ser 9,77 ng y 29,63 ng, respectivamente, lo que indica que la sensibilidad del método es adecuada.

Parámetros Concentración (ng por banda) % Cantidad encontrada % RSD Repetibilidad () 400 99.39 0,61 Intradía () 200 100,73 0,64 300 99.83 0.78 500 99.18 0.32 Día () 200 100,80 1,43 300 99,65 0.70 500 99,91 0,50

: número de determinaciones.

Tabla 1

Repetibilidad y precisiones intradiarias e interdiarias.

Los estudios de recuperación se realizaron al 80%, 100% y 120% de la concentración de la prueba según las directrices de la ICH. El porcentaje de recuperación de tiocolchicósido en los tres niveles se encontró en el rango de 99,92-100,04%. Las cantidades de fármaco añadidas y determinadas y el % de recuperación se muestran en la (Tabla 2). La pureza del pico de tiocolchicósido se confirmó mediante la evaluación de los estudios de los espectros en las posiciones de inicio, ápice y final del pico de la banda, es decir, (, ) = 0,9995 y (, ) = 0,9986 mostrando la especificidad del método (Figura 4). Se obtuvo una buena correlación ( = 0,9989) entre el estándar del fármaco y el fármaco extraído de la formulación de la cápsula. Se experimentó la robustez del método haciendo una alteración intencionada de las condiciones cromatográficas, y se observó el efecto en el cromatograma. Se calculó la desviación estándar de las áreas de los picos para cada parámetro, y se comprobó que el % RSD era inferior al 2%. Los bajos valores de % RSD indican la robustez del método; los resultados se muestran en la (Tabla 3). La robustez del método fue verificada por diferentes analistas y el % RSD resultó ser de 0,57 y 0,58, lo que indica que el método es robusto.

Fármaco Cantidad inicial (ng por banda) Cantidad de fármaco estándar añadida (%) % Fármaco recuperado () % D.R.S. () Thiocolchicoside 200 80 99,92 0,74 100 100,04 0.88 120 99,97 0,46

: número de determinaciones.

Tabla 2

Estudios de recuperación.

Parámetro ± S.D. del área del pico () % D.S.R. () Composición de la fase móvil (±2 mL) 32,38 0.73 Cantidad de fase móvil (±5%) 37,31 0,84 Tiempo desde la aplicación hasta el desarrollo (±10 min) 24.72 0,55 Tiempo desde el desarrollo hasta la exploración (±10 min) 36,77 0.82 Activación de las placas TLC 34,40 0,77

: número de determinaciones.

Tabla 3

Robustez del método.

Figura 4

Espectro de pureza máxima del estándar de tiocolchicósido (a) y del tiocolchicósido extraído de la cápsula (b) escaneado en las posiciones de inicio, ápice y final de pico.

3.4. El análisis de la formulación comercializada

El tiocolchicósido cuando se extrajo de la formulación de la cápsula demostró un único punto que tenía = 0,60 ± 0,02 en el cromatograma. El porcentaje medio de contenido de fármaco fue del 100,27% de la declaración de la etiqueta con una RSD del 0,88%.

3.5. 3.5. Propiedades indicadoras de estabilidad

3.5.1. Degradación ácida

La degradación forzada del tiocolchicósido en HCl 1,0 M (60°C durante 30 min) resultó ser inestable y mostró dos picos adicionales con valores de 0,33 y 0,71 (Figura 5(a)). Las manchas de los productos degradados estaban bien separadas de la mancha del tiocolchicósido.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 5

RP-Cromatogramas HPTLC obtenidos del tiocolchicósido degradado por (a) hidrólisis ácida (1 M HCl), (b) hidrólisis alcalina (0.5 M NaOH), (c) estrés oxidativo (1% v/v H2O2), y (d) estrés oxidativo (3% v/v H2O2).

3.5.2. Degradación básica

El tiocolchicósido resultó ser inestable durante la hidrólisis alcalina en NaOH 0,5 M a 60°C durante 30 min. El fármaco mostró un pico adicional con un valor de 0,72, mientras que el tiocolchicósido se mantuvo en 0,60 (Figura 5(b)). Las manchas de los productos degradados estaban bien separadas de las de la droga.

3.5.3. Degradación oxidativa

El tiocolchicósido posee un átomo de azufre, que es más susceptible a la oxidación por H2O2. Tras el tratamiento del tiocolchicósido con H2O2 al 1% v/v, se observaron tres picos adicionales con valores de 0,38, 0,46 y 0,70 junto con el tiocolchicósido que se mantuvo en 0,60 (Figura 5(c)). En la degradación oxidativa con un 3% v/v de H2O2, el tiocolchicósido sufrió una degradación completa que dio lugar a dos picos principales con valores de 0,58 y 0,64 y un pico de 0,70, respectivamente (Figura 5(d)). Los espectros de pureza de pico del tiocolchicósido recuperado tras la degradación en HCl 1 M, NaOH 0,5 M y H2O2 1% v/v y el estándar de tiocolchicósido escaneado en las posiciones de inicio de pico, ápice de pico y final de pico del punto se muestran en la (Figura 6). Los resultados de los estudios de prueba de esfuerzo revelaron que el método era altamente específico para el tiocolchicósido. Los productos de degradación eran totalmente distinguibles del compuesto original. No se identificó ninguna descomposición al exponer la solución del fármaco a la luz solar durante la fotodegradación y la degradación térmica, lo que indica la estabilidad del fármaco en ambas condiciones. Los resultados del estudio de degradación forzada del tiocolchicósido se resumen en la (Tabla 4).

Figura 6

Espectro de pureza máxima del tiocolchicósido recuperado tras la degradación en HCl 1 M, 0.5 M NaOH, 1% v/v H2O2, los degradantes y el estándar de tiocolchicósido escaneados en las posiciones de inicio de pico, ápice de pico y final de pico.

4. Conclusión

En el presente estudio, se llevó a cabo la degradación forzada de tiocolchicósido para dilucidar su estabilidad química inherente. Para ello se ha desarrollado un método RP-HPTLC. El método desarrollado resultó ser sencillo, rápido, selectivo, sensible y adecuado para la determinación del tiocolchicósido en el material a granel y en la formulación de cápsulas. Durante el estudio, se descubrió que el tiocolchicósido es susceptible a la hidrólisis ácida y básica, así como a la oxidación. Como el método es indicativo de estabilidad, puede utilizarse para determinar la pureza del fármaco disponible en diversas fuentes mediante la detección de las impurezas relacionadas. Además, se puede concluir que las impurezas presentes en el fármaco podrían deberse a la hidrólisis o a la oxidación durante el procesamiento y el almacenamiento del fármaco.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimiento

Los autores agradecen a R. C. Patel Institute of Pharmaceutical Education and Research, Shirpur (M.S.), India, por proporcionar las instalaciones necesarias para llevar a cabo este trabajo de investigación.