Supervivencia celular tras la irradiación
La investigación del crecimiento y la muerte celular inducida por la radiación, definido como el período de tiempo necesario para una pérdida completa de la capacidad de proliferación o la exaltación de la capacidad de proliferación, es uno de los métodos más utilizados y fiables para estudiar los efectos de la radiación en las células. Para los experimentos de irradiación, nuestro laboratorio comprobó que las lecturas de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) eran proporcionales al número de células in vitro, al menos en la fase de crecimiento exponencial (datos no mostrados). La irradiación de iones 12C6+ a alta energía suele provocar la muerte de la gran mayoría de las células. La fracción de muerte celular en la fase de retardo tras la irradiación y los cambios en el tiempo de duplicación pueden medirse mediante ensayos en varios puntos temporales tras la irradiación. Dado que nuestro ensayo no se limitó a determinar la supervivencia en un solo punto, también se pudo obtener fácilmente información sobre el rendimiento del crecimiento. La curva de supervivencia se dibujó en una escala logarítmica natural de la fracción de supervivencia frente a diferentes parámetros físicos.
C. tyrobutyricum 25755 células fueron irradiadas 20 h después de la siembra. Las cepas con la menor actividad metabólica y la proliferación más lenta o las células que dejaron de proliferar se excluyeron del ensayo mediante lavado y tripsinización cuando se realizó la siembra después de la irradiación. La fracción de supervivencia obtenida a partir de la ecuación (1) se comparó con un conjunto representativo de datos experimentales. La figura 1 muestra una comparación de las curvas de supervivencia tras la irradiación con iones 12C6+ a diferentes energías del haz para las distintas cepas de C. tyrobutyricum ATCC 25755. Los resultados del ensayo MTT se grafican contra la dosis de irradiación (10 a 50 Gy) a 68 AMeV de energía y niveles de 106 a 108 iones – pulso-1, que fueron e0 → e-4,5 para la Figura 1A, e0 → e-5,8 para la Figura 1B y e0 → 0 para la Figura 1C. La Figura 1D-F muestra los datos de supervivencia celular de los resultados del ensayo MTT frente a la dosis de irradiación (10 a 50 Gy) a 114 AMeV de energía y 106 a 108 de niveles de iones-pulso-1, que fueron e0 → 0. En general, se obtuvo un acuerdo suficiente entre los cálculos y los datos experimentales. Para las cepas tratadas a 68 AMeV, la ecuación subestimó la eficacia de la dosis, mientras que para las células irradiadas a altas energías (114 AMeV), el resultado fue sobreestimado. La desviación máxima, derivada de la relación entre las dosis calculadas y las medidas para un nivel de efecto determinado, fue del 15%. La fracción de supervivencia de las cepas dependía fuertemente de las características físicas particulares del haz de iones 12C6+, determinadas por los niveles de energía, dosis e iones – pulso-1 de las partículas consideradas (Figura 1). Obviamente, la fracción de supervivencia disminuyó con el aumento de la energía de los iones de carbono. Como era de esperar, el logaritmo de supervivencia de los ensayos mostró las mismas características: la supervivencia dependía de la energía, los iones-pulso-1 y la dosis de irradiación de iones 12C6+. El aumento de un parámetro físico a la vez condujo a una disminución de la tasa de supervivencia. Se obtuvo una supervivencia muy limitada (e-3,5 → e-6,5) cuando se irradió el ion 12C6+ utilizando 114 AMeV de energía, una dosis de 20 a 40 Gy y 106 a 108 iones-pulso-1.
El efecto de la irradiación con iones 12C6+ sobre la supervivencia de Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755. Las células fueron irradiadas 20 h después de la siembra y el grado de supervivencia se determinó mediante el ensayo MTT. Los datos de supervivencia se representan en función de los niveles de irradiación. (A-C) Los iones 12C6+ fueron acelerados hasta 68 AMeV, y sus iones/pulso oscilaron entre 106 y 108, a una tasa de dosis de 10 a 50 Gy. (D-F) Los iones 12C6+ se aceleraron hasta 114 AMeV, y sus iones/pulso oscilaron entre 106 y 108, con una tasa de dosis de 10 a 50 Gy. Las células con baja actividad metabólica y proliferación lenta o las células que dejaron de proliferar se excluyeron del ensayo mediante lavado y tripsinización cuando el chapado se realizó después de la irradiación.
Muchos tipos de células se caracterizan por una división celular regular cada 12 a 24 h. Debido a la potencia del crecimiento exponencial, una sola célula puede producir miles de células hijas en aproximadamente 9 a 12 ciclos de división normales, es decir, unos pocos días. Tras la irradiación, los supervivientes pueden estar compuestos por algunos mutantes. Un porcentaje muy pequeño de los supervivientes de C. tyrobutyricum ATCC 25755 puede mostrar una capacidad mejorada para producir butirato.
Los efectos del ácido butírico en el crecimiento celular tras la irradiación
C. tyrobutyricum ATCC 25755 utiliza glucosa o xilosa como fuente de carbono y energía. El monosacárido es transportado al interior de la célula a través de un sistema de captación de fosfoenolpiruvato dependiente de la fosfotransferasa. A continuación, la glucosa o la xilosa se metaboliza a través de la glucólisis, que muestra una dependencia insignificante del pH en el rango de pH 7 a pH 5,5. Sin embargo, las fermentaciones se detuvieron cuando la glucosa o la xilosa dejaron de ser consumidas por las células debido a la inhibición por el butirato. Para investigar más a fondo el efecto específico de la irradiación en los perfiles de crecimiento de las células (basados en mediciones de la densidad óptica (DO) de la suspensión celular a 600 nm), se llevaron a cabo cultivos individuales por lotes en un medio P2 químicamente definido (realizado en frascos de suero) que contenía 42 g-L-1 de glucosa y estaba suplementado con 3,6, 7,2 y 10,8 g-L-1 de ácido butírico. El pH del cultivo de C. tyrobutyricum ATCC 25755 (Figura 2A, control) descendió a alrededor de 4,8 (ΔpH de 1,4, desde pH 6,2) en comparación con cuando se suplementó con 3,6 g-L-1 de ácido butírico (Figura 2A1), 7.2 g-L-1 de ácido butírico (Figura 2A2) y 10,8 g-L-1 de ácido butírico (Figura 2A3), los valores de pH correspondientes fueron aproximadamente 6,0 (ΔpH de 0,5 a partir de 6,5), 6,1 (ΔpH de 0,3 a partir de 6,4) y 5,9 (ΔpH de 0,5 a partir de 6,4), respectivamente. Sin embargo, cuando el cultivo fue irradiado con 68 AMeV a una dosis de 40 Gy (Figura 2D, control), el pH cayó a alrededor de 4,8 (ΔpH de 1,7 partiendo de 6,5) mientras que a una dosis de 40 Gy (complementada con 3,6 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2D1), una dosis de 40 Gy (complementada con 7.2 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2D2) y una dosis de 40 Gy (complementada con 10,8 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2D3), los valores de pH fueron de aproximadamente 4,6 (ΔpH de 1,6 a partir de 6,2), 4,8 (ΔpH de 1,4 a partir de 6,2) y 5,9 (ΔpH de 0,3 a partir de 6,2), respectivamente. Cuando el cultivo fue irradiado a 114 AMeV y una dosis de 40 Gy (Figura 2G, control), el pH descendió a alrededor de 5,7 (ΔpH de 0,6 partiendo de 6,3) mientras que a una dosis de 40 Gy (complementada con 3,6 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2G1), una dosis de 40 Gy (complementada con 7.2 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2G2) y una dosis de 40 Gy (complementada con 10,8 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2G3), los valores de pH fueron de aproximadamente 5,7 (ΔpH de 0,6 a partir de 6,3), 5,4 (ΔpH de 0,9 a partir de 6,3) y 5,6 (ΔpH de 0,7 a partir de 6,3), respectivamente. Cuando el cultivo fue irradiado a 68 AMeV y a una dosis de 20 Gy (complementado con 7,2 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2B2), el pH descendió a alrededor de 4,4 (ΔpH de 0,9 partiendo de 6,3) mientras que a una dosis de 30 Gy (complementado con 7.2 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2C2) y a una dosis de 40 Gy (complementada con 7,2 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2D2), los valores de pH fueron de aproximadamente 4,6 (ΔpH de 1,7 partiendo de 6,3) y 4,8 (ΔpH de 1,5 partiendo de 6,3), respectivamente. Cuando el cultivo fue irradiado a 114 AMeV y a una dosis de 40 Gy (complementada con 10,8 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2E3), el pH disminuyó a 5,9 (ΔpH de 0,4 partiendo de 6,3) mientras que a una dosis de 30 Gy (complementada con 10,8 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2F3) y a una dosis de 40 Gy (complementada con 10,8 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2G3), los valores de pH fueron de aproximadamente 6.0 (ΔpH de 0,3 a partir de 6,3) y 5,8 (ΔpH de 0,5 a partir de 6,3), respectivamente.
Curso temporal de las actividades de las células de tipo salvaje y las irradiadas en función de las concentraciones de ácido butírico añadidas durante las primeras 54 h de fermentación. (A) Crecimiento celular de las cepas de tipo salvaje, no afectadas por la adición de butirato (cultivos de control). (B-D) Crecimiento celular de las cepas irradiadas (energía 68 AMeV y dosis de 20, 30 y 40 Gy), no afectado por la adición de butirato (cultivos de control). (E,F) Crecimiento celular de las cepas irradiadas (energía 114 AMeV y dosis de 20, 30 y 40 Gy), no afectado por la adición de butirato (cultivos de control). ( A1-A3) Los efectos de la adición de butirato en el crecimiento de las células de tipo salvaje. Los cultivos individuales por lotes se llevaron a cabo en un medio P2 químicamente definido (realizado en frascos de suero) que contenía glucosa (aproximadamente 42 g-L-1) y se complementó con 3,6 (A1), 7,2 (A2) y 10,8 g-L-1 (A3) de ácido butírico. (B1-B3, C1-C3, D1-D3) El efecto del butirato añadido sobre el crecimiento de las células irradiadas (energía 114 AMeV y dosis de 20, 30 y 40 Gy). Los cultivos individuales por lotes se llevaron a cabo en un medio P2 químicamente definido (realizado en frascos de suero) que contenía glucosa (aproximadamente 42 g-L-1) y se complementó con 3,6 (X1), 7,2 (X2) y 10,8 g-L-1 (X3) de ácido butírico. (E1-E3, F1-F3, G1-G3) Los efectos del butirato añadido sobre el crecimiento de las células irradiadas (energía 114 AMeV y dosis de 20, 30 y 40 Gy). Los cultivos individuales por lotes se llevaron a cabo en un medio P2 químicamente definido (realizado en frascos de suero) que contenía glucosa (aproximadamente 42 g-L-1) y se complementó con 3,6 (X1), 7,2 (X2) y 10,8 g-L-1 (X3) de ácido butírico.
Estas diferencias en el pH regulan el cambio temporal asociado a la formación de disolventes para cada cepa irradiada. Esto sugiere que las cepas de tipo salvaje y las irradiadas mostraron un patrón metabólico bifásico fuertemente influenciado por el pH del medio. Como tendencia general, las células consumieron inicialmente glucosa para apoyar el crecimiento y producir y excretar ácidos orgánicos (butirato y acetato) como metabolitos primarios (acidogénesis), lo que provocó una disminución del pH del medio cuando se acumularon hasta ciertos niveles. Este aumento de la acidez del caldo desplazó la formación de ácidos hacia la producción de disolventes cuando el cultivo alcanzó la fase estacionaria de crecimiento celular (solventogénesis). A un pH alto, se forman principalmente ácidos orgánicos, mientras que a un pH bajo se estimula la producción de disolventes. Como se esperaba, la naturaleza del cambio metabólico y el patrón cinético de la formación de disolventes dependían de la cepa, dado que las cepas irradiadas presentaban sus propias características genéticas y metabólicas intrínsecas. Se ha informado anteriormente de que el ácido butírico inhibe el crecimiento celular. Los resultados mostraron que en las cepas de tipo salvaje se produjo una inhibición gradual del crecimiento celular, no observándose un crecimiento realista a concentraciones de ácido butírico superiores a 3,6 g-L-1. Sin embargo, en las cepas irradiadas, no hubo una inhibición gradual del crecimiento celular, y no se observó un crecimiento realista para concentraciones de ácido butírico superiores a 10,8 g-L-1.
Para examinar con más detalle el efecto del butirato añadido, se compararon los perfiles de crecimiento celular (basados en mediciones de DO) para las cepas de tipo salvaje y las cepas irradiadas (Figura 2A1-G3) durante las primeras 54 h de fermentación. Es interesante observar que la tolerancia al ácido butírico de las cepas aumentó considerablemente cuando se incrementó la energía y la dosis de irradiación de iones 12C6+. Las vías metabólicas del metabolismo de la glucosa en C. tyrobutyricum ATCC 25755 se muestran en la Figura 3. El acetil-CoA, el acetoacetil-CoA y el butiril-CoA son tres intermediarios clave, y son de especial interés para la fermentación con respecto al potencial de formación de diferentes productos durante la acidogénesis o la solvogénesis. Estos intermediarios son importantes puntos de ramificación que dirigen el flujo metabólico hacia la formación de ácidos o de disolventes. Como último intermediario clave, el butiril-CoA inicia la formación de ácido butírico/butirato. El butirato es producido por las actividades secuenciales de la PTB, y la BK . Ambas enzimas son más activas durante la acidogénesis y sus actividades específicas disminuyen durante la solventogénesis, dos veces para la PTB y seis veces para la Buk . Por lo general, para inducir la solvogénesis se requiere una actividad fuertemente dependiente del pH, con un óptimo in vitro a niveles de pH acidogénico de 5,5 (óptimo alrededor de pH 4,7) y un pH in vivo (endógeno) superior a 5,5. Sin embargo, un análisis comparativo de estas parcelas reveló claramente un grupo principal compuesto por las cepas irradiadas a 68 AMeV y 40 Gy y las cepas irradiadas a 114 AMeV y dosis de 30 y 40 Gy. Los dos grupos mostraron una tolerancia general muy similar a las concentraciones crecientes de butirato en comparación con las bacterias de tipo salvaje.
Vías metabólicas del metabolismo de la glucosa en Clostridium tyrobutyricum . Las enzimas se indican con las siguientes letras: lactato deshidrogenasa; piruvato-ferredoxina oxidorreductasa; NADH-ferredoxina oxidorreductasa; NADPH-ferredoxina oxidorreductasa; hidrogenasa; fosfato acetiltransferasa (fosfotransacetilasa); acetato quinasa; acetaldehído deshidrogenasa; etanol deshidrogenasa; tiolasa (acetil-CoA acetiltransferasa); acetoacetil-CoA; acetato/butirato:CoA transferasa; acetoacetato decarboxilasa; 3-hidroxilbutiril-CoA deshidrogenasa; crotonasa; butiril-CoA deshidrogenasa; fosfato butiltransferasa (fosfobutirilasa); butirato quinasa.
Efecto de la irradiación de iones 12C6+ en la producción de ácido butírico
La producción de ácido butírico de las cepas irradiadas mejoró considerablemente tanto en términos de concentración de producto final como de rendimiento en comparación con la cepa de tipo salvaje, como se muestra en la Figura 4B,E. El cultivo de C. tyrobutyricum no irradiado (cepa de tipo salvaje, control) inoculado en un medio con un mínimo de glucosa empezó a consumir azúcar casi inmediatamente, y la producción de ácido butírico comenzó entre 12 y 18 horas después (Figura 4A,B). El mismo cultivo de control inoculado en un medio de crecimiento clostridial (CGM) que contenía 60 g-L-1 de glucosa necesitó más de 96 horas para aclimatarse, a pesar de que las fermentaciones de las cepas irradiadas y de las cepas de tipo salvaje se probaron en las mismas condiciones. El prolongado periodo de metabolismo y productividad mínimos se debe a que la radiación (diferentes parámetros) provocó un retraso en la fase logarítmica del crecimiento celular (Figura 4C,F). La tolerancia al ácido butírico de las cepas irradiadas se incrementó en gran medida, lo que les permitió producir más ácido butírico, resultando en la utilización completa de la glucosa y la producción de más de 32 g-L-1 de ácido butírico y niveles similares de biomasa celular. Además, la relación ácido butírico/control aumentó de 1,0 para la cepa de tipo salvaje a 1.52 para las cepas irradiadas a 114 AMeV y 40 Gy, 1,37 para las cepas irradiadas a 114 AMeV y 30 Gy, 1,41 para las cepas irradiadas a 68 AMeV y 40 Gy, y 1,31 para las cepas irradiadas a 68 AMeV y 30 Gy. Esta tendencia indica que el flujo de carbono y energía se redistribuyó en las vías metabólicas de las cepas irradiadas, lo que también dio lugar a cambios significativos en la producción de varios productos de fermentación. Cabe destacar que la producción de ácido acético (datos no mostrados) se niveló mucho antes que la de butirato/butírico durante la fermentación. Las fermentaciones se detuvieron cuando la glucosa dejó de ser consumida por las células debido a la acumulación de ácidos orgánicos y productos de desecho en el caldo, lo que provocó la inhibición del crecimiento celular y otras actividades. Sin embargo, las cepas irradiadas eran más tolerantes al ácido butírico, como indica la concentración final de butirato mucho más alta alcanzada en las fermentaciones con estas cepas irradiadas en comparación con las de tipo salvaje. Esto no es del todo sorprendente; como se muestra en la Figura 3, la mayor tolerancia al ácido butírico de las cepas irradiadas también puede atribuirse a la reducción del flujo a través de la vía PTA/AK del butirato. Dado que las cepas irradiadas ya no dependían de la vía PTA/AK para la producción de energía y la supervivencia, se volvieron menos sensibles a la inhibición del ácido butírico .
Comparación de la producción de ácido y peso seco de biomasa de C. tyrobutyricum de tipo salvaje e irradiado cultivado en glucosa (con 60 g-L-1) en medio de crecimiento clostridial a 37°C a pH 5,5 y 6,0. (A-C) Impacto de la irradiación de iones 12C6+ (energía 68 AMeV y dosis de 20, 30 y 40 Gy) en la concentración de glucosa, la producción de ácido butírico y el peso seco de la biomasa. (D-F) Impacto de la irradiación de iones 12C6+ (energía 114 AMeV y dosis de 20, 30 y 40 Gy) en la concentración de glucosa, la producción de ácido butírico y el peso seco de la biomasa. (G) SDS-PAGE de las proteínas celulares de C. tyrobutyricum. Carril WT: tipo salvaje; carril 1: células irradiadas a 68 AMeV y una dosis de 30 Gy; carril 2: células irradiadas a 68 AMeV y una dosis de 40 Gy; carril 3: células irradiadas a 114 AMeV y una dosis de 30 Gy; carril 4: tipo salvaje y células irradiadas a 114 AMeV y una dosis de 40 Gy; carril MW: marcadores de peso molecular de proteínas.
La inducción de los genes ack y pta, que codifican enzimas asociadas a la vía de formación del acetato, mejora significativamente la producción de ácido butírico . Para comprender mejor la cinética de fermentación del metabolismo de la glucosa tras la exposición de C. tyrobutyricum a la irradiación de iones 12C6+ y el daño resultante en los genes ack y pta, se estudió y comparó la expresión proteica de las cepas de tipo salvaje y de las irradiadas. La figura 4G muestra los resultados de SDS-PAGE. El análisis confirmó la expresión de la proteína (peso molecular, aproximadamente 85 kDa) en cuatro cepas irradiadas, con el mayor nivel de expresión proteica en el carril 4. La cantidad de una proteína de aproximadamente 106 kDa fue mucho mayor para la cepa irradiada a 114 AMeV y 40 Gy que la cepa de tipo salvaje. Se han caracterizado AK y PTA de varios microorganismos, pero los resultados mostraron grandes variaciones en su peso molecular . Por lo tanto, se llevaron a cabo ensayos de actividad enzimática para estudiar más a fondo las funciones de AK, PTA y PTB en las vías de formación de ácido (Figura 3). La selectividad metabólica en C. tyrobutyricum está influida por la fase de crecimiento, ya que los cultivos de crecimiento exponencial producen tanto ácido butírico como acético, mientras que los de crecimiento estacionario más lento tienden a producir ácido butírico. Por ello, durante el crecimiento en fase logarítmica de cada lote, se extrajeron muestras de cultivo y se analizaron las actividades de PTA, PTB y AK en las cepas irradiadas y de tipo salvaje. Se analizaron las actividades enzimáticas específicas de PTA, PTB y AK en las cepas irradiadas (diferentes parámetros físicos) y se compararon sus actividades relativas con las de la cepa de tipo salvaje. La actividad de AK se redujo aproximadamente en un 47% para las cepas irradiadas a 114 AMeV y 40 Gy, en un 31% para las cepas irradiadas a 114 AMeV y 30 Gy y en un 26% para las cepas irradiadas a 68 AMeV y 40 Gy. En comparación con las cepas de tipo salvaje, las cepas irradiadas a 114 AMeV y 40 Gy tenían una actividad AK menor (47%) pero una actividad PTA inesperadamente mayor (129%), aunque actividades PTB similares. Dado que las cepas irradiadas a 114 AMeV tenían una actividad AK mucho menor, la vía PTA-AK se habría visto perjudicada y, por tanto, produjeron más butirato (60 g-L-1) a partir de glucosa que las cepas de tipo salvaje. Como se ha mencionado anteriormente, estas mejoras y perfeccionamientos pueden atribuirse a una mayor tolerancia a la inhibición del butirato y, en cierta medida, a la reducción del flujo de carbono a través de la vía PTA-AK, como demuestra el aumento de la relación butirato/acetato en las cepas irradiadas.
Efecto de la irradiación con 12C6+ sobre el rendimiento de ácido y el crecimiento de C. tyrobutyricum
Se realizó un experimento en modo de fermentación utilizando glucosa como fuente primaria de carbono para determinar la capacidad de producción de butirato de C. tyrobutyricum ATCC 25755 tras la irradiación. Como puede verse en la Figura 5A,B, el rendimiento de ácido butírico a partir de glucosa aumentó significativamente, de 0,43 g-g-1 para las cepas de tipo salvaje a 0,56 g-g-1 para la cepa irradiada a 68 AMeV y una dosis de 30 Gy, 0.59 g-g-1 para la cepa irradiada a 68 AMeV y una dosis de 40 Gy, 0,63 g-g-1 para la cepa irradiada a 114 AMeV y una dosis de 30 Gy, y 0,66 g-g-1 para la cepa irradiada a 114 AMeV y una dosis de 40 Gy. Cabe destacar que el rendimiento de butirato para la cepa irradiada a 114 AMeV y una dosis de 40 Gy habría sido mayor (>0,66 g-g-1) si se despreciara el consumo de glucosa durante la fase de retardo. El ácido acético producido por la cepa irradiada a 68 AMeV y dosis de 30 y 40 Gy fue similar al del tipo salvaje. Sin embargo, el ácido acético producido por la cepa irradiada a 114 AMeV y dosis de 30 y 40 Gy disminuyó en comparación con el del tipo salvaje. Como se muestra en la Figura 5B, el rendimiento de ácido acético a partir de glucosa también disminuyó significativamente, de aproximadamente 0,11 g-g-1 para la cepa de tipo salvaje a alrededor de 0,08 g-g-1 para la cepa irradiada a 114 AMeV y 30 Gy, y alrededor de 0,07 g-g-1 para la cepa irradiada a 114 AMeV y 40 Gy. Sin embargo, la relación butirato/acetato (g/g) aumentó de 3,99 para la cepa de tipo salvaje a 5,82 para las cepas irradiadas, una clara indicación de que las vías metabólicas en las cepas irradiadas se desplazaron para favorecer la producción de ácido butírico sobre la de ácido acético. Como se muestra en la Figura 3, dado que las actividades de AK y PTA se redujeron significativamente en las cepas irradiadas, se debió catabolizar más piruvato a través de la vía productora de butirato, lo que condujo a un mayor rendimiento de butirato a partir de la glucosa. Además, el ácido butírico también podría haber promovido un cambio más temprano a la vía productora de ácido, lo que podría reflejarse en una tasa de crecimiento más lenta. Por la misma razón, las muestras irradiadas sufrieron una tasa de crecimiento más lenta porque se produjo menos ATP a partir de la vía productora de acetato (PTA-AK), que normalmente puede generar más ATP por mol de glucosa metabolizada que la vía productora de butirato (PTB-BK) .
Comparación de la producción de ácido para las células de C. tyrobutyricum de tipo salvaje y las irradiadas. (A) La producción de ácido butírico y ácido acético se estimó a partir de las pendientes de los gráficos lineales para las células de tipo salvaje y las células irradiadas a 68 AMeV y dosis de 30 y 40 Gy. (B) La producción de ácido butírico y ácido acético se estimó a partir de las pendientes de los gráficos lineales para las células de tipo salvaje y las células irradiadas a 114 AMeV y dosis de 30 y 40 Gy. (C) Linealización (integración) de los perfiles de crecimiento cinético del peso seco de la biomasa en el tiempo utilizando una transformación de logaritmo natural. Las tasas máximas de crecimiento específico para las células de tipo salvaje y las irradiadas se calcularon según el ejemplo dado para las células irradiadas a 114 AMeV y una dosis de 40 Gy cultivadas en un medio de crecimiento de Clostridium que contenía 60 g-L-1 de glucosa. BDW, peso seco de la biomasa.
A continuación se determinó un gráfico de μ max a altas concentraciones de glucosa inicial (40, 60, 80 y 120 g-L-1) ajustando los datos de fermentación a las predicciones de la simulación del modelo. La linealización (integración) de los perfiles cinéticos de crecimiento del peso seco de la biomasa (PSB) a lo largo del tiempo se logró utilizando la transformación del logaritmo natural:
Donde x(t) = concentración de BDW en cada momento x 0 ; t = concentración inicial de BDW; μ max = tasa máxima de crecimiento específico (h-1); y la tasa de crecimiento específico es μ = (1/x(t)) – (dx/dt). Para simplificar, se ha supuesto que todas las bacterias siguen la ley exponencial de crecimiento celular en un cultivo por lotes según un modelo cinético de primer orden . La tasa de crecimiento específico de las células, o el aumento de la masa celular en el tiempo, representa un cambio en la selectividad a diferentes tasas de crecimiento, lo que tiene un impacto significativo en el proceso de fermentación . El crecimiento celular rápido tiene una mayor demanda de energía y produce preferentemente ácido acético. A bajas tasas de crecimiento, la producción de ácido butírico se ve favorecida sobre el ácido acético . Para la fermentación continua, la producción de butirato/ácido butírico es mayor cuando μ es menor. Cuando μ tiende a cero, se produce una oscilación en la productividad . Estas ecuaciones permiten comparar la tasa de crecimiento de los sistemas discontinuos y continuos dentro de las cepas de tipo salvaje y de las radiadas.
El modelo no es independiente del medio: el medio utilizado, como se ha descrito anteriormente, afecta tanto a la tasa de crecimiento celular como a las cantidades de butirato/ácido butírico producidas, y diferentes perfiles de consumo de glucosa producirían resultados diferentes. Para cuantificar mejor la concentración óptima de glucosa para el crecimiento celular, se determinaron las tasas máximas de crecimiento específico para las cepas de tipo salvaje y las irradiadas a partir de datos cinéticos tomados de la fase de crecimiento exponencial y se trazaron frente a la concentración de glucosa añadida. Como puede verse en la Figura 5C, las tasas máximas de crecimiento específico para las cepas irradiadas a 114 AMeV y una dosis de 40 Gy se calcularon según el ejemplo en el que la cepa se cultivó en medio CGM que contenía 60 g-L-1 de glucosa. Se eligió el mejor rango lineal de puntos de datos que correspondía a la fase de crecimiento exponencial de la cepa. En algunos casos, en los que no se cumplía el requisito mínimo de tres puntos de datos experimentales, se utilizó una expresión alternativa que tenía en cuenta sólo dos puntos extremos (al principio y al final de la fase exponencial). La pendiente de la línea recta (m = μmax) da la tasa máxima de crecimiento específico (0,213 h-1). El modelo de regresión lineal unitaria (y = 0,2129x – 2,6457) tuvo un coeficiente de determinación ajustado de R2 = 0,9765, lo que indica que todos los puntos de datos se incluyeron en la línea de mejor ajuste y ningún punto de datos varió de esta línea. Además, cada tasa de crecimiento específica se estimó a partir de la pendiente del correspondiente gráfico semilogarítmico del BDW frente al tiempo. Las barras de error se expresan en términos de la desviación estándar (DE) obtenida de los cálculos de cada réplica de fermentación independiente para las cepas irradiadas y las de tipo salvaje (no se muestran los datos originales). Los resultados demuestran que estas cepas irradiadas tenían una tasa de crecimiento específico significativamente menor (μ = 0,38 ±0,03 a 0,21 ±0,02 h-1) en comparación con el tipo salvaje (μ = 0,38 a 0,42 h-1). El uso de la irradiación con iones 12C6+ a 68 AMeV, 20 a 40 Gy y 106 a 108 iones-pulso-1 dio lugar a unas fases de retraso especialmente largas, de 10, 12 y 16 h, respectivamente. En comparación, el uso de la irradiación de iones 12C6+ a 114 AMeV, 20 a 40 Gy y 106 a 108 iones-pulso-1 dio lugar a fases de retardo de 12, 18 y 24 h, respectivamente. Estas fases de retardo más largas pueden atribuirse en parte a los diferentes parámetros de radiación y a la baja densidad de inoculación utilizada en la fermentación. La menor tasa de crecimiento específico de las células irradiadas puede ser el resultado de la carga metabólica impuesta a las células como consecuencia de la menor cantidad de energía generada por el metabolismo de la glucosa a causa del daño inducido a mayor energía y dosis. En comparación con las cepas de tipo salvaje, las cepas irradiadas con 20 y 30 Gy a 68 AMeV tuvieron perfiles de crecimiento y consumo de glucosa similares, con una tasa de crecimiento específica casi idéntica de μ = 0,42 ±0.03 h-1, mientras que las cepas irradiadas con 30 y 40 Gy a 114 AMeV mostraron una fase de retardo significativamente más larga, un consumo de glucosa más lento y una tasa de crecimiento específica mucho más baja de μ = 0,26 ±0,03 h-1 (30 Gy) y μ = 0,21 ±0,02 h-1 (40 Gy).
Como se señaló anteriormente, el acetato se sintetiza a través de las reacciones PTA y AK, siendo esta última la que proporciona ATP (Figura 3). Para la biosíntesis del butirato, dos moléculas de acetil-CoA se condensan en acetoacetil-CoA, seguido de una reducción a butiril-CoA, que luego se convierte en butirato a través de las reacciones PTB y BK con generación de ATP. La menor tasa de crecimiento específico para las cepas irradiadas (energía 114 AMeV y dosis de 30 y 40 Gy) puede atribuirse a la carga metabólica de las células causada por la menor generación de energía (ATP) durante el metabolismo de la glucosa debido al daño por irradiación de ack y pta. El BDW de la glucosa para las cepas irradiadas también varió con respecto a las cepas de tipo salvaje. El gráfico del BDW en función del tiempo y de la tasa de crecimiento específica de las cepas irradiadas indicó que el flujo de carbono y energía se redistribuyó a lo largo de las vías metabólicas de estas cepas, lo que también dio lugar a cambios significativos en la producción de ácido de los productos de fermentación.