- Abstract
- 1. Introducción
- 2. Materiales y métodos
- 2.1. Sujetos
- 2.2. Muestreo de sangre
- 2.3. Extracción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
- 2.4. Extracción de ARN y síntesis de ADNc
- 2.5. Diseño de cebadores
- 2.6. Evaluación de los factores bioquímicos del suero
- 2.7. Análisis e interpretación de los resultados
- 3. Resultados
- 3.1. Resultados de la qRT-PCR
- 3.2. Evaluación de la expresión génica en PBMC
- 4. Discusión
- Conflicto de intereses
- Agradecimientos
Abstract
Los genes ABCA1 y ABCG1 codifican las proteínas transportadoras de colesterol que desempeñan un papel clave en la homeostasis del colesterol y los fosfolípidos. Este estudio tenía como objetivo evaluar y comparar la expresión de los genes ABCA1 y ABCG1 en pacientes con síndrome metabólico y en individuos sanos. Este estudio de casos y controles se realizó en 36 pacientes con síndrome metabólico y el mismo número de individuos sanos en Hamadan (oeste de Irán) durante 2013-2014. El ARN total se extrajo de las células mononucleares y se purificó utilizando la columna RNeasy Mini Kit. La expresión de los genes ABCA1 y ABCG1 se realizó mediante qRT-PCR. El perfil lipídico y la glucemia en ayunas se midieron mediante procedimientos colorimétricos. La expresión de ABCG1 en los pacientes con síndrome metabólico fue significativamente menor (alrededor del 75%) en comparación con la del grupo de control, mientras que en el caso de la expresión de ABCA1, no hubo diferencias significativas entre los dos grupos estudiados. La comparación de otros parámetros como el HDL-C, el FBS, el IMC, el perímetro de la cintura y la presión arterial sistólica y diastólica entre los pacientes con síndrome metabólico y los individuos sanos mostró diferencias significativas (). La disminución de la expresión del ABCG1 en los pacientes con síndrome metabólico en comparación con los individuos sanos sugiere que la hiperglucemia, los metabolitos relacionados y la hiperlipidemia sobrepasan la capacidad de transporte y dan lugar a una disminución de la expresión del ABCG1. La ausencia de un cambio significativo en la expresión del gen ABCA1 entre dos grupos puede indicar un mecanismo de regulación diferente para la expresión de ABCA1.
1. Introducción
El síndrome metabólico (SM) se define como un conjunto de factores de riesgo interrelacionados de diabetes y enfermedades cardiovasculares (ECV) . Existen algunos criterios para el diagnóstico clínico del síndrome metabólico que incluyen un perímetro de cintura elevado (≥102 cm en hombres y ≥88 cm en mujeres), triglicéridos elevados (≥150 mg/dL o 1.7 mmol/L), reducción del colesterol de las lipoproteínas de alta densidad (HDL-C <40 mg/dL o 1,03 mmol/L en los hombres y <50 mg/dL o 1,3 mmol/L en las mujeres), y presión arterial elevada (≥130 mm Hg de presión arterial sistólica o ≥85 mmHg de presión arterial diastólica) . El SM puede diagnosticarse mediante la observación de tres de estos criterios. En los últimos años, la prevalencia del SM aumentó en todo el mundo; sin embargo, en los Estados Unidos de América, ha disminuido del 25,5% en 1999/2000 al 22,9% en 2009/2010. Weiss y sus colegas informaron de que la obesidad está directamente asociada con el aumento de la prevalencia del SM. Existe una asociación inversa entre la ECV y el nivel de HDL-C en plasma, uno de los criterios del síndrome metabólico . La lipoproteína de alta densidad, una subfracción de las lipoproteínas circulatorias, desempeña un papel importante en el transporte de colesterol desde el tejido periférico hasta las células hepáticas. Las HDL son ricas en proteínas Apo A-I y Apo A-II, y más de dos tercios de su contenido son Apo A-I.
Los transportadores transmembrana ABC tienen un papel importante en la captación de colesterol de los macrófagos a las HDL y disminuyen la formación de células espumosas . ABCA1 compuesto por 2261 aminoácidos se presenta en la mayoría de los tejidos. En los últimos años, se ha demostrado que ABCA1 desempeña un papel esencial en la protección de las enfermedades cardiovasculares. La síntesis de HDL depende directamente de la actividad de ABCA1 en las células hepáticas; en otras palabras, tiene una función clave en la protección de las células arteriales contra las células espumosas mediante el aumento de las HDL en plasma. La actividad ABCA1 de los macrófagos arteriales ha mostrado una asociación inversa con la formación de células espumosas, ya que con el aumento de su actividad se reducirá la formación de células espumosas.
La actividad ABCA1 reducida o deteriorada podría causar algunas enfermedades como la diabetes de tipo 2 , la enfermedad de Tánger y la ECV prematura.
El gen ABCA1 está localizado en el cromosoma 21q22.3 . Tanto ABCA1 como ABCG1 conducen a la reducción del colesterol tisular mediante su eflujo a las HDL, pero ABCG1 transporta el colesterol tisular a las HDL2 y HDL3 y ABCA1 lo transporta a la Apo A-I libre de lípidos . Los macrófagos son el tejido más importante de la acción de ABCA1 y ABCG1 . En muchos estudios, se examinaron los efectos de la regulación ascendente y descendente de estos genes.
La reducción del flujo de colesterol es la consecuencia de la falta de expresión de ABCA1 in vitro; puede conducir a un aumento de la aterosclerosis, pero la regulación ascendente de ABCA1 resulta en la reducción de la aterosclerosis. La regulación a la baja de ABCG1 también tiene los mismos efectos sobre el flujo de colesterol, pero hay resultados controvertidos sobre el impacto de la regulación a la baja de ABCG1 en la aterosclerosis.
En el SM, los patrones de expresión de algunos genes cambian y pueden conducir a la obesidad, la diabetes y la hipertensión. En el presente estudio, nos propusimos evaluar la expresión de los genes ABCA1 y ABCG1 en pacientes con MetS, ya que estos genes están implicados en la síntesis de transportadores que tienen un papel crucial en el transporte de colesterol.
2. Materiales y métodos
2.1. Sujetos
Este estudio de casos y controles se llevó a cabo en pacientes que fueron remitidos a una sala de endocrinología en un hospital de Hamadan (oeste de Irán) durante 2013-2014. Se seleccionaron 36 pacientes con síndrome metabólico. Además, se seleccionaron 36 individuos sanos de la misma edad y sexo como grupo de control. Ninguno de los individuos sanos tenía los criterios del síndrome metabólico.
El criterio de inclusión en el grupo de síndrome metabólico era tener tres de las cinco características mencionadas. Los pacientes con antecedentes de consumo de fármacos antilipídicos, anticonceptivos y diuréticos fueron excluidos del estudio. También se excluyeron las pacientes embarazadas y los pacientes con diabetes, inflamación e infección.
2.2. Muestreo de sangre
Se añadió una muestra de sangre de 2,5 mL de cada sujeto a un tubo que contenía EDTA y se mantuvo a 4°C para la extracción de ARN (no más de dos horas después).
2.3. Extracción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
Se utilizaron soluciones de Lymphodex (Alemania) y Henx (Irán) para el aislamiento de PBMC. Se añadieron unos 2 mL de solución Henx a un volumen igual de sangre y se mezclaron completamente; luego se vertieron en 3 mL de solución Lymphodex cuidadosa y lentamente. Posteriormente, la mezcla se colocó en el Lymphodex y se centrifugó a 1000 g durante 20 minutos. La capa blanca intermedia entre el plasma y el Lymphodex se aisló como células mononucleares (MC); después se añadió el tampón Henx sobre las MC, se mezcló completamente y se centrifugó. Finalmente, se descartó el sobrenadante y se repitió el proceso una vez más.
2.4. Extracción de ARN y síntesis de ADNc
La extracción neta de ARN se realizó utilizando el kit de purificación de ARN Gene JET según el protocolo del fabricante. La calidad y la cantidad del ARN purificado se analizaron utilizando el NanoSpectrophotometer (Epoch, BioTek, USA); después se examinó la integridad de cada muestra de ARN utilizando un gel de agarosa al 1%, 1x TBE.
El ARN se convirtió en ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena RevertAid (K1622) siguiendo el protocolo: paso 1: recocido del cebador a 25°C durante 5 min; paso 2: síntesis de ADNc a 42°C durante 60 min; paso 3: inactivación por calor a 70°C durante 5 min. Los productos se almacenaron a -80°C para los siguientes pasos.
2.5. Diseño de cebadores
Los cebadores específicos para cada gen se diseñaron con el software Allele ID (versión 7.6). Con el fin de aumentar la especificidad de la reacción de PCR en tiempo real y reducir los resultados falsos positivos, se diseñó un cebador de cada par para unirlo a la zona de unión Exón-Exón. Los criterios exhaustivos de los cebadores utilizados para cada gen se presentan en la Tabla 1. El gen de mantenimiento 18S rRNA se utilizó como control interno.
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La expresión relativa de los genes se calculó mediante la medición del valor del ciclo umbral (CT) para cada muestra utilizando el termociclador C1000 y el sistema en tiempo real CFX96 (Bio-Rad, EE.UU.) y el kit SYBR Premix Ex Taq 2 (TakaRa nº RR820L). Se determinó como valor de TC la media del ensayo por triplicado de cada muestra. Las cantidades de ingredientes de la reacción de qRT-PCR incluían 10 μL de SYBR green, 7 μL de agua desionizada y 1 μL de cada uno de los cebadores delanteros, los cebadores inversos y la plantilla. La qRT-PCR se llevó a cabo en estas condiciones: activación inicial a 95 °C durante 30 segundos y, a continuación, 40 ciclos de los siguientes pasos repetidos: desnaturalización a 95 °C durante 5 segundos, recocido a la temperatura de recocido optimizada para la duración adecuada de cada gen, y extensión a 72 °C durante 30 segundos, y al final, los datos se adquirieron aumentando la temperatura de 72 °C a 95 °C durante 0,5 °C/0,05 segundos. A continuación, los productos de la PCR se electroforizaron (en gel de agarosa al 1%, 1x TBE) para verificar la especificidad de los amplicones.
2.6. Evaluación de los factores bioquímicos del suero
Se recogió una muestra de sangre de dos mililitros de cada sujeto y se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min para la separación del suero. Se examinaron el colesterol total (CT), el LDL-C, los TG, el FBS y el HDL-C utilizando el kit Pars Azmun (Irán) de Hitachi 911 (Alemania).
2.7. Análisis e interpretación de los resultados
se utilizó la fórmula para el análisis de la expresión génica relativa de los grupos de síndrome metabólico y de control. La eficiencia de la PCR en tiempo real se calculó para cada gen utilizando una dilución de 10-2; posteriormente, el número obtenido se colocó en la siguiente fórmula computacional para medir los cambios en los pliegues de la expresión génica :Se utilizó el software SPSS V.16 para el análisis estadístico con intervalos de confianza del 95%. La distribución normal de las variables se comprobó mediante el método de Kolmogorov-Smirnov y, a continuación, se compararon los valores entre dos grupos mediante la prueba de muestras independientes.
3. Resultados
Las características demográficas y los factores bioquímicos de los grupos estudiados se presentan en la Tabla 2. La proporción hombre/mujer fue de 1/3 en cada grupo (12 M y 24 F). Como se muestra en la Tabla 2, las diferencias en todos los parámetros examinados fueron estadísticamente significativas entre los dos grupos () con la excepción de la edad y el C-LDL. El grupo con síndrome metabólico tenía un IMC, un C-LDL, un CT, un TG, un FBS, una presión arterial diastólica/diastólica y un perímetro de cintura más elevados que los individuos sanos, mientras que el C-HDL era significativamente más bajo en el grupo con síndrome metabólico.
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| IMC: índice de masa corporal; FBS: azúcar en sangre rápida; TG: triglicéridos, HDL-C: colesterol de lipoproteínas de alta densidad; LDL-C: colesterol de lipoproteínas de baja densidad; diferencia significativa. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.1. Resultados de la qRT-PCR
Tras la finalización de la reacción de PCR, se verificaron los resultados mediante el análisis de la curva de reacción, la curva de fusión de los productos y la electroforesis de los productos de PCR. La electroforesis se realizó en agarosa al 1% utilizando una escalera de ADN de 100 pb. Los resultados se muestran en la Figura 1.
3.2. Evaluación de la expresión génica en PBMC
Los niveles de expresión de los genes se midieron en las células mononucleares de sangre periférica y se compararon entre dos grupos mediante el cálculo de ΔCT para cada gen. No hubo diferencias en la expresión de ABCA1 entre los dos grupos, pero la expresión de ABCG1 fue significativamente menor en el grupo de MetS (). Los resultados detallados se muestran en la Tabla 3.
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| Significativo. | ||||||||||||||||||||||||||
Además, el cálculo del cambio de pliegue en la expresión de ABCG1 () indicó una expresión 3,1 veces menor en el grupo de MetS.
4. Discusión
ABCA1 y ABCG1 tienen un papel crucial en el transporte inverso del colesterol desde los tejidos periféricos, como los macrófagos, al hígado. Sin embargo, la expresión de los genes ABCA1 y ABCG1 se ha estudiado en algunas enfermedades; no encontramos ningún informe sobre este tema en el síndrome metabólico. En este estudio, examinamos la expresión de estos genes en sujetos con síndrome metabólico y en individuos sanos.
Aunque no hubo diferencias significativas en la expresión del gen ABCA1 entre los dos grupos estudiados, encontramos una expresión significativamente menor (alrededor del 75%) de ABCG1 en sujetos con síndrome metabólico en comparación con el grupo de control. Singaraja et al. demostraron que la reducción de ABCA1 en los macrófagos y los riñones se asocia con un mayor contenido de colesterol. Concluyeron que el deterioro de la exportación de colesterol mediada por ABCA1 podría contribuir al aumento de la aterosclerosis y la nefropatía asociadas a la diabetes. Hay algunos informes que tratan de abordar los posibles mecanismos que regulan la expresión de estos genes. Recientemente, se ha demostrado que los polimorfismos en ABCA1 y ABCC8 pueden estar asociados al síndrome metabólico . Hay pruebas que demuestran que la alteración de la función de ABCA1, que puede ser el resultado de una mutación en este gen, puede dar lugar a una hipoalphalipoproteinemia familiar que se caracteriza por un bajo nivel de HDL y un mayor depósito de ésteres de colesterol en varios tejidos y células . Además, se ha demostrado que la sobreexpresión del gen ABCA1 puede conferir protección contra la aterosclerosis . Estos datos coinciden con nuestros hallazgos y apoyan la idea de que una menor expresión del gen ABCA1 puede contribuir a las complicaciones del síndrome metabólico.
Haghpassand et al. demostraron que la expresión del gen ABCA1 en las PBMCs tiene una relación directa con la carga de colesterol, y la sobreexpresión de ABCA1 conduce a la transferencia del exceso de colesterol a las apoproteínas . Wang et al. estudiaron el transporte inverso de colesterol en ratones con ABCA1 y ABCG1 eliminados y concluyeron que cuando se eliminan tanto ABCA1 como ABCG1, hay un mayor transporte inverso de colesterol en comparación con el ABCG1 eliminado.
Dado que Mauerer et al. señalaron que el alto nivel de glucosa (hiperglucemia) está implicado en la reducción de la expresión de ABCA1 y ABCG1 in vitro , parece lógico esperar cambios similares en la MetS. Los promotores de ABCA1 y ABCG1 tienen sitios receptores para LXR y RXR; cuando el oxicolesterol y el ácido retinoico se unen a estos factores, la expresión de ABCA1 y ABCG1 aumenta. Además, el AMPc y el NFκB son factores transcripcionales para ABCA1 y ABCG1, respectivamente.
Los resultados obtenidos indicaron una disminución significativa de la expresión de ABCG1 en los pacientes con síndrome metabólico en comparación con los individuos sanos. Estos resultados sugieren que la hiperglucemia, los metabolitos relacionados y la hiperlipidemia sobre la capacidad del transportador pueden conducir a la disminución de la expresión de ABCG1. Dado que no se observó ningún cambio significativo en la expresión del gen ABCA1, puede deberse a un mecanismo de regulación diferente. Dado que las estructuras de estos genes son diferentes y están regulados por diversos factores transcripcionales, nuestros resultados pueden justificarse. No obstante, el número limitado de muestras en este estudio es otro factor para la ausencia de cambios en la expresión de ABCA1.
El otro punto es que examinamos la expresión de estos genes en las PBMC de los sujetos estudiados; es importante notar que los cambios en la expresión de estos genes en los monocitos pueden ser diferentes a los de otros tejidos clave como el hígado y el intestino, que son los principales sitios de síntesis de HDL. Además, los cambios en los niveles de ARNm no implican necesariamente cambios en la proteína relacionada.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo se ha extraído de la tesis de maestría de Zahra Tavoosi. Los autores desean agradecer a la Universidad de Ciencias Médicas de Hamadan el apoyo financiero a este estudio.