El uso potencial de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) en aplicaciones de medicina regenerativa personalizada puede ser aumentado por transgénicos, incluyendo la expresión de etiquetas celulares constitutivas, reporteros de diferenciación o moduladores de fenotipos de enfermedades. Así pues, existe un precedente de expresión reproducible de transgenes entre subclones de iPSC con antecedentes genéticos isogénicos o diversos. Al utilizar vectores de virus o transposones, los sitios de integración de los transgenes y el número de copias son difíciles de controlar y casi imposibles de reproducir en múltiples líneas celulares. Además, los transgenes integrados al azar suelen estar sujetos a efectos pleiotrópicos de posición como consecuencia de los cambios epigenéticos inherentes a la diferenciación, lo que socava las aplicaciones en las iPSC. Para solucionar esto, hemos adaptado las populares tecnologías de nucleasas TALEN y CRISPR/Cas9 para introducir transgenes en loci predefinidos y superar los efectos de posición aleatorios. AAVS1 es un locus ejemplar dentro del gen PPP1R12C que permite la expresión robusta de transgenes impulsados por el promotor CAG. La orientación del gen controla el número de copias del transgén, de modo que los patrones de expresión del reportero son reproducibles y escalables en ∼2 veces. Además, la expresión génica se mantiene durante el cultivo de iPSC humanas a largo plazo y la diferenciación in vitro a lo largo de múltiples linajes. Aquí describimos nuestro protocolo de orientación AAVS1 utilizando vectores donantes estandarizados y métodos de construcción, además de proporcionar consideraciones prácticas para el cultivo de iPSC, la selección de fármacos y el genotipado.