La pirosecuenciación es un método de secuenciación del ADN (determinación del orden de los nucleótidos en el ADN) basado en el principio de «secuenciación por síntesis», en el que la secuenciación se realiza mediante la detección del nucleótido incorporado por una ADN polimerasa. La pirosecuenciación se basa en la detección de la luz a partir de una reacción en cadena cuando se libera pirofosfato. De ahí el nombre de pirosecuenciación.
El principio de la pirosecuenciación fue descrito por primera vez en 1993 por Bertil Pettersson, Mathias Uhlen y Pål Nyren combinando el método de secuenciación en fase sólida que utiliza perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina con ADN polimerasa recombinante que carece de actividad exonucleasa 3’a 5′(proof-reading) y la detección de luminiscencia mediante la enzima luciferasa de luciérnaga. Se añade una mezcla de tres enzimas (ADN polimerasa, ATP sulfurilasa y luciferasa de luciérnaga) y un nucleótido (dNTP) al ADN monocatenario que se va a secuenciar y se sigue la incorporación del nucleótido midiendo la luz emitida. La intensidad de la luz determina si se han incorporado 0, 1 o más nucleótidos, mostrando así cuántos nucleótidos complementarios están presentes en la cadena molde. La mezcla de nucleótidos se retira antes de añadir la siguiente mezcla de nucleótidos. Este proceso se repite con cada uno de los cuatro nucleótidos hasta que se determina la secuencia de ADN de la plantilla de una sola hebra.
Un segundo método basado en la solución para la pirosecuenciación fue descrito en 1998 por Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen y Pål Nyren. En este método alternativo, se introduce una enzima apirasa adicional para eliminar los nucleótidos que no son incorporados por la ADN polimerasa. Esto permitió que la mezcla de enzimas, incluyendo la ADN polimerasa, la luciferasa y la apirasa, se añadiera al principio y se mantuviera durante todo el procedimiento, proporcionando así una configuración sencilla adecuada para la automatización. Un instrumento automatizado basado en este principio fue introducido en el mercado al año siguiente por la empresa Pyrosequencing.
Una tercera variante microfluídica del método Pyrosequencing fue descrita en 2005 por Jonathan Rothberg y sus colaboradores de la empresa 454 Life Sciences. Este enfoque alternativo para la pirosecuenciación se basaba en el principio original de fijar el ADN que se iba a secuenciar a un soporte sólido y demostraron que la secuenciación podía realizarse de forma altamente paralela utilizando una micromatriz microfabricada. Esto permitió la secuenciación de ADN de alto rendimiento y se introdujo en el mercado un instrumento automatizado. Éste se convirtió en el primer instrumento de secuenciación de nueva generación que inició una nueva era en la investigación genómica, con una rápida caída de los precios de la secuenciación del ADN que permitió la secuenciación del genoma completo a precios asequibles.