Fronteras de la Microbiología

Introducción

Los bacteriófagos han entrado en el foco de la investigación científica, ya que juegan un papel importante en casi todas las comunidades microbianas. Como depredadores virales de las bacterias, tienen una influencia sustancial en las poblaciones y dinámicas microbianas en diferentes entornos. Hay varias revisiones que tratan del papel de los bacteriófagos en diferentes hábitats como los mares o el cuerpo humano (Clokie y Mann, 2006; Wahida et al., 2016; Łusiak-Szelachowska et al., 2017). Desde su descubrimiento hace más de 100 años, por separado por Frederick Twort y luego por Félix D’Herelle (Salmond y Fineran, 2015), los bacteriófagos se han utilizado en los países de Europa del Este para el tratamiento médico de las infecciones bacterianas, mientras que en el resto del mundo los antibióticos eran los protagonistas (Myelnikov, 2018). En la actualidad, dado que las infecciones por bacterias multirresistentes se han convertido en una amenaza mundial (Zaman et al, 2017), los pacientes de todo el mundo son tratados en el Instituto Eliava de Bacteriófagos, Microbiología y Virología, en Tiflis (Georgia), que tiene quizá la mayor experiencia en terapia con bacteriófagos (Kutateladze y Adamia, 2008), y también en la Unidad de Terapia con Bacteriófagos del Instituto Ludwik Hirszfeld de Inmunología y Terapia Experimental en Wrocław (Polonia) (Międzybrodzki et al., 2012). La aplicación de los bacteriófagos podría ser una solución valiosa no solo en el sector médico, sino también en otros campos en los que las bacterias pueden tener un impacto negativo.

Algunas empresas de Estados Unidos, como OmniLytics Inc. (Sandy, UT, Estados Unidos) e Intralytix Inc. (Baltimore, MD, Estados Unidos) han desarrollado diferentes productos bacteriófagos para su aplicación como desinfectantes en la industria alimentaria que pueden utilizarse contra la Salmonella, la Escherichia coli y la Listeria monocytogenes. En Europa, una empresa holandesa Micreos BV (Wageningen, Países Bajos) también comercializó productos de bacteriófagos contra Salmonella y E. coli y una empresa alemana, Fink Tec (Hamm, Alemania), dirigidos a E. coli (Moye et al., 2018). Se espera una aplicación más amplia de los bacteriófagos en la cadena de valor de los alimentos, incluida la agricultura y la acuicultura, donde un amplio espectro de diversos patógenos de plantas y peces causa importantes pérdidas económicas (Buttimer et al., 2017; Doss et al., 2017).

Aunque ya se están comercializando algunos productos de bacteriófagos, aún no se ha logrado un proceso eficaz, constante y controlable para la producción de bacteriófagos. La producción de fagos en los laboratorios puede considerarse un proceso rutinario, y los protocolos están bien definidos; sin embargo, estos procesos no son fáciles de ampliar. El principal interés de las entidades industriales es obtener métodos fiables para la producción de fagos que permitan el escalado del proceso. Sin embargo, la solución no es fácil, debido a la naturaleza biológica del sistema y a los diversos tipos de interacciones que se producen entre los fagos y las bacterias.

Ha habido varios intentos de generar métodos fiables para la producción de bacteriófagos. Algunos investigadores han utilizado un enfoque teórico con modelos de simulación, mientras que otros adoptaron el enfoque práctico mediante experimentos. Esta mini-revisión examina ejemplos seleccionados de ambos enfoques, contrastando sus principales diferencias.

Generalidades en la producción de bacteriófagos

La naturaleza biológica de los bacteriófagos obliga a su reproducción en la célula huésped. Por lo tanto, un método para la producción de bacteriófagos requiere un proceso de producción que implique al menos dos unidades operativas, el crecimiento de la bacteria huésped y la propagación (o infección) del bacteriófago. Es importante tener en cuenta parámetros básicos para el crecimiento bacteriano y la infección de fagos, como los sustratos seleccionados para la bacteria y la temperatura óptima, tanto para el crecimiento bacteriano como para la infección de fagos, ya que estos factores pueden influir en la infectividad de los fagos (Tokman et al., 2016). Del mismo modo, es importante conocer la biología del fago a producir, incluyendo los diferentes parámetros de infección como la tasa de adsorción, el tamaño del estallido y el período de latencia; sin embargo, como se discutirá más adelante, estos parámetros pueden cambiar dependiendo de las condiciones de infección (Santos et al., 2014). Más importante aún, se recomienda tener un conocimiento profundo de las interacciones específicas que pueden ocurrir entre el huésped bacteriano y el fago seleccionado, como la presencia de un sistema CRISPR-cas en la bacteria, porque estos factores pueden tener una fuerte influencia en el proceso de infección del fago (Levin et al., 2013). También se recomienda seleccionar una cepa bacteriana no virulenta como huésped. La producción de bacteriófagos a nivel industrial requerirá grandes cantidades de la bacteria huésped, por lo que evitar el uso de patógenos virulentos resistentes a los medicamentos, y especialmente multirresistentes, debería ser obligatorio en un proceso de producción de fagos (Torres-Barceló, 2018). Lo mismo ocurre con las bacterias portadoras de profagos, ya que podrían ser inducidas durante el proceso, alterando el resultado final (Stewart y Levin, 1984).

Un proceso fiable para la producción de bacteriófagos a gran escala puede ser muy esquivo, ya que los datos obtenidos en un laboratorio no siempre son útiles para escalar los procesos biológicos (Kwok, 2010). Los investigadores han tratado de llenar este vacío principalmente mediante estudios sobre la producción de bacteriófagos basados en simulaciones por ordenador, algunos de ellos validados experimentalmente. Aquí, analizaremos primero los estudios teóricos centrados en modelos de producción de fagos y luego los estudios seleccionados que han sido validados experimentalmente. Todos los casos coinciden con los criterios de ensayo para la posterior purificación y validación de un producto basado en bacteriófagos, y algunos de ellos se incluyen en ambos apartados (Santos et al., 2014; Nabergoj et al., 2018a).

Modelos teóricos para la producción de bacteriófagos

Para describir un proceso de producción de fagos mediante un modelo matemático es importante definir los parámetros cinéticos a incluir en el modelo. Los tres parámetros básicos para la producción de fagos son las poblaciones de bacterias susceptibles no infectadas, las bacterias infectadas por fagos y los fagos libres (Krysiak-Baltyn et al., 2016). A partir de esto, diferentes modelos han incluido variables adicionales como bacterias resistentes no infectadas (Santos et al., 2014; Chaudhry et al., 2018) o múltiples especies bacterianas (Levin et al., 1977). Todas estas poblaciones interactúan controladas por parámetros cinéticos asociados al crecimiento bacteriano y a la infección por fagos. Se considera bien conocido qué constantes son importantes para las bacterias; sin embargo, esto aún está en discusión para los bacteriófagos. Hay consenso en que la constante de adsorción, el periodo de latencia y el tamaño del estallido son variables importantes a tener en cuenta; sin embargo, su relevancia en el modelo varía entre los distintos estudios. Además, los distintos autores utilizan una nomenclatura diferente para definir los parámetros cinéticos, lo que constituye una de las principales dificultades para establecer comparaciones entre los distintos modelos y para unificar el conocimiento general sobre este tema. Por ejemplo, la tasa de adsorción de los fagos (indicador de las partículas de fago adsorbidas a las bacterias) se denomina comúnmente con el símbolo «δ»; sin embargo, Beretta y Kuang (1998) utilizaron el símbolo «K», que puede ser también el símbolo de la constante de Monod de especificidad del sustrato «Ks». En la Tabla 1 se pueden encontrar otros ejemplos de nomenclatura diferente. Al igual que en otros procesos biológicos, se espera que los autores que trabajan en el campo de los modelos de crecimiento de fagos-bacterias se pongan de acuerdo en un vocabulario algebraico específico o incluyan una explicación clara de los términos y las unidades en sus artículos y una nomenclatura clara, como han afirmado recientemente Krysiak-Baltyn et al. (2018). Basándonos en la nomenclatura utilizada por otros autores (Tabla 1) proponemos el uso de caracteres griegos para nombrar los diferentes parámetros cinéticos en la reproducción de fagos. El tamaño del estallido puede simbolizarse por β, la tasa de adsorción por δ, el tiempo de eclipse por ε y la tasa de decaimiento del fago por λ. Las únicas excepciones serían la concentración del fago, que se conoce comúnmente como «P», y el tiempo de latencia, conocido como «L». La uniformidad en este lenguaje matemático facilitará la comprensión y la extracción de datos para futuros revisores académicos o industriales.

A partir de Campbell (1961), se han realizado muchos esfuerzos para describir modelos de producción de bacteriófagos, describiendo el comportamiento de la población de fagos bajo diversas condiciones y métodos. La Tabla 1 resume diferentes modelos de producción de fagos, dados como ecuaciones diferenciales o integrales (dependiendo de la decisión de cada autor), mencionando consideraciones específicas para cada modelo.

Los modelos de producción de fagos son generalmente consistentes en la descripción del cambio de la población de fagos en el tiempo. Esto puede representarse como un cambio cinético en las partículas de fago o en las unidades formadoras de placas (UFP) por unidad de tiempo, en las concentraciones finales obtenidas tras un proceso por lotes o durante un periodo de tiempo en un proceso continuo. A pesar del consenso general, estos modelos difieren en varias afirmaciones. Los modelos propuestos por Campbell (1961) y Beretta y Kuang (1998) son coherentes a la hora de equilibrar las partículas de fago con los términos de generación (liberación de partículas de bacteriófago por unidad de tiempo) y la pérdida de bacteriófago libre debido a las tasas de adsorción o decaimiento; estos modelos son útiles debido a su simplicidad y al uso de parámetros de crecimiento de fago estándar como la tasa de adsorción, el tamaño del estallido y el tiempo de latencia, y son una forma rápida de simular los procesos de producción por lotes, pero no podrían ajustarse a procesos como las poblaciones de bacterias resistentes o la evolución de los fagos en el tiempo. Estos modelos también tienden a subestimar la influencia de parámetros como el tamaño del estallido y el periodo de latencia, mientras que modelos más recientes han mostrado la importancia de estos parámetros y cómo pueden variar en función de otros factores (Santos et al., 2014; Nabergoj et al., 2018b).

Un interesante modelo propuesto recientemente por Santos et al. (2014) considera la influencia de la tasa de crecimiento bacteriano en la constante de adsorción del fago y una ecuación de distribución normal que rige los valores del periodo de latencia, teniendo en cuenta la variabilidad de estos parámetros. Este modelo ha demostrado ser muy útil porque ofrece la oportunidad de evaluar la influencia del sustrato en la producción de fagos, e incluir la tasa de crecimiento bacteriano en el modelo ofrece una herramienta indirecta para considerar el estado fisiológico de las bacterias durante el proceso. La dependencia de los parámetros de infección de los bacteriófagos de la tasa de crecimiento bacteriano también fue explorada posteriormente por otros autores (Krysiak-Baltyn et al., 2018; Nabergoj et al, 2018b); Nabergoj y sus colegas encontraron que el tamaño del estallido aumentaba linealmente con la tasa de crecimiento bacteriano, mientras que la constante de adsorción y el período latente disminuían.

Otros modelos han explorado la influencia de múltiples especies bacterianas, y la aparición de resistencia bacteriana (Levin et al., 1977; Santos et al., 2014; Chaudhry et al., 2018). Aunque el objetivo de estos estudios no siempre fue desarrollar métodos para la producción de fagos, son útiles para describir situaciones potenciales que pueden ocurrir durante el proceso. Estos modelos incluyen variables asociadas a la selección de la resistencia bacteriana y a las tasas de reversión en función de la población bacteriana (disponibilidad de bacterias menos o más susceptibles a lo largo del tiempo), definiendo las condiciones en las que pueden coexistir bacterias susceptibles y resistentes, como una fuerte desventaja selectiva en las bacterias resistentes (por ejemplo, menor tasa de crecimiento), y/o la existencia de un refugio espacial (o refugio de densidad) en el que (por debajo del cual) el fago no es capaz de infectar a las bacterias. Chaudhry et al. (2018) ofrecieron una explicación interesante de cómo los fagos pueden persistir en poblaciones dominadas por bacterias resistentes, sugiriendo que estas últimas podrían producir bacterias susceptibles en frecuencias que permitirían la replicación del fago. Curiosamente, este fenómeno ya se había sugerido anteriormente (Bastías et al., 2010). La generación de cepas resistentes a los fagos en los sistemas de producción de fagos podría ser una causa de preocupación y, por lo tanto, debería incluirse en el desarrollo de nuevos métodos, para minimizar esta posibilidad. Varios autores han sugerido que este problema puede evitarse con la configuración de producción de fagos, que se analizará en la siguiente sección.

Otro estudio interesante es el de Krysiak-Baltyn et al. (2018), que también incorpora parámetros de infección variables en función de la tasa de crecimiento bacteriano, y estima el coste operativo y la productividad en un sistema de proceso simulado de dos etapas. Una de las conclusiones importantes de este estudio teórico es que la concentración óptima de sustrato para el crecimiento bacteriano no debe ser necesariamente la misma para la producción de bacteriófagos, y según su análisis el coste por mL de fagos a una concentración de 4 × 1010 fagos/mL podría ser tan bajo como 1,78 × 10-2 dólares. Sería interesante disponer de una validación experimental de esta estimación, y determinar cómo se adapta a diferentes economías o países.

Por último, la evolución de los bacteriófagos debe considerarse también en un proceso de producción, ya que los fagos podrían aumentar o disminuir su eficiencia para infectar bacterias con el tiempo (Lenski y Levin, 1985). Este concepto podría representarse como tasas de infección en experimentos de rango de huéspedes, en los que incluso se pueden conseguir métodos de expansión de rango de huéspedes para aplicaciones de terapia con fagos (Mapes et al., 2016). Esta situación se ha simulado en cultivos por lotes, mostrando que la aparición de mutantes fágicos depende en gran medida de la flexibilidad genética de los fagos (tasas de mutaciones) (Levin y Bull, 2004). La capacidad de predecir la evolución de los fagos durante la producción sería útil para establecer un proceso de producción que minimice la probabilidad de alterar las propiedades líticas de los fagos. Los artículos revisados muestran que los modelos de producción de bacteriófagos son un enfoque importante que puede ayudar a encontrar las mejores estrategias, sin embargo, necesitan ser validados experimentalmente.

Experiencias experimentales en la producción de bacteriófagos

Hay varios estudios prácticos que implican la producción de fagos. Algunos se centran en la producción de fagos en biorreactores, mientras que otros se centran en la evaluación y optimización del proceso. Como era de esperar, estas experiencias también consideran una etapa de crecimiento bacteriano e infección/propagación de fagos en matraces y biorreactores (Tabla 2). Estos datos son útiles para dar una idea de cómo se pueden utilizar ciertos modelos de huésped-bacteriófago para la propagación y el aumento de los niveles de producción de fagos. Los sistemas huésped-fago más utilizados son las cepas de E. coli y sus fagos, probablemente debido a la cantidad de información relativa a estos sistemas bacteria-fago (fagos de E. coli T3, T4 y T7) y a la falta de información sobre otros sistemas bacteria-fago.

Según un caso reportado, los títulos obtenidos pueden ser tan altos como 1,2 × 1016 PFU mL-1 en un biorreactor por lotes (5 L) (Sochocka et al., 2015). Este nivel de producción coincide con la producción necesaria para fines terapéuticos (>1 1010 PFU mL-1), teniendo en cuenta los pasos de purificación, la tasa de decaimiento de los fagos y la estabilidad o vida útil (Naghizadeh et al., 2018). Otros autores también han informado de niveles prometedores de producción de 5 × 1012 PFU mL-1 en 1,2 L (Warner et al., 2014), y de 2,4 × 1013 PFU día-1 en 1 L (Nabergoj et al., 2018a; Tabla 2).

Es difícil establecer comparaciones sobre qué método podría ser más eficiente, ya que utilizan diferentes procedimientos de cultivo y diferentes sistemas huésped-bacteriófago. El cultivo por lotes es la forma más barata (no la más sencilla) de producir bacteriófagos, pero está muy limitado por el volumen máximo del equipo disponible, los tiempos totales de operación y la disponibilidad de sustrato (las concentraciones más altas pueden ser inhibidoras del crecimiento bacteriano). El cultivo continuo tiene una mayor escalabilidad cuando se optimiza la tasa de dilución bacteriana mediante la modificación del flujo de entrada y salida. Además, la regulación de la tasa de dilución permitirá un control directo sobre la tasa de crecimiento bacteriano, que tiene una influencia directa en los parámetros de infección como el tamaño del estallido, la constante de adsorción y el período latente (Mancuso et al., 2018; Nabergoj et al., 2018b). La tasa de dilución también puede utilizarse para aumentar la productividad del sistema, como demostraron Nabergoj et al. (2018a), donde se alcanzó una productividad máxima de fagos de 109 mL-1 h-1 con una tasa de dilución baja de 2 h-1 en un sistema cellstat de 1 L. Un sistema de funcionamiento continuo puede estar permanentemente operativo, por lo que es la forma más conveniente de producir un producto biotecnológico para una empresa. Sin embargo, son difíciles y caros de implementar, ya que requieren una monitorización constante para mantener el estado estacionario. Un proceso totalmente continuo para el crecimiento bacteriano y la producción de bacteriófagos podría aumentar la probabilidad de aparición de resistencia a los bacteriófagos si no se adoptan contramedidas específicas (Middelboe et al., 2001).

Algunos autores han sugerido la implementación de procesos de dos etapas, una exclusivamente para la producción de bacterias y una segunda para la propagación de fagos (Schwienhorst et al., 1996; Sauvageau y Cooper, 2010; Nabergoj et al., 2018a). Esto puede lograrse con un sistema cellstat, en el que dos biorreactores están conectados en serie con un flujo constante a través del sistema. En este caso, la tasa de flujo entre los reactores y el volumen en cada reactor (y la tasa de dilución y la tasa de crecimiento bacteriano por adición) pueden controlarse para alcanzar la máxima productividad (Nabergoj et al., 2018a). Otra configuración interesante propuesta por Sauvageau y Cooper (2010) consiste en un sistema semicontinuo de un proceso autociclado de dos etapas. En este caso, cada etapa funciona de forma similar a un cultivo por lotes, en el que las bacterias se cultivan primero por separado del fago y luego se introducen en la etapa de propagación del fago cuando se alcanza una concentración adecuada, lo que permite iniciar el proceso de infección utilizando una multiplicidad de infección deseada (Kasman et al., 2002). Esta configuración también tiene la ventaja de no requerir una monitorización permanente para mantener el estado estacionario de los sistemas continuos, y se ha utilizado para obtener una productividad de 7,59 × 1014 PFU mol CO2-1 (Sauvageau y Cooper, 2010). Ambos ejemplos, el sistema cellstat y el proceso de autociclado en dos etapas, tienen la gran ventaja de que las bacterias se cultivan en ausencia de fagos, por lo que no se favorece la resistencia de los bacteriófagos durante el proceso.

Por último, es importante señalar que hay algunos parámetros que no siempre se reportan en los estudios sobre producción de bacteriófagos. Por ejemplo, parámetros como la proporción de aireación o la entrada de aire en el biorreactor sólo se mencionan en dos informes (Sauvageau y Cooper, 2010; Santos et al., 2014), a pesar de que éste es uno de los parámetros más importantes en la producción de bacterias a nivel industrial. La información sobre otros parámetros como la transferencia de energía, la utilización de diferentes sustratos, el diseño del biorreactor, la agitación, las hélices y los materiales de construcción en la producción de bacteriófagos es escasa o inexistente.

Conclusión final

El redescubrimiento del uso potencial de los fagos en un amplio espectro de aplicaciones es muy emocionante y prometedor. Las pruebas sugieren que deben preferirse sistemas para la producción de bacteriófagos que reduzcan la probabilidad de que se produzca una resistencia a los mismos, como un cellstat o un proceso de autociclaje en dos etapas. Estas opciones también permitirían controlar las variables para aumentar la productividad del proceso. No obstante, los modelos de producción de bacteriófagos están lejos de estar establecidos y pueden mejorarse de varias maneras. Todavía hay muchos retos que superar. Se necesitan más estudios sobre la producción optimizada de bacteriófagos a gran escala, los costes de las infraestructuras y los equipos, las diferentes cuestiones de seguridad y las dosis de aplicación, y la experiencia sugiere que estos retos deben afrontarse con los esfuerzos de colaboración de los socios académicos e industriales.

Por último, es importante señalar que la mayoría de los modelos para la producción de bacteriófagos pueden aplicarse dentro de un rango específico de valores para los parámetros de la infección de los fagos y el crecimiento bacteriano. Por lo tanto, independientemente de los importantes avances en los modelos y configuraciones de producción de fagos, el conocimiento profundo del sistema específico de fagos-bacterias será siempre el primer requisito para establecer un sistema de producción de fagos eficiente.

Contribuciones de los autores

RG, SL y RB concibieron el trabajo y redactaron el manuscrito. KG, GH, y JR escribió las secciones del manuscrito. Todos los autores contribuyeron a la revisión bibliográfica, revisión del manuscrito, leyeron y aprobaron la versión presentada.

Financiamiento

Este trabajo fue financiado por el CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133 y Postdoctorado PUCV 2018.

Declaración de conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un potencial conflicto de intereses.

Agradecimientos

RG agradece a CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133. SL agradece Postdoctorado PUCV 2018.