La 5-hidroximetilcitosina y sus posibles funciones en el desarrollo y el cáncer

El doble papel de la 5-hidroximetilcitosina como base estable del ADN y como intermediario en la desmetilación del ADN

Ahora sabemos que los niveles de 5hmC varían sustancialmente entre los diferentes tipos de células y tejidos y que son más altos en el cerebro, en particular en las neuronas . Dado que la 5hmC es un producto de oxidación de la 5mC, está claro que la formación de 5hmC a partir de la 5mC reduce automáticamente los niveles de 5mC en cualquier posición nucleotídica determinada o incluso en todo el genoma. Por lo tanto, fue inmediatamente evidente que la conversión de 5mC en 5hmC podría ser el primer paso en una vía que conduce a la desmetilación del ADN. Hay pruebas de varios sistemas experimentales que indican que este puede ser el caso. El resultado final de esta vía de desmetilación es la eliminación pasiva o activa de la base modificada y/o la desaparición del grupo metilo de la citosina en el ADN (Figura 1). En la vía de desmetilación pasiva, la 5hmC no puede ser copiada por la metiltransferasa de mantenimiento del ADN, DNMT1, una enzima que propaga los patrones de metilación preexistentes y opera en los sitios CpG hemimetilados . El proceso de desmetilación activa que utiliza la 5hmC como intermediario es considerablemente más complicado. Un informe sugiere que la 5hmC puede ser convertida en citosina por las metiltransferasas del ADN . La desaminación de la 5hmC produce 5-hidroximetiluracilo , que puede ser eliminado por enzimas de reparación de escisión de bases, incluyendo la timina ADN glicosilasa (TDG) y la uracilo ADN glicosilasa monofuncional selectiva de una sola hebra (SMUG1) . Sin embargo, actualmente se desconoce la eficacia de esta vía in vivo. La oxidación escalonada del 5hmC por las proteínas TET produce 5-formilcitosina (5fC) y luego 5-carboxilcitosina (5caC). Esta 5caC, que es detectable a bajos niveles en el ADN, puede ser eliminada por reparación de escisión de bases catalizada por la actividad de la ADN glicosilasa de la proteína TDG , o por descarboxilación. En teoría, la vía de descarboxilación debería ser favorable, ya que no requiere la ruptura de los enlaces fosfodiéster del ADN, que se produce durante la reparación por escisión de bases iniciada por la TDG. Sin embargo, hasta la fecha, no se ha identificado ninguna actividad enzimática para el paso de descarboxilación, aunque la descarboxilación parece ocurrir .

Muchos tejidos acumulan niveles bastante importantes de 5hmC, mucho mayores de lo que cabría esperar si esta base fuera simplemente un intermedio transitorio en una vía de oxidación secuencial que conduce a la desmetilación del ADN. Por lo tanto, la 5hmC puede ser un módulo epigenético que tiene sus propias propiedades de codificación bioquímica. Esta función puede ser negativa o repulsiva, ya que la oxidación del grupo metilo durante la producción de 5hmC bloqueará la unión de proteínas que de otro modo interactuarían con la 5mC . Alternativamente, su función puede ser positiva o instructiva si existen proteínas que se unen específicamente a la 5hmC. Hasta ahora, varias proteínas diferentes han mostrado capacidad para reconocer la 5hmC, al menos in vitro, incluyendo UHRF1 , MBD3 , MeCP2 , y varias otras identificadas por un enfoque proteómico . Sin embargo, el papel biológico de su unión a la 5hmC aún no está del todo claro. La mayoría de estas proteínas también tienen otras funciones y, por lo tanto, puede que no estén diseñadas exclusivamente para interactuar con la 5hmC.

El papel de la 5-hidroximetilcitosina en el desarrollo y la diferenciación de los mamíferos

El papel funcional de la 5hmC en los genomas de los mamíferos aún no está claro. Al principio del ciclo vital de los mamíferos, tras la fecundación de los ovocitos por los espermatozoides, la mayor parte de la 5mC del genoma paterno (derivado del esperma) se oxida para formar 5hmC . Este paso de oxidación, que anteriormente se pensaba que reflejaba una verdadera «desmetilación» del ADN, es específico del genoma paterno, mientras que el genoma materno (derivado del ovocito) permanece protegido de la oxidación catalizada por Tet. La oxidación del genoma paterno es catalizada por Tet3, codificado por el único gen Tet que se expresa a niveles sustanciales en ovocitos y cigotos. La eliminación genética de Tet3 en ratones provoca un fallo en la oxidación del genoma paterno, un desarrollo comprometido y una letalidad perinatal.

Otra importante transición en el desarrollo implica la desmetilación global del ADN en las células germinales primordiales (PGCs) que comienza alrededor del día embrionario 8,5 a 9,5 y se completa cerca del día embrionario 13,5. Los mecanismos de borrado de la metilación en las PGC siguen siendo poco claros y controvertidos. Durante mucho tiempo se ha asumido que la desmetilación activa del ADN, independiente de la replicación, es una vía clave probablemente implicada en este paso. Sin embargo, datos más recientes favorecen una pérdida pasiva de metilación causada por la falta de mantenimiento de la metilación durante la replicación del ADN . Esta pérdida pasiva de 5mC puede ser iniciada efectivamente por la conversión de 5mC en 5hmC . Tet1 y Tet2 son las oxidasas de 5mC más expresadas en las PGCs en esta etapa . La progenie de los ratones deficientes en Tet1 y Tet2 tiene deficiencias en la desmetilación del ADN en los genes impresos. Sin embargo, los animales deficientes en Tet1/2 de ambos sexos eran fértiles, pero las hembras tenían ovarios más pequeños y una fertilidad reducida. La supresión de Tet1 y Tet2 puede producir adultos viables, aunque la mayoría de estos ratones mueren durante la embriogénesis o alrededor del nacimiento y muestran varios defectos de desarrollo . Los datos sugieren que la oxidación de 5mC inducida por Tet1/2 en las PGC no es absolutamente necesaria para producir una descendencia viable. La información actualmente disponible sobre la desmetilación del ADN en los cigotos y en las PGCs todavía carece de un análisis más específico de la 5hmC a nivel de la secuencia del ADN, como puede lograrse, por ejemplo, mediante la secuenciación TAB . Se espera que dicha información aclare la implicación global o específica del locus de la formación de 5hmC en el inicio de la desmetilación pasiva (o activa) del ADN. La anterior implicación de los procesos de reparación de escisión de bases en la reprogramación de la línea germinal, que por sí misma supondría un tremendo riesgo para el mantenimiento de la integridad del genoma si operara a nivel global, puede tener varias otras explicaciones. En un escenario, la aparición de la actividad de reparación de escisión de bases podría explicarse por la necesidad de contrarrestar las reacciones de oxidación espurias no dirigidas catalizadas por la actividad Tet oxidasa en las guaninas de los sitios CpG metilados (siendo la guanina la base del ADN más susceptible a la oxidación). En otro escenario, la 5hmC puede ser oxidada aún más, quizás en secuencias específicas, por las proteínas Tet para formar 5caC, que luego es eliminada por la reparación de escisión de bases iniciada por la TDG.

Debido a que la 5hmC es más abundante en el tejido cerebral, se ha convertido en una prioridad entender la función de esta base modificada en el cerebro. Por ejemplo, en el ADN de la corteza cerebral humana, el nivel de 5hmC es de aproximadamente el 1% de todas las citosinas o del 20 al 25% de todas las bases 5mC . Esto corresponde a aproximadamente 6.000.000 de bases 5hmC por genoma haploide. Claramente, estos niveles sugieren que la 5hmC tiene un importante papel funcional en el cerebro de los mamíferos. Los estudios reportados hasta ahora han demostrado que la 5hmC en los tejidos cerebrales es muy abundante dentro de las regiones de los genes, ya sea en los promotores o aún más en las regiones intragénicas, los llamados cuerpos de los genes . Es concebible que la formación de 5hmC en los promotores, islas CpG o costas de islas CpG (bordes) funcione de forma análoga a un proceso de reparación para oxidar y eventualmente eliminar los 5mCs introducidos de forma inapropiada en estas regiones . La deposición de 5hmC en los promotores o en los cuerpos de los genes a menudo se correlaciona positivamente con la actividad del gen. El mecanismo de cómo la 5hmC asociada al cuerpo del gen aumenta los niveles de transcripción es actualmente desconocido. Una posibilidad es que la oxidación de la 5mC libere un efecto represivo sobre la transcripción, tal vez al contrarrestar la transcripción anti-sentido intragénica espuria. Otras explicaciones pueden incluir el hecho de que 5hmC tiene un efecto desestabilizador sobre la estructura del ADN que potencialmente favorece la apertura de la doble hélice por el aparato de transcripción.

5hmC, aunque no es reconocido por varias proteínas de unión a metil-CpG, incluyendo MBD1, MBD2 y MBD4 , es capaz de unirse a MeCP2 , una proteína de unión a metil-CpG que es abundante en el cerebro y está mutada en el trastorno neurológico del síndrome de Rett . Estudios anteriores, en los que se utilizó el dominio de unión a metil-CpG (MBD) de MeCP2 en lugar de la proteína completa, no concluyeron que MeCP2 se uniera a 5hmC . Las razones de estas discrepancias no están claras. La conexión entre MeCP2 y 5hmC en el cerebro es de especial interés ya que los niveles de 5hmC son más altos en el cerebro y MeCP2 es una proteína abundante en el cerebro que alcanza niveles similares a los de la histona H1. Por estas razones, se puede anticipar un papel mecanístico de la unión de 5hmC por parte de MeCP2 en el cerebro en todo el genoma y no en una secuencia específica.

Como se ha demostrado recientemente, la formación de 5hmC es crítica para el desarrollo del cerebro. La base es abundante en las neuronas en desarrollo en las que su nivel aumenta en relación con las células progenitoras neurales y donde se localiza específicamente en los cuerpos génicos de los genes importantes para la diferenciación neuronal . Tet3 se expresa en mayor medida en la corteza cerebral del ratón en desarrollo, seguido de Tet2, y los niveles de Tet1 son muy bajos en este tejido. El aumento de los niveles de Tet2, Tet3 y 5hmC en las neuronas en diferenciación coincide con la reducción de la metiltransferasa de Polycomb H3K27 Ezh2 y la pérdida de H3K27me3 en genes críticos. La reducción de los niveles de Tet2 y Tet3 o el aumento de la expresión de Ezh2 da lugar a una diferenciación neuronal incompleta o bloqueada. Así, la formación de 5hmC promueve la diferenciación neuronal modulando la expresión de los genes más críticos en esta importante transición del desarrollo.

Pérdida de 5-hidroximetilcitosina en el cáncer

Los niveles de 5hmC en el cáncer están fuertemente reducidos en relación con el correspondiente tejido normal que rodea al tumor . Utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas, inmunotransferencia basada en anticuerpos anti-5hmC e inmunohistoquímica, demostramos la pérdida de 5hmC asociada al tumor para los cánceres de pulmón, cerebro, mama, hígado, riñón, próstata, intestino, útero y melanoma . Otros investigadores confirmaron esta observación al mostrar la pérdida de 5hmC en diferentes tipos de tumores sólidos . Además, se ha demostrado que la reintroducción de TET2 restablece los niveles de 5hmC y disminuye el potencial metastásico de las células de melanoma. Sorprendentemente, cuando co-inmunotinción de secciones de tejido con anticuerpos contra 5hmC y contra el antígeno Ki67, que es un marcador que se encuentra sólo en las células proliferantes, observamos que 5hmC y Ki67 casi nunca están presentes simultáneamente en una sola célula . A nivel de diagnóstico clínico, el análisis inmunohistoquímico combinado de la pérdida de 5hmC y la presencia de células Ki67-positivas podría convertirse en un biomarcador para el diagnóstico del cáncer. La ausencia o fuerte reducción de 5hmC en los tumores sugiere que las células proliferantes pierden 5hmC. En la mayoría de los casos, el grueso de la masa tumoral está desprovisto de 5hmC incluso cuando las células Ki67-positivas son escasas, lo que sugiere que estas células tumorales han tenido una historia pasada de proliferación que ha llevado a la pérdida de 5hmC, que luego no se restablece. La pérdida de 5hmC dependiente de la replicación refleja una situación que recuerda a la de los embriones de preimplantación, en la que la formación inicial de 5hmC en el ADN paterno va seguida de una pérdida o dilución de esta marca dependiente de la replicación . Del mismo modo, el contenido global de 5hmC disminuye rápidamente a medida que las células del tejido normal se adaptan al cultivo celular . La explicación más sencilla es que la oxidación de 5mC produce un sitio CpG hemihidroximetilado en el ADN que no es reconocido por DNMT1 durante la replicación del ADN. Esta explicación es consistente con los estudios in vitro que muestran que la DNMT1 es incapaz de operar en sitios CpG que contienen 5hmC . Sin embargo, también son posibles otras explicaciones para la reducción de 5hmC en el cáncer. Los niveles de las proteínas TET pueden ser más bajos en el tejido tumoral que en su homólogo del tejido normal. Aunque no observamos diferencias consistentes a nivel de ARN para TET1, TET2 o TET3 en los tumores de pulmón y cerebro en relación con el tejido normal, otros han informado de niveles más bajos de expresión del gen TET en el cáncer. Una posibilidad adicional es que las células cancerosas contengan vías metabólicas comprometidas que estén implicadas en la producción del cofactor para la actividad de la TET, el 2-oxoglutarato (véase más adelante).

Mutación de la TET2 en el cáncer humano

La TET1 pertenece a una familia de proteínas caracterizadas por promover la conversión de 5mC a 5hmC en el ADN de los mamíferos . Hay tres miembros identificados pertenecientes a la familia TET: TET1, TET2 y TET3. La TET1 se localiza en el cromosoma humano 10q21.3, mientras que la TET2 se encuentra en el cromosoma 4q24 y la TET3 en el cromosoma 2p13.1. La enzima TET1 consta de un dominio de unión al ADN de dedo de zinc CXXC, una región rica en cisteína y un dominio de dioxigenasa dependiente de 2-oxoglutarato y hierro (II) (2OGFeDO). TET3 también contiene un dominio CXXC N-terminal. Sin embargo, el gen TET2 sufrió una inversión génica cromosómica durante la evolución, separando así su dominio CXXC del dominio catalítico y creando un nuevo gen de dominio CXXC denominado IDAX/CXXC4, que codifica un regulador negativo de TET2 . Según los perfiles EST y las matrices de expresión, TET1 muestra su mayor expresión durante la embriogénesis y no muestra una expresión relevante en los tejidos adultos. TET2 se expresa sobre todo en las células hematopoyéticas y TET3 parece expresarse de forma ubicua en los tejidos humanos adultos.

La leucemia es una enfermedad en la que, durante la diferenciación normal de las células madre hematopoyéticas, la expansión clonal de las células precursoras hematopoyéticas en la médula ósea se ve afectada en una determinada fase de la diferenciación, provocando un desequilibrio entre la diferenciación y la autorrenovación. La expansión inadecuada de las células progenitoras hematopoyéticas está causada principalmente por un bloqueo de la maduración celular. Los trastornos del síndrome mielodisplásico (SMD) en la hematopoyesis se caracterizan por una citopenia (bajo recuento de células sanguíneas), una hematopoyesis ineficaz en uno u otro linaje celular y un mayor riesgo de transformación en leucemia mieloide aguda (LMA) . En la LMA, el rápido crecimiento de glóbulos blancos anormales en la médula ósea conduce a un bloqueo en la producción de diversas células de otros linajes celulares.

TET2 se ha encontrado mutado en pacientes con neoplasias mieloproliferativas (MPN), SMD, LMA y leucemia mielomonocítica crónica (LMMC), y es el gen más comúnmente mutado en los SMD . Las mutaciones de TET1 o TET3 no se observan en los SMD ni la mutación de TET2 se correlaciona con otras mutaciones comunes conocidas . Curiosamente, las mutaciones de la isocitrato deshidrogenasa 1/2 (IDH1/2) rara vez se encuentran junto con las mutaciones de TET2, pero tienen efectos similares a las mutaciones de TET2 en las células madre hematopoyéticas (HSC) . Mientras que las mutaciones de TET2 se asocian a una menor supervivencia global en la LMA en comparación con los pacientes con TET2 de tipo salvaje, las mutaciones de TET2 en pacientes con SMD y NMP promueven la progresión a la LMA . El gen TET2 consta de un total de once exones, que se traducen en un producto proteico de 2002 aminoácidos. Las mutaciones de TET2 en los cánceres mieloides se han observado con mayor frecuencia en los exones 3a y 10, que son los más largos. Tanto las células progenitoras multipotentes como las comprometidas en el linaje hematopoyético son el objetivo de las mutaciones de TET2 en los NMP, lo que implica que TET2 desempeña un papel importante en la mielopoyesis. Se observaron deleciones de TET2 y pérdida de heterocigosidad o disomía uniparental en (9%) pacientes de SMD/AML con TET2 mutado, donde es probable que el alelo de tipo salvaje se pierda durante la recombinación, permitiendo que el TET2 mutado promueva un fenotipo de pérdida de función. Kosmider et al. observaron que el 50% de los pacientes con TET2 mutado tenían defectos genéticos que afectaban a las dos copias de TET2. Las mutaciones en TET2 parecen conducir a la pérdida de función, lo que sugiere que puede desempeñar un papel supresor de tumores.

Entender las implicaciones subyacentes de la falta de función de TET2 mutante y su papel en las neoplasias mieloides es una prioridad de investigación actual. Varios laboratorios generaron modelos de ratones knockout condicionales de Tet2 en los que se apuntaron los exones críticos de Tet2. Moran-Crusio et al. observaron que los ratones Tet 2-/- desarrollaban esplenomegalia a las 20 semanas de edad, mostrando fenotipos similares a los observados en pacientes humanos con LMC con TET2 mutante. Los datos de los diferentes modelos de ratón condujeron a observaciones similares. La supresión de Tet2 no es letal desde el punto de vista embrionario. Una observación importante realizada por Moran-Crusio et al. y por Ko et al. es que las células madre hematopoyéticas de los ratones Tet2-/- tienen una mayor capacidad para repoblar el compartimento hematopoyético in vivo durante los ensayos de reconstitución competitiva con la competencia de las HSC de las células Tet2+/+. El análisis de varios órganos de ratones Tet2-/- mostró que la pérdida de Tet2 no se compensa con un aumento de la expresión de Tet1 o Tet3 . Los niveles de 5hmC están significativamente disminuidos en la médula ósea y el bazo de los ratones Tet2-/- . Los ratones Tet2-/- muestran un aumento de HSCs con un ligero aumento de progenitores mieloides, sesgando la hematopoyesis hacia destinos celulares de monocitos/macrófagos . Se sugiere que una Tet2 activa regularía la hematopoyesis normal para asegurar una distribución adecuada de los linajes y una diferenciación controlada de las HSC. Resulta especialmente interesante el efecto de las mutaciones de TET2 en los niveles y patrones de 5mC en el genoma. Sin embargo, los datos actuales no son nada claros. Mientras que un informe indicaba que la mutación de TET2 en la LMA está asociada a un fenotipo de hipermetilación del ADN , otros datos sugerían que las muestras de médula ósea de pacientes con mutaciones de TET2 tienen niveles bajos de 5hmC e hipometilación del ADN . La situación se complica por el hecho de que las neoplasias hematopoyéticas se caracterizan a menudo por mutaciones en varios modificadores epigenéticos, como EZH2, IDH1, IDH2, MLL, DNMT3A y ASXL1, lo que puede oscurecer cualquier asociación directa. Por ejemplo, en un estudio, ocho de once pacientes con mutaciones en DNMT3A (73%) en el linfoma de células T también tenían mutaciones en TET2.

Mutaciones en las vías del cofactor

Las oxidasas de 5mC son enzimas dependientes de 2-oxoglutarato (Figura 2). Este cofactor se produce en el ciclo del ácido tricarboxílico a partir del isocitrato por la enzima IDH. Curiosamente, varios tipos de tumores humanos contienen mutaciones en el gen IDH1. Las mutaciones en IDH1 son especialmente frecuentes en los gliomas de grado II y III, donde se encuentran hasta en el 70% de los pacientes. Las mutaciones en IDH1 e IDH2 también se observan en las leucemias mieloides y en algunos otros tumores malignos, pero con una frecuencia menor. Estas mutaciones en IDH1 no están dispersas por todo el gen, sino que se encuentran casi exclusivamente en la posición 132 del aminoácido. Este hallazgo sugiere que esta proteína mutante IDH1 en particular tiene una propiedad de ganancia de función. Un descubrimiento sorprendente fue que el mutante IDH1 del codón 132 de arginina a histidina produce el oncometabolito 2-hidroxiglutarato (2HG) como producto de reacción en lugar de 2-oxoglutarato . Parece que la reacción de oxidación del isocitrato llevada a cabo por este mutante es incompleta y sólo produce 2HG. Además, la 2HG es un inhibidor competitivo de muchas, si no todas, las actividades enzimáticas dependientes del 2-oxoglutarato. Las proteínas TET representan una clase de tales enzimas, y se demostró que la 2HG es un inhibidor de TET1 y TET2.

Un correlato interesante de tener IDH1 mutado en los tumores de glioma es que los tumores mutantes de IDH1 están casi siempre asociados con abundantes cambios en la metilación del ADN en todo el genoma, como indica la hipermetilación generalizada de las islas CpG . Este fenotipo se ha denominado fenotipo metilador de islas CpG (o CIMP) . Es tentador suponer que el CIMP en los gliomas con mutación IDH1 está relacionado con un fallo en la producción de 5hmC en estos tumores porque la actividad de la TET está comprometida por la 2HG. De hecho, la introducción experimental de un constructo mutante de IDH1 en astrocitos humanos condujo a la aparición de un fenotipo similar al CIMP. Además, en ratones knock-in condicionales en los que se insertó el mutante más común de Idh1 R132H en el locus endógeno de Idh1 y se expresó en células hematopoyéticas, se observó hipermetilación del ADN . Sin embargo, en una comparación directa de los niveles de 5hmC en el ADN entre los gliomas mutantes de IDH1 y los de tipo salvaje de IDH1, no observamos ninguna diferencia sustancial entre estas dos categorías de tumores cerebrales . Por lo tanto, hay que tener en cuenta que la IDH1 mutante y su producto metabólico 2HG no sólo afectan a las enzimas TET, sino que también inhiben muchas desmetilasas de lisina que dependen del 2-oxoglutarato y otras enzimas dependientes del mismo. La disfunción de estas desmetilasas de lisina puede tener un impacto secundario en los patrones de metilación del ADN en las islas CpG.