La enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) es una enfermedad infecciosa que ha causado una pandemia mundial con más de 36 millones de personas infectadas de unos 200 países o territorios, con más de un millón de muertes hasta la fecha (Organización Mundial de la Salud (OMS), 2020). Se supone que el agente causante del COVID-19, el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2), tiene su origen en los murciélagos, ya que el coronavirus RaTG13 transmitido por murciélagos es el pariente genético más cercano hasta la fecha (Andersen et al., 2020; Zhou et al., 2020). Se han estudiado varias especies para determinar su posible papel como huéspedes intermedios (Shi et al., 2020). Además, los modelos animales para recapitular una enfermedad similar a la de COVID-19 se consideran una línea de investigación importante y necesaria para el desarrollo de fármacos terapéuticos y compuestos profilácticos.
Además de varios estudios de modelización que proponen posibles especies animales susceptibles al SARS-CoV-2 (Damas et al., 2020; Qiu et al., 2020; Veljkovic et al., 2020), múltiples infecciones experimentales han mostrado ya una amplia gama de animales susceptibles. En concreto, el murciélago egipcio de la fruta, el hurón, el hámster sirio dorado, el gato, los ratones que expresan la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) humanizada, los ratones BALB/c (que utilizan un SARS-CoV-2 mutado mediante varios pases de cultivo celular) y algunas especies de primates no humanos son permisivos a la infección viral, desarrollando desde una enfermedad respiratoria subclínica hasta una leve o moderada (Bao et al, 2020; Halfmann et al., 2020; Kim et al., 2020; Rockx et al., 2020; Shi et al., 2020; Yu et al., 2020). Desde un punto de vista experimental, la susceptibilidad de los perros al SARS-CoV-2 es limitada, ya que los animales inoculados pueden seroconvertirse parcialmente (Shi et al., 2020). Por el contrario, la inoculación intranasal de pollos, patos y cerdos no dio lugar a ninguna evidencia de infección (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020).
El cerdo se utiliza comúnmente en la investigación debido a las similitudes existentes con los humanos en términos de anatomía, genética, fisiología y, también, inmunología. De hecho, es probable que los experimentos en cerdos sean más predictivos de los tratamientos terapéuticos y preventivos en humanos que los experimentos en roedores (Meurens et al., 2012). Sin embargo, dado que los cerdos no son susceptibles a la infección por el SARS-CoV-2 cuando se les inocula por vía intranasal (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), merece la pena investigar la posibilidad de desarrollar un modelo de infección porcina con este virus utilizando otras posibles vías de inoculación. La principal razón para probar en cerdos es que el receptor ACE2 de esta especie es funcional, ya sea transfectando ACE2 porcina en células HeLa (que no expresan constitutivamente la ACE2 humana) (Zhou et al., 2020) o que las pseudopartículas con la proteína S del SARS-CoV-2 son capaces de infectar células renales porcinas (Letko et al., 2020). Además, la proteína ACE2 se expresa en todos los tejidos principales de los cerdos, según la evaluación por inmunohistoquímica (Xiao et al., 2020). En consecuencia, para establecer un modelo porcino putativo de COVID-19, investigamos el efecto de diferentes rutas naturales y no naturales de inoculación de SARS-CoV-2 en cerdos domésticos (Sus scrofa domesticus).
Para ello, se seleccionaron cuatro grupos de cinco lechones convencionales de 5 a 6 semanas de edad (Landrace × Large White) y se inocularon mediante diferentes vías: intranasal (IN, 1,5 ml/nostril; volumen total de 3 ml), intratraqueal (IT, 3 ml) como se describió previamente (García-Morante et al, 2016), intramuscular (IM, 1 ml en cada lado de los músculos del cuello; volumen total de 2 ml) o intravenosa (IV, 2 ml), con una dosis final de 105,8 dosis infecciosas de cultivo de tejidos (TCID50) del aislado de SARS-CoV-2 (GISAID ID EPI_ISL_510689) por cada animal. Los grupos IT e IV fueron anestesiados con 10 mg/kg de ketamina y 0,8 mg/kg de xilacina antes de la inoculación. Se propagó un pasaje 2 de SARS-CoV-2 y se tituló en células Vero E6 (ATCC CRL-1586), siguiendo el mismo protocolo que para otros coronavirus (Rodon et al., 2019). Se utilizaron dos cerdos adicionales como controles negativos.
Todos los animales fueron seropositivos contra el coronavirus respiratorio porcino, según se determinó mediante un ELISA comercial (INgezim Corona Diferencial 2.0 ). Teniendo en cuenta que no se ha descrito ninguna reactividad cruzada de anticuerpos entre los coronavirus alfa y beta (Okba et al., 2020), los animales se mantuvieron en el estudio. Se esperaba una reactividad inicial contra el PRCV, ya que este virus es ubicuo en el ganado porcino europeo (Saif et al., 2012; Vidal et al., 2019).
Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Bienestar Animal del Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (CEEA-IRTA) y por la Comisión Ética de Experimentación Animal de la Generalitat de Catalunya y realizados por personal certificado. Los experimentos con SARS-CoV-2 se llevaron a cabo en las instalaciones del Nivel de Bioseguridad 3 (BSL-3) de la Unidad de Biocontención del IRTA-CReSA (Barcelona, España).
A los 2 y 22 días post-inoculación (dpi), dos y tres animales/grupo (IT, IM e IV), respectivamente, fueron eutanasiados. Dado que ya se demostró que la inoculación IN no es eficaz para causar la infección por el SARS-CoV-2 (Shi et al., 2020), los cerdos inoculados por esta vía fueron eutanasiados en los días 1 y 2 pi para evaluar la evidencia de una posible infección temprana transitoria en los tejidos. Los animales de control negativo fueron eutanasiados antes del inicio del experimento. Las muestras se recogieron y procesaron como se ha descrito previamente (Vergara-Alert et al., 2017). Brevemente, se realizaron necropsias completas en todos los animales. Se tomaron varios tejidos (cornetes frontales, mediales y caudales; tráquea proximal, medial y distal; bronquios grandes y pequeños, áreas pulmonares craneales, mediodorsales y caudales izquierdas; riñón; hígado; corazón; y bazo), se fijaron por inmersión en formalina tamponada neutra al 10%, se incrustaron en parafina y se seccionaron a 3 µm para preparar portaobjetos. Los portaobjetos histológicos se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE) para evaluar las posibles lesiones microscópicas. Además, se tomaron los mismos tejidos más el íleon, el ganglio linfático cervical (LN), el LN mediastínico, el LN mesentérico, el bulbo olfatorio, la amígdala, el timo, la glándula salival parótida, la suprarrenal, el páncreas, el tronco encefálico, los párpados y la médula ósea en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) en tubos con perlas para realizar la detección del gen upE del SARS-CoV-2 mediante RT-qPCR (Corman et al., 2020). También se tomaron hisopos nasales y rectales (diariamente durante la primera semana y a los 14 y 22 dpi) para analizarlos en busca de la presencia de ARN viral mediante la mencionada RT-qPCR. Las muestras de suero recogidas los días 0, 14 y 22 pi se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos contra las proteínas S1 + S2 de la espiga del SARS-CoV-2 y la nucleocápside (N) mediante ELISAs propios (Institut de Recerca de la sida (Irsicaixa), 2020). Además, se realizó un ensayo de neutralización del virus siguiendo un protocolo anterior con una pequeña modificación (Rodon et al., 2020), las diluciones seriadas de sueros y SARS-CoV-2 se incubaron durante 1 hora a 37°C antes de la realización del ensayo en placa.
Todos los animales fueron controlados diariamente pero ninguno de ellos mostró signos clínicos después de la inoculación de SARS-CoV-2. Además, no se encontraron lesiones macroscópicas o microscópicas atribuibles a la infección por SARS-CoV-2 en ninguno de los animales estudiados de todos los grupos de inoculación, así como en los de control (datos no mostrados).
Ninguno de los cerdos presentó excreción nasal o rectal de ARN viral. La tráquea proximal de un animal inoculado con IN fue positiva a 1 dpi para el ARN viral (Cq = 24,36). El resto de los tejidos de este animal y del resto de los cerdos resultaron negativos a la RT-qPCR (límite de detección de la qPCR de 38,6 ciclos).
A los 14 y 22 dpi, se pudieron detectar bajos niveles de anticuerpos dirigidos contra la proteína Spike en todos los animales de los grupos IM e IV (Figura 1a). Además, estos cerdos también mostraron títulos de anticuerpos neutralizantes a los 22 dpi (que iban de 74 a 317 títulos de dilución recíproca SNT50) (Figura 1b). Asimismo, se encontraron bajos niveles de anticuerpos dirigidos a la proteína N en uno de los tres animales inoculados por vía IM y en todos los inoculados por vía IV al final del experimento (datos no mostrados). Es importante destacar que un solo animal del grupo IT no mostró anticuerpos contra la S pero tenía anticuerpos contra la proteína N así como títulos neutralizantes (título de dilución recíproca SNT50 de 29) en el día 0 pi, lo que podría sugerir una posible reacción cruzada con otro coronavirus que infecte a los cerdos. Cabe destacar que estos anticuerpos contra la proteína N disminuyeron al finalizar el experimento, lo que sugiere que eran de origen materno. Además, este animal no mostró anticuerpos seroneutralizantes a los 22 dpi (Figura 1b).
Los datos actuales indican que el SARS-CoV-2 no fue capaz de infectar a los cerdos por ninguna de las rutas probadas, a saber, IN, IT, IM e IV. Por lo tanto, nuestros esfuerzos confirman los experimentos anteriores que indican la falta de susceptibilidad de la infección por el cerdo (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), aunque puede utilizarse para evaluar la inmunogenicidad de los próximos candidatos a vacuna.
Es importante que el estudio actual va más allá de otros estudios con SARS-CoV-2 y cerdos, ya que probamos un número más amplio de rutas de inoculación. Sin embargo, ninguna de ellas dio lugar a una infección productiva en los lechones. Un resultado significativo de este estudio fue la evidencia de seroconversión contra la glicoproteína Spike en los días 14 y 22 pi y la presencia de anticuerpos neutralizantes en el día 22 pi en cerdos inoculados por vía parenteral (IM e IV). Teniendo en cuenta la corta duración del experimento (22 días), dicha seroconversión subraya el interés potencial del cerdo para ser utilizado en estudios de inmunogenicidad para el SARS-CoV-2. De hecho, es ampliamente reconocido el interés del cerdo como modelo animal adecuado para la inmunología, así como para la fisiología, la farmacología y la cirugía, aplicables a la medicina humana (Rothkötter, 2009).
En conclusión, el presente estudio confirma que los lechones no son un modelo animal adecuado para la COVID-19, pero su potencial utilidad como modelo de inmunogenicidad en los estudios preclínicos de desarrollo de vacunas merece una mayor investigación.