Perfiles de ácidos grasos y sus patrones de distribución en microalgas: un análisis exhaustivo de más de 2000 cepas de la colección de cultivos del SAG

Una base de datos de perfiles de AF de diversas microalgas

La caracterización de los perfiles de AF de las cepas de microalgas del SAG se realizó mediante el cribado de los AF de cadena larga (C-14 – C-24) esterificados dentro de los lípidos. Se examinó un total de 2076 cepas de cultivo del SAG (lo que equivale al 91% de las existencias del SAG). Se estableció una base de datos que contenía todos los AFs identificados y algunos otros metabolitos hidrofóbicos. En la tabla 1 se muestra un resumen de todas las sustancias identificadas en las cepas de algas analizadas. Se identificaron un total de 86 sustancias diferentes por espectrometría de masas, 76 de las cuales representan ésteres metílicos de los AF. De los 76 ácidos grasos, 36 sustancias se identificaron por su espectro de masas y por el tiempo de retención según una sustancia estándar, y los otros 40 ácidos grasos se identificaron sólo por su espectro de masas. Las 10 sustancias restantes se identificaron también por su espectro de masas. En las comparaciones con una sustancia estándar, el compuesto se identificó por comparación con los espectros de masas con mayor similitud a la sustancia propuesta en la biblioteca MS (Nist02 o Wiley98). De este modo se detectaron algunos ésteres metílicos de AFs ramificados, por ejemplo el 12-metil-14:0 o el 3, 7, 11, 15-tetrametil-16:0. Mientras que para la mayoría de los FAMEs se disponía de estándares auténticos o de referencias de EM, para algunas otras sustancias sólo fue posible la identificación del «mejor acierto». Los derivados del DMOX permitieron identificar los 12 FAMEs restantes. Las sustancias no identificadas aún deben ser verificadas con estándares auténticos, que no están disponibles en este momento. La base de datos completa se muestra como archivo adicional 1.

Las bacterias en los cultivos de algas (como contaminaciones o a veces incluso a través de simbiosis) son bien conocidas y pueden encontrarse en las cepas de cultivo de casi cualquier colección de cultivos de algas. Sólo una pequeña fracción (alrededor del 20%) de las cepas SAG estudiadas puede estar en estado axénico. Por lo tanto, también el contenido de AF de las bacterias contaminantes puede haber contribuido al perfil de AF obtenido. Para comprobarlo, medimos el metil-15:0 y el metil 17:0, que se consideran marcadores de contaminaciones bacterianas. Sólo 34 cepas de las 2076 analizadas contenían pequeñas cantidades de metil-15:0. Esta baja tasa observada de bacterias contaminantes fue apoyada por los controles microscópicos que son rutinarios en el mantenimiento perpetuo de las cepas de algas (datos no mostrados). En resumen, concluimos que sólo el 1-2% de las cepas pueden haber sido contaminadas y que sólo hay una influencia menor de las contaminaciones bacterianas en los perfiles de AF observados en los cultivos de algas.

Además, comparamos los perfiles de AF principales medidos de 10 cepas elegidas al azar de diferentes clases con los datos publicados (Tabla 2), y hay que tener en cuenta que sólo una de las 10 cepas que se eligieron de los datos publicados procedía de la colección del SAG. En el caso de 6 cepas, los perfiles de AF eran muy similares. En el caso de las 4 cepas restantes se observaron diferencias importantes en el grado de desaturación de los AF con diferentes longitudes de cadena, lo que puede explicarse por las diferentes condiciones de cultivo utilizadas en los distintos estudios.

Patrones de composición de ácidos grasos

Los perfiles de FAME fueron bastante diferentes entre las cepas. Como ejemplo, los perfiles de FAME de cuatro géneros diferentes, es decir, Chroococcus (Cyanobacteria), Closteriopsis (Chlorophyta, Trebouxiophyceae), Pseudochantransia (Rhodophyta) y Prymnesium (Chromalveolates, Haptophyta) se presentan en la Figura 1. Por lo tanto, se preveía recuperar ciertos patrones de distribución de AF diferentes entre filos, clases y géneros de microalgas. Además, se probó si también se pueden encontrar diferencias en los patrones de AF para grupos de menor rango taxonómico, es decir, entre especies del mismo género o incluso entre múltiples aislados de la misma especie.

2.1 Distribución de cuatro PUFAs importantes entre las cepas de la colección de cultivos de algas del SAG

Los patrones de distribución de los FAs entre y dentro de los 17 grupos (phyla o clases) de microalgas y las cianobacterias comprendidas por las cepas examinadas se investigó con más detalle para cuatro PUFAs que son de alto interés nutricional (Tabla 3). La frecuencia de aparición de estos cuatro PUFAs en un determinado grupo de microalgas se da como el porcentaje de cepas con un determinado FA de todas las cepas examinadas en la Tabla 3.

Debido a que la colección de cultivos del SAG se centra en algas microscópicas de hábitats terrestres, los Haptophyta, Dinophyta y Phaeophyceae estaban sólo pobremente representados. Por lo tanto, los patrones de distribución recuperados en estos y otros grupos poco representados pueden no ser representativos de todo el grupo. Por ejemplo, para las Phaeophyceae se disponía principalmente de formas microscópicas (por ejemplo, Ectocarpus y el género de agua dulce Bodanella) y las cepas de Rhodophyta examinadas abarcaban principalmente formas de agua dulce o de hábitats terrestres (por ejemplo, Porphyridium). Aunque las diatomeas son muy diversas en los hábitats terrestres, la pequeña muestra examinada de cepas de diatomeas disponibles (18) no representa ni de lejos a este grupo, que es probablemente el más rico en especies de algas. Además, para cada una de las dos clases de Stramenopiles (algas heterokont), Phaeothamniophyceae y Raphidophyceae, sólo se mantienen dos cepas en el SAG y, por lo tanto, no se discuten aquí. Del mismo modo, sólo hay una cepa de Chlorarachniophyta (supergrupo Rhizaria) en el SAG.

El ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z), un PUFA de cadena muy larga, fue el tercer FA más frecuente, presente en 15 de los 20 grupos examinados (Tabla 3). En las cepas de Dinophyta, Haptophyta y Euglenoids el DHA era especialmente frecuente y se encontraba en porcentajes relativamente altos del contenido total de AF, es decir, en el 60% o más de estas cepas la proporción de DHA era superior al 5%. En la única cepa dinófita estudiada de Ceratium horridum la proporción de DHA era incluso del 29,3%. En los demás grupos, el DHA se encontró en frecuencias bastante bajas y también en proporciones bastante pequeñas, es decir, menos del 1% del contenido total de AF. Aunque el DHA se encontró en las Cryptophyta y Bacillariophyceae en una de cada cinco cepas, su porcentaje del contenido total de AF fue inferior al 5%, excepto en Cryptomonas baltica SAG 18.80 (Cryptophyta), donde fue del 13,7%. A pesar de que el DHA se encontró en frecuencias bastante bajas en las algas verdes (Chlorophyta), el segundo contenido más alto de DHA de todas las cepas SAG, el 18,9% del total de AF, se encontró en la clorofita Chlorococcum novae-angliae SAG 5.85, seguida de la trebouxiofita Prototheca zopfii SAG 263-8 con el 14,2%. En conjunto, estos resultados concuerdan con las cantidades de DHA descritas anteriormente para grupos específicos de algas.

El ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z)) fue uno de los PUFAs más comunes, encontrado en todos los 17 grupos cubiertos por nuestro estudio (Tabla 3). Las cepas que contienen EPA fueron particularmente frecuentes en las Eustigmatophyceae, Glaucophyta, Xanthophyceae y Rhodophyta. Las proporciones más altas de EPA en el contenido total de AF se dieron en la Rhodophyta, con cerca del 81% de las cepas mostrando más del 10% de EPA. Los valores más altos fueron el 52,4% en Compsopogonopsis leptoclados SAG 106.79 y el 44,9% en Acrochaetium virgatulum SAG 1.81. También las cepas de tres especies de Porphyridium contenían altas cantidades de EPA (31,2% en P. sordidum SAG O 500, 27,5% en P. aerugineum SAG 110.79, 26,7% en P. purpureum SAG 1380-1a). Esto coincide con un informe sobre P. cruentum que sugiere que las algas rojas son una rica fuente de EPA . A pesar de que el EPA se encuentra con bastante frecuencia en la Glaucophyta, sólo la mitad de todas las cepas tenían proporciones de EPA superiores al 10% (un máximo del 31,1% en Glaucocystis nostochinearum SAG 28.80). Esto está de acuerdo con otro estudio que mostró altas cantidades de EPA (además de ARA) en la glaucófita Cyanophora paradoxa . El mayor porcentaje (87%) de cepas con una proporción de EPA superior al 10% se encontraba en la Dinophyta, pero con un máximo de sólo el 24,3% en Pyrocystis lunula SAG 2014. En las Euglenoides, Xantofíceas y Eustigmatofíceas, alrededor del 67% de todas las cepas tenían una proporción de EPA superior al 10%, con valores máximos de alrededor del 31% (31,4% en Heterococcus fuornensis SAG 835-5, 31,6% en Euglena proxima SAG 1224-11a) y 34,6% en Goniochloris sculpta SAG 29.96. El EPA se encontró raramente y en su mayoría en cantidades insignificantes (< 5%) en la mayoría de las algas verdes, pero tres cepas tenían un contenido excepcionalmente más alto de alrededor del 20% de los AF totales (24,2%, Chlorella sp. SAG 242.80; 24,0%, Chlamydomonas allensworthii SAG 28.98; 22,3%, Cylindrocapsa involuta SAG 314-1). El EPA fue el único AF recuperado de Chlorarachnion repens SAG 26.97 (Chlorarachniophyta). El hecho de que las Xantofíceas y las Eustigmatofíceas contengan EPA en proporciones relativamente altas, mientras que las algas verdes raramente acumulan EPA, apoya estudios anteriores .

El ácido araquidónico (ARA, 20:4(5Z, 8Z, 11Z, 14Z)) se encontró con mayor frecuencia en las Phaeophyceae, donde estaba presente en todas las cepas excepto en una investigada (Tabla 3); en aproximadamente el 54% de todas las cepas de Phaeophyceae la proporción de ARA era superior al 10%, pero con un máximo de sólo el 17,7% en Halopteris filicina SAG 10.96. Los ARA tenían la mayor proporción de AF total en la Rhodophyta; allí incluso alrededor del 77% de todas las cepas tenían un contenido de ARA superior al 10%, con un máximo del 68,3% en Pseudochantransia sp. SAG 19.96. Curiosamente, el contenido de ARA fue bastante elevado pero variable entre los ocho aislados múltiples examinados del rodofito Porphyridium purpureum. Mientras que la proporción media de ARA era de alrededor del 31% en seis cepas, era sólo del 3,8% en SAG 1380-1d, pero del 44,5% en SAG 1380-1e. Todavía no tenemos explicación para esta variación; ambas cepas fueron aisladas de hábitats marinos y se mantienen en las mismas condiciones de cultivo. Ya se encontraron altas proporciones de ARA (así como de EPA) características de otra especie de Porphyridium cruentum . Los ARA estaban presentes en cerca de la mitad de todas las cepas euglenoides investigadas y con proporciones relativamente altas del contenido total de AF, es decir, cerca de un tercio de las cepas presentaban más del 5% de ARA con valores extraordinariamente altos del 41,3% y el 34,3% en Rhabdomonas incurva SAG 1271-8 y Khawkinea quartana SAG 1204-9. Curiosamente, otra cepa de la misma especie K. quartana, SAG 1204-9, tenía menos de la mitad (13,3%) de contenido de ARA y en otras cinco especies de Rhabdomonas no se detectaron ARA. Esto demuestra que el contenido de AF puede ser bastante variable entre especies del mismo género e incluso entre múltiples aislados de la misma especie. Aunque aproximadamente la mitad de todas las cepas examinadas de las Xanthophyceae y Eustigmatophyceae contenían ARA (Tabla 3), tenían este AF en proporciones relativamente bajas. Sólo una cuarta parte de las cepas de Xanthophyceae que contenían ARA presentaban más del 5% y en las Eustigmatophyceae incluso ninguna cepa alcanzó el 5%. Los ARA se encontraron raramente en las algas verdes, es decir, con una frecuencia media de alrededor del 14% en los filos Chlorophyta y Streptophyta, excepto en las algas verdes prasinofitas, donde los ARA estaban presentes en el 42,9% de todas las cepas (Tabla 3). Sin embargo, había unos pocos ejemplos de algas verdes con contenidos de ARA extraordinariamente altos, es decir, el 73,8% (correspondiente a 102 μg/mg de peso seco, el mayor contenido de ARA detectado en todas las cepas SAG investigadas) en la clorofita Palmodictyon varium SAG 3.92, seguido del 52,9% en la clorofita Trochisciopsis tetraspora SAG 19.95 y el 51,8% en la trebouxiofita Myrmecia bisecta SAG 2043. El hecho de que se haya encontrado un alto contenido de ARA en esta última cepa está de acuerdo con que se haya encontrado un pariente cercano con Parietochloris incisa (syn. Lobosphaerois incisa, Myrmecia incisa) . A P. incisa se le ha asignado una «microalga oleaginosa» y la fuente vegetal más rica en ARA conocida hasta ahora debido a su capacidad de acumular altas cantidades de ARA (hasta un 59% de su contenido total de AF) . Curiosamente, la cepa SAG de P. incisa (Lobosphaera incisa SAG 2007) tenía, con un 13,2%, un contenido de ARA mucho más bajo (Tabla 2).

El ácido gamma-linolénico (GLA, 18:3(6Z, 9Z, 12Z)) fue el tercer AF más común en la muestra estudiada de cepas de microalgas SAG, faltando sólo en las Haptophyta, Dinophyta y Euglenoides (Tabla 3). Se detectó con mayor frecuencia en dos linajes de algas verdes, las prasinofitas y las estreptofitas. En las prasinofitas, sin embargo, el GLA sólo estaba presente en uno de los cinco géneros disponibles para ese grupo, Tetraselmis, y allí en 12 de las 17 cepas disponibles y con proporciones variables, es decir, del 0,5 al 7,3% del contenido total de AF. En los Streptophyta, el GLA estaba más ampliamente distribuido, es decir, se detectó en 17 de los 41 géneros examinados. La distribución de GLA fue bastante variable dentro de las cepas y especies de un determinado género de estreptófitos, de forma similar a los hallazgos de ARA en otros géneros. Se encontraron porcentajes relativamente altos de GLA en especies/cepas de Closterium (16,5% en C. baillyanum SAG 50.89, 8% en C. lunula SAG 7.84), pero no se encontró GLA en las otras 12 cepas de ese género. Del mismo modo, en las numerosas cepas disponibles de Cosmarium (25) y Micrasterias (16), sólo se encontró GLA en 11 y 2 cepas, respectivamente. Los mayores porcentajes de GLA se encontraron en la clase de algas verdes Chlorophyceae (29,9% en Deasonia multinucleata SAG 25,95, 28,5% en Desmodesmus multiformis SAG 26,91) y en Cyanobacteria (24,8% en Spirulina maxima SAG 84,79). En aproximadamente un tercio (32%) de todas las cepas de clorofitas con GLA este AF tenía porcentajes del 5% y superiores. La distribución de GLA en las cianobacterias fue bastante irregular, es decir, las 27 cepas de cianobacterias con GLA se limitaron principalmente a tres géneros, Calothrix (8 cepas), Microcystis (7 cepas) y Spirulina (6 cepas). Además, dentro de cada uno de estos géneros los porcentajes de AGL eran bastante variables, por ejemplo, en Spirulina variaba del 4,6% al 24,8%, y tres cepas carecían de AGL. La composición de AG se ha utilizado anteriormente para discriminar las cianobacterias en aislados y muestras naturales a nivel genérico. Para discriminar especies de cianobacterias, como marcador adicional se utilizó la composición de hidrocarburos en un estudio anterior, pero en nuestro estudio no se detectó ninguna sustancia fuera de este grupo . Curiosamente, el GLA fue el único AF que se detectó en más de tres de las 223 cepas examinadas. Por lo tanto, las cepas de cianobacterias SAG pueden dividirse a grandes rasgos en aquellas con presencia de GLA (pocos géneros) y aquellas en las que casi no había PUFAs. Esto corresponde a los hallazgos anteriores que describieron una bipartición de cianobacterias, independiente de su posición taxonómica, en géneros que producen C-18 PUFA y aquellos que no lo hacen.

El género prasinofito Tetraselmis presentó un ejemplo interesante para probar la variación de FA entre aislados estrechamente relacionados. Nueve cepas asignadas a ese género han sido aisladas de la misma localidad (marina) y consideradas como la misma especie por el aislador (U.G. Schlösser, com. pers.). Sólo en dos cepas estaba presente el DHA, pero en trazas muy pequeñas (0,3% y 0,4%). Por el contrario, el ARA y el GLA se encontraron en todas las cepas con porcentajes que variaban entre el 0,8% y el 2,7% y entre el 0,5% y el 7,3%, respectivamente.

2.2 Análisis de los patrones de distribución de los AF

La composición de ácidos grasos (AF) detectada en las 2.076 cepas investigadas se analizó estadísticamente para comprobar si existían ciertos patrones de distribución de los AF entre los distintos grupos de algas investigados que pudieran corresponder a sus relaciones filogenéticas. En un primer conjunto de tres análisis (niveles taxonómicos superiores) se comprobó 1) si los patrones de distribución de los AF pueden reflejar diferencias entre los filos de las algas derivadas de la endocitobiosis primaria (supergrupo Plantae) o secundaria (Chromalveolates, Euglenoides) en comparación con las cianobacterias que representan el origen plastidial, 2) la distinción de los filos dentro del supergrupo Plantae (Chlorophyta, Streptophyta, Rhodophyta/Glaucophyta) y 3) los principales linajes evolutivos (clases) dentro de la Chlorophyta. Un segundo conjunto de análisis se centró en el nivel genérico, es decir, se comprobó si la separación de géneros, basada en anteriores análisis de secuencias de ADNr 18S, sugerida para Chlamydomonas s.l., Chlorella s.l. y Scenedesmus s.l., se refleja en los patrones de distribución de AF. Para el primer conjunto de análisis, las numerosas especies (266) que estaban representadas como cepas múltiples (por ejemplo, Chlamydomonas moewusii, 28) tuvieron que reducirse a una sola cepa por especie para evitar sesgos. Esto incluye también las cepas múltiples no identificadas a nivel de especie, es decir, etiquetadas con «sp.» en lugar de un nombre de especie (por ejemplo, Chlorogonium sp., 26). Las cepas de Chlorophyta del SAG eran especialmente ricas en este tipo de cepas múltiples. También se excluyeron las cepas en las que sólo se detectó un único AF. Esto redujo el número total de cepas consideradas en nuestros cálculos a 1193. A continuación, las cepas se dividieron en once grupos que corresponden aproximadamente a filos o clases (archivo adicional 2). Las cepas pertenecientes a la Chlorophyta (61% de todas las cepas investigadas) se subdividieron a su vez en las tres clases, Chlorophyceae, Trebouxiophyceae y Ulvophyceae, mientras que las cepas de algas verdes prasinofitas SAG (1,7% de todas las cepas Chlorophyta consideradas) se excluyeron de los análisis porque comprendían muy pocas especies (10). Las cepas de Glaucophyta (15) y Rhodophyta (81) se trataron colectivamente como una unidad compuesta. La Rhizaria – Chlorarachniophyta, estaba representada por una sola cepa y, por lo tanto, se omitió de los análisis estadísticos.

Análisis de niveles taxonómicos más altos

Se comprobó si los patrones de distribución de la composición de AF en las cepas investigadas delimitan los tres «supergrupos» de algas eucariotas, Plantae, Chromalveolates y Excavates (Euglenoids), y las cianobacterias entre sí. El supergrupo Plantae comprende exclusivamente eucariotas con plástidos derivados de la endocitobiosis primaria, es decir, una cianobacteria se transformó en un orgánulo mediante la captación y retención por parte de la célula huésped, seguida de la pérdida de gran parte de su genoma . Las algas cromalveoladas, así como los euglenoides (el único linaje de algas excavadas), adquirieron sus plastos mediante endocitobiosis secundaria a partir de un rodofito y un alga verde, respectivamente . Para considerar un número casi igual de cepas para los cuatro grupos, se seleccionaron al azar 100 cepas de Plantae, Chromalveolates y Cyanobacteria, lo que equivale al número total de cepas de euglenoides consideradas (73). La ordenación resultante del CVA (Canonical Variates Analysis, análisis discriminante multigrupo) señaló una fuerte diferencia entre las cianobacterias/endocitobiosis primaria (Plantae) y los dos grupos que representan la endocitobiosis secundaria (Chromalveolates/Euglenoides) (Figura 2). La diferencia observada fue apoyada sin excepción por pruebas de significación no paramétricas para datos multidimensionales (NP-MANOVA y ANOSIM). Según SIMPER, la menor disimilitud observada (63,55%) fue entre Cyanobacteria y Plantae, mientras que la mayor (77,29%) fue entre Plantae y Chromalveolates. La primera variante canónica (CV1) implicaba el 99,99% de todas las posibles diferencias entre los cuatro grupos, por lo que examinamos las posibles correlaciones entre este eje y los AF. Cuatro AF se correlacionaron significativa y exclusivamente con la primera variante canónica (CV1), es decir, 16:0 (ρCV1 = -0,61/p < 0.001), 18:2(9Z, 12Z) (ρCV1 = -0,46/p < 0,001), 9-octadecanamida (ρCV1 = 0,41/p < 0,001), y 18:1(9Z) (ρCV1 = -0,17/p = 0,001). En un segundo análisis se comprobó si los patrones de distribución de AF distinguen los filos del supergrupo Plantae, es decir, los dos linajes de algas verdes, Chlorophyta y Streptophyta , y el grupo compuesto Rhodophyta/Glaucophyta. Dado que este último era, con 54 cepas, el grupo más pequeño, se comparó con muestras aleatorias igualmente grandes de cada Chlorophyta y Streptophyta (Tabla 3). El diagrama de ordenación de un CVA del total de 162 cepas investigadas separó claramente el grupo Rhodophyta/Glaucophyta de ambos filos de algas verdes (Figura 3). El CV1 implicaba el 79% de todas las diferencias posibles e incluso el CV2 era con un 21% no despreciable. Las pruebas de significación, NP-MANOVA y ANOSIM, apoyaron la distinción de los tres grupos. SIMPER mostró que el grupo compuesto Rhodophyta/Glaucophyta era bastante disímil de ambos filos de algas verdes, es decir, había disimilitudes del 70,55% y 71,53% con la Chlorophyta y la Streptophyta, respectivamente. La menor disimilitud (55,41%) entre los tres grupos analizados se dio entre Chlorophyta y Streptophyta. Había cinco AFs significativa y exclusivamente correlacionados con el CV1, es decir, 18:3(9Z, 12Z, 15Z) (ρCV1 = 0,77/p < 0,001), 20:4 (ρCV1 = -0.49/p < 0,001), 20:5(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z) (ρCV1 = -0,59/p < 0,001), 18:1(9Z) (ρCV1 = 0,30/p = 0,001) y 16:0 (ρCV1 = -0,56/p = 0,001). Dos AF se correlacionaron exclusivamente con el CV2, es decir, discriminaron Chlorophyta y Streptophyta, 18:1(9Z) (ρCV2 = -0,4477/p < 0,001) y 9-octadecanamid (ρCV2 = 0,34/p < 0,001). La fracción más grande de todas las cepas consideradas (60,3%) eran de la Chlorophyta, lo que hizo interesante probar si los patrones de distribución de AF pueden discriminar entre las tres clases de Chlorophyta, la Chlorophyceae, Trebouxiophyceae y Ulvophyceae. Las Ulvophyceae eran las más pequeñas de las tres con sólo 49 cepas y, por lo tanto, se utilizaron muestras aleatorias de casi el mismo tamaño (54) de cada una de las otras dos clases para los análisis estadísticos. El CVA no reveló ningún grupo distinto, es decir, las cepas analizadas tendieron a formar tres grupos correspondientes a las tres clases de algas verdes, pero con un considerable solapamiento entre ellas (Figura 4). Sin embargo, las tres clases resultaron significativamente distintas entre sí tanto en las pruebas de significación empleadas como en SIMPER. Este último y los análisis de correlación permitieron considerar la 9-octadecanamida (ρCV1 = -0,58/p < 0,001; ρCV2 = -0,22/p < 0,010) y el AF 18:2(9Z, 12Z) (ρCV1 = -0,44/p < 0001; ρCV2 = -0.53/p < 0.001) como las únicas variables que discriminan bien las Ulvophyceae de las Chlorophyceae/Trebouxiophyceae y las Trebouxiophyceae de las Ulvophyceae/Chlorophyceae, respectivamente.

Análisis a nivel genérico

Los tres análisis anteriores mostraron que las relaciones filogenéticas a nivel de filos y clases entre grupos de algas se reflejaban en los patrones de distribución de los AF utilizando una gran muestra de cepas. Por lo tanto, en un segundo grupo de análisis, probamos si las diferencias en los patrones de distribución de AF pueden resolver la misma distinción de géneros que en los análisis de la secuencia del gen ARNr. Para comprobarlo, seleccionamos tres géneros ampliamente utilizados en aplicaciones biotecnológicas y bien representados por cepas SAG, es decir, Chlorella s.l., Scenedesmus s.l. y Chlamydomonas s.l.. Recientes análisis de la secuencia del gen18S rRNA han revelado que cada uno de los tres son conjuntos para- o polifiléticos que abarcan varios géneros distintos. Para Chlamydomonas seleccionamos 17 especies (53 cepas), de las cuales 9 estaban representadas por múltiples cepas (por ejemplo, C. reinhardtii, 16), que se distribuían en cinco linajes/clados independientes (= géneros) en la filogenia del 18S rDNA . Para representar mejor el clado «Oogamochlamys» se incluyeron también dos cepas de la colección UTEX (2213, 1753). La ordenación NMDS separó claramente los miembros del clado «Reinhardtii» (arriba a la derecha en la Figura 5), excepto tres cepas, de los del clado «Chloromonas» (abajo a la izquierda en la Figura 5). Sin embargo, el grupo «Chloromonas», tal y como revelan los patrones de AF, también incluía las tres cepas investigadas del clado «Moewusii» y cuatro del clado «Oogamochlamys», lo que contrasta con las filogenias del ADNr 18S. También en contraste con las filogenias del ADNr, los análisis de AF dividieron el género Lobochlamys, es decir, L. culleus formaba parte del grupo «Chloromonas» mientras que L. segnis pertenecía al grupo «Reinhardtii». Las cepas de Oogamochlamys también se separaron en ambos grupos de FA, en contraste con sus asignaciones de especies según los análisis de 18S rDNA.

Especies y cepas anteriormente asignadas a un solo género Scenedesmus se mostraron realmente distribuidas en varios géneros por los análisis de la secuencia del gen del ARNr. Por ejemplo, el género Acutodesmus ha sido segregado de Scenedesmus . Un gráfico de ordenación NMDS de los patrones de distribución de AF reveló una tendencia entre las cepas estudiadas a distribuirse en dos grupos, es decir, un grupo de 8 cepas de Acutodesmus (que incluye principalmente múltiples cepas de A. obliquus) estaba claramente separado de otro grupo que contenía principalmente cepas de Scenedesmus s.str. (Figura 6). Las cepas múltiples de S. vacuolatus se agruparon con otras cuatro cepas del género, excepto SAG 211-11n, que estaba cerca del grupo de Acutodesmus. Las cepas múltiples de A. obliquus, sin embargo, se distribuyeron en ambos grupos (Figura 6). Siete cepas de A. obliquus formaban principalmente el cúmulo de Acutodesmus, mientras que otras cinco cepas de A. obliquus se agrupaban con cepas de Scenedesmus s.str. Esto significa que dentro de la misma especie de alga verde, A. obliquus, existen dos patrones de AF distintos. Las huellas dactilares de AFLP ya mostraron una amplia variación genética entre las múltiples cepas de A. obliquus, mientras que las comparaciones de la secuencia de ITS2 rDNA demostraron la conspecificidad de las múltiples cepas, excepto la SAG 276-20 (T. Friedl, observación inédita). Por lo tanto, el hallazgo de que las cepas de A. obliquus están separadas en dos grupos de patrones de AF favorece la opinión de que las diferencias genéticas resueltas por los AFLP pueden corresponder a diferentes propiedades fenotípicas. En consecuencia, puede ser crucial registrar cuidadosamente qué cepa se ha utilizado en cualquier aplicación . Aunque se descubrió que la cepa SAG 276-20 no pertenecía a la misma especie, A. obliquus, su patrón de AF sugiere que puede seguir siendo un miembro de Acutodesmus porque se agrupó en el grupo de Acutodesmus (Figura 6).

Chlorella vulgaris constituye otro ejemplo en el que se ha detectado una amplia variación genética entre múltiples cepas de la misma especie mediante análisis AFLP . Las 15 cepas SAG múltiples de C. vulgaris se compararon con otras 19 cepas de Chlorella y similares a Chlorella, es decir, sus parientes más cercanos según las filogenias del ADNr 18S, C. sorokiniana y C. lobophora, miembros del clado sensu de Parachlorella, así como cepas más distantes, es decir, de los clados sensu de Watanabea y Prasiola . La ordenación NMDS basada en el patrón de distribución de AF no mostró casi ninguna variación dentro de las múltiples cepas de C. vulgaris y las agrupó, excepto la cepa SAG 211-1e (Figura 7). Otro grupo distante de C. vulgaris estaba formado por miembros del clado Watanabea, mientras que las algas parecidas a Chlorella del clado Prasiola no se agruparon.