Nuevos métodos de aislamiento
En la actualidad, se utiliza una gran variedad de métodos para exponer nuevos microorganismos no cultivados previamente. En particular, se utilizan nuevos medios nutritivos que contienen sustancias específicas; el cultivo se lleva a cabo en diferentes condiciones físicas y químicas del medio, como la composición atmosférica, la temperatura y el pH. Además, se han estudiado aplicaciones de medios nutritivos diluidos en combinación con largos periodos de incubación, así como, el cultivo conjunto de microorganismos de diferentes especies. En los últimos años, se han desarrollado algunos métodos de cultivo fundamentalmente nuevos basados en la colocación de microorganismos en el entorno natural sin el uso de medios nutritivos. Estos métodos utilizan cámaras de difusión y revestimientos de polímero en los que se colocan las células microbianas. En este caso, los microorganismos reciben todos los nutrientes necesarios del entorno natural, permaneciendo aislados de él. La asignación de un nuevo productor de antibióticos (teixobactina) utilizando tales métodos se considera un logro importante. Otro enfoque incluye el cultivo y cribado simultáneo de decenas y cientos de miles de microcolonias bacterianas en chips de aislamiento de polímero poroso o de cerámica. Para el cultivo de microorganismos «no cultivables», también se pueden utilizar métodos que permiten el aislamiento de células individuales de entornos naturales. Entre estos métodos, los más populares se basan en la dilución de la suspensión de microorganismos, la citometría de flujo y la clasificación celular, la microdisección láser, la compartimentación y la aplicación de micromanipuladores. Además del cultivo de especies de microorganismos no cultivadas previamente, el aislamiento de células microbianas individuales es necesario para el estudio de la fisiología celular, las interacciones entre células, así como para la búsqueda de nuevos metabolitos, como antibióticos y enzimas.
El progreso científico y tecnológico moderno ofrece muchas oportunidades en cuanto al desarrollo de métodos novedosos para el cultivo, el aislamiento, la manipulación y el estudio de células bacterianas individuales y sus consorcios. Los nuevos enfoques pueden acelerar significativamente el proceso de trabajo con los microorganismos y permitir llevar a cabo sus estudios más completos y exhaustivos. Es necesario señalar que hasta ahora se han propuesto muy pocos métodos para posicionar matrices de bacterias con una precisión micrométrica. En Akselrod et al., se formaron redes tridimensionales (3D) de células vivas en hidrogeles sin pérdida de su viabilidad utilizando matrices de trampas ópticas holográficas multiplexadas (pinzas) con una precisión sin precedentes (<400 nm). Para formar las trampas ópticas se utilizaron dos láseres: Láser Ar+ (20 W, 514 nm de longitud de onda) y láser de Ti: Zafiro de onda continua, sintonizable en el rango de λ = 850-900 nm, así como una combinación de dos elementos de difracción, combinados con diferentes lentes en un microscopio óptico invertido. Se formaron redes de fibroblastos 3T3 rodeados por un anillo de bacterias. También se demostró la capacidad de manipular cientos de bacterias Pseudomonas aeruginosa simultáneamente en matrices bidimensionales (2D) y 3D. El método de atrapamiento óptico holográfico es muy preciso pero técnicamente difícil de realizar.
En el estudio de Rowan et al. se propone el método de funcionalización heterogénea de superficies, que es un proceso litográfico de cuatro pasos basado en la impresión por microcontacto de monocapas orgánicas, la implantación de polímero hiperramificado y su posterior funcionalización. Como resultado, se obtienen estructuras sobre las que se realiza la inoculación dirigida de células bacterianas. Las investigaciones sobre la supervivencia celular han demostrado que las células permanecen viables en las superficies estructuradas obtenidas. Se obtuvieron grandes aislamientos de bacterias que contenían 18 ± 5 bacterias y pequeños aislamientos que contenían 2 ± 1 bacterias. Según este trabajo, el método demostrado puede utilizarse para el cribado de alto rendimiento y la biodetección. Sin embargo, es difícil combinar la funcionalización heterogénea de las superficies mediante este método con la investigación biológica rutinaria y las condiciones de cultivo de los microorganismos (temperatura, pH, nutrientes, etc.). Es necesario señalar que la tarea de encontrar formas sencillas de proporcionar una alta resolución de matrices de bacterias vivas con la oportunidad de realizar diversos estudios biológicos fue resuelta en algunas publicaciones. Los enfoques propuestos en estos trabajos son, de hecho, los precursores de la impresión 3D.
En un estudio de Weibel et al. se propuso la técnica de estampación de bacterias vivas en placas de agarosa. Se imprimieron matrices de bacterias (el tamaño de una sola mancha con bacterias >200 µm) en un área de hasta 50 cm2. Se produjeron sellos de polidimetilsiloxano (PDMS) con la ayuda de la técnica fotolitográfica. El tamaño mínimo alcanzado de la protuberancia de la impresión fue de 190 µm a una altura de 140 µm, que, sin embargo, está lejos del tamaño necesario para separar las bacterias. Este método es rápido, reproducible y cómodo y puede utilizarse para controlar el patrón, el espaciado y la orientación entre las colonias de diferentes bacterias. En el estudio de Xu et al., se imprimieron matrices de bacterias vivas con resolución celular en un sustrato de agarosa utilizando sellos elastoméricos (PDMS) con una alta relación de aspecto, obtenidos por el método de litografía inversa in situ (RISL). La figura 1 muestra las ventajas del método RISL sobre la fotolitografía ultravioleta estándar. La única limitación de la tecnología RISL es el diámetro de la protuberancia, que apenas puede ser de <1 µm debido al límite de difracción óptica.
Las ventajas del método RISL sobre la fotolitografía ultravioleta estándar. » Reimpreso con permiso de (Xu L, Robert L., Ouyang Q., Taddei F., Chen Y., Lindner A. B., Baigl D. Impresión por microcontacto de matrices de bacterias vivas con resolución celular//Nano Lett. -2007. Vol. 7 – № 7. – P. 2068-2072). Copyright (2007) American Chemical Society.»
El método de impresión por microcontacto de matrices de bacterias funciona como sigue: La gota de Escherichia coli en el medio de cultivo LB se deposita en el gel de agarosa (3 % en peso en LB) y, en el sustrato de agarosa, se forma una monocapa de bacterias (el líquido es absorbido por el gel de agarosa). A continuación, el sello de PDMS entra en contacto con la monocapa de bacterias que cubre el gel de agarosa. El sello se retira, y la parte de bacterias permanece en él. A continuación, al entrar en contacto el sello con la capa de gel de agarosa (4 wt% en LB, espesor 200 µm), las bacterias se transfieren a la capa de agarosa. Así, en pocos segundos, se pueden imprimir matrices de bacterias E. coli directamente sobre el sustrato de agarosa con una resolución de micras, hasta bacterias individuales, en una gran superficie (cm2). Se demostró que, una vez impreso el patrón, las bacterias siguen creciendo y dividiéndose, como en las condiciones de cultivo masivo, es decir, las bacterias conservan su comportamiento fisiológico normal después de la impresión. También se demostró que la concentración de agarosa es crucial para un buen rendimiento de la impresión. Una concentración demasiado baja conduce a una distorsión del patrón impreso, mientras que una concentración demasiado alta no es adecuada para el cultivo de bacterias. Para obtener matrices de bacterias individuales, se estudió el efecto de la reducción de la concentración inicial de bacterias en una gota del medio de cultivo LB. Para las concentraciones iniciales de 109 y 108 células/ml, el número medio de bacterias por punto se midió en 12,1 y 1,4, respectivamente. Se obtuvo una distribución muy estrecha en la baja concentración de bacterias: El 44,6% de las manchas tenían una sola célula de E. coli y el 40,1% de las manchas tenían 0 o 2 células. Estos resultados demostraron que la impresión por microcontacto permite la producción de matrices regulares de bacterias individuales. Además, se demostró que este enfoque para la separación de matrices de bacterias permite analizar las tasas de crecimiento de líneas individuales de bacterias. Esta metodología proporciona una forma sencilla de realizar cualquier distribución espacial 2D deseada de bacterias y puede utilizarse tanto para el cribado como para los estudios de variación fenotípica bacteriana, la dinámica de poblaciones y la evolución de los ecosistemas.
Un área de rápido desarrollo -la sociomicrobiología- ha identificado los mecanismos con la ayuda de los cuales las bacterias participan en las relaciones colaborativas y competitivas influyendo en los vecinos cercanos a través del contacto físico y la modificación de la composición química de su microambiente común. Para explorar el comportamiento de pequeños agregados microbianos, se han desarrollado diferentes tecnologías de microprocesamiento que limitan las bacterias en dispositivos microfluídicos, microrresonadores y gotas de líquido de volumen ultrabajo. La capacidad de integrar los sistemas analíticos con la microfluídica ha hecho que estas plataformas de aislamiento sean atractivas para el cribado de alto rendimiento de la resistencia a los antibióticos y el análisis de la actividad enzimática. Por ejemplo, en Eun et al. se describe un análisis y aislamiento de alto rendimiento de células bacterianas encapsuladas en micropartículas de agarosa con el uso de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se utilizaron sistemas microfluídicos de enfoque de flujo para crear micropartículas monodispersas con un diámetro de ≈30 µm. El tamaño de estas partículas las hizo compatibles con la citometría de flujo y la FACS, y la sensibilidad de estos métodos redujo el tiempo de incubación para la replicación celular antes de llevar a cabo los análisis. El pequeño volumen de las micropartículas (≈1-50 picolitros ) minimizó el número de reactivos necesarios para los estudios bacterianos. Esta plataforma permitió asignar y aislar bacterias de forma eficaz, así como utilizar la combinación de métodos para la rápida identificación de objetivos de pequeñas moléculas biológicamente activas. Como demostración experimental de este método, se encapsularon células de E. coli en micropartículas de agarosa, se incubaron en presencia de diferentes concentraciones de rifampicina y se analizaron con el uso de FACS. Se determinó la concentración mínima inhibitoria de rifampicina y se aislaron los mutantes espontáneos que presentaban resistencia al antibiótico con la ayuda de FACS y se caracterizaron mediante secuenciación del ADN. Con este método, el tiempo y la cantidad de antibióticos necesarios para aislar los mutantes se redujeron en 8 y 150 veces, respectivamente, en comparación con los métodos microbiológicos tradicionales que utilizan placas de agar nutritivo. Por lo tanto, este método es importante en los campos de la biología química, la química de los productos naturales, así como para el descubrimiento y la caracterización de metabolitos secundarios biológicamente activos.
Los enfoques mencionados anteriormente han sido útiles para limitar el tamaño, la forma y los atributos físicos (microhábitat); sin embargo, ninguno de ellos ha proporcionado la oportunidad de determinar la geometría 3D de los agregados bacterianos o la orientación de múltiples poblaciones de forma arbitraria. Además, el proceso de encapsulación de las células en cavidades de volumen ultrabajo suele limitar el transporte de masas, lo que conduce a condiciones incompatibles con el crecimiento y la señalización entre poblaciones físicamente aisladas. Un número creciente de pruebas destaca la importancia de las microcolonias en la reproducción bacteriana; sin embargo, se observa la falta de herramientas para la evaluación sistemática del comportamiento celular en dichas comunidades. Las nuevas estrategias para la creación de un entorno cultural 3D a escala microscópica pueden desempeñar un papel crucial en la identificación de cómo las bacterias gestionan la resistencia a los antibióticos y otros comportamientos sociales en pequeños agregados densos.
En Connell et al. y Connell et al. se describe el método de formación por láser de cámaras 3D microscópicas basado en la litografía multifotónica (MPL). El método MPL tiene una capacidad de alto rendimiento y la capacidad de producir patrones arbitrarios. Ofrece oportunidades para la producción industrial de microdispositivos 3D, como componentes microópticos, andamios para la ingeniería de tejidos y chips microfluídicos. En el estudio de Connell et al., se utilizó albúmina de suero bovino (BSA), una proteína altamente soluble que puede reticularse en hidrogeles porosos, duraderos y biocompatibles, para crear cámaras bacterianas microscópicas en 3D. En las cámaras de BSA se encerraron algunas bacterias separadas con un volumen de 1 pl y luego se cultivaron en poblaciones clonales. Debido a la difusión de moléculas biológicamente significativas y de antibióticos a través de las paredes de BSA, así como al intercambio de señales sensibles al quórum, se estudió el comportamiento social de las comunidades bacterianas en relación con el tamaño y la densidad de la población, la forma del contenedor y la velocidad de flujo del entorno.
Dentro del cuerpo humano, las bacterias suelen existir en comunidades 3D estructuradas formadas por varias especies bacterianas. Para obtener información detallada sobre el efecto de la geometría en la patogenicidad, en Connell et al. se describe una estrategia de impresión en 3D para comunidades bacterianas, en la que poblaciones físicamente distintas pero químicamente interactivas de un determinado tamaño, forma y densidad pueden organizarse esencialmente de cualquier forma (Figura 2). Utilizando este enfoque, se demostró que la estabilidad de una sola especie patógena de bacterias al antibiótico podría aumentar la resistencia de la segunda especie debido a sus relaciones 3D. Con la ayuda de la técnica litográfica láser, se formaron contenedores microscópicos de hasta 1 pl de volumen con un grosor de pared del contenedor de hasta 2 µm alrededor de bacterias seleccionadas suspendidas en gelatina mediante la reticulación de las moléculas polipeptídicas en la región focal debido a la absorción no lineal de la radiación láser por las moléculas fotosensibilizadoras. El resultado de esta absorción multifotónica es la formación de oxígeno singlete, que estimula las reacciones de reticulación covalente intramolecular e intermolecular entre la BSA y la gelatina. Las propiedades físicas y químicas únicas de la gelatina han motivado el interés en su uso para una variedad de aplicaciones, incluyendo el almacenamiento, la inmovilización y el cultivo 3D de bacterias. Una vez eliminado el exceso de reactivo, las bacterias se localizan en cavidades selladas formadas por gelatina reticulada, que es un material muy poroso y admite un rápido crecimiento de poblaciones celulares totalmente cerradas. Es fácilmente permeable a los polipéptidos, a los antibióticos y a las señales físicas y químicas con cuya ayuda se produce la interacción entre las bacterias. El aislamiento de células en microcontenedores ofrece la posibilidad de incrustar diferentes tipos/densidades de contenedores entre sí, así como de realizar cambios dinámicos en la orientación de las poblaciones enteras de bacterias dentro de la comunidad.
Impresión microtecnológica basada en gelatina en presencia de bacterias. (Izquierda) ingeniería de comunidades polimicrobianas (derecha) «Reimpreso de (Connell J.L., Ritschdorff E.T., Whiteley M., Shear J.B. Impresión en 3D de comunidades bacterianas microscópicas // Proc. Natl. Acad. Sci. – 2013. – Vol. 110 – № 46. – P. 18380-18385).»
Los autores han demostrado que las interacciones espacialmente localizadas del Staphylococcus aureus grampositivo y la bacteria P. aeruginosa gramnegativa (dos patógenos humanos que suelen formar coinfecciones persistentes en el interior de las heridas, los catéteres y el pulmón de los pacientes con mucoviscidosis) pueden aumentar la supervivencia del estafilococo en el tratamiento con los antibióticos β-lactámicos.
La impresión celular micro-3D amplía fundamentalmente las posibilidades de sondeo de la resistencia a los antibióticos cuando un solo microgrupo bacteriano puede afectar a la susceptibilidad a los antibióticos de las poblaciones adyacentes circundantes o incrustadas, una cuestión de especial relevancia para las infecciones in vivo (por ejemplo, heridas, cavidad oral y fibrosis quística pulmonar), donde los tejidos suelen estar colonizados por varias especies de bacterias simultáneamente. El verdadero poder de la impresión celular 3D reside en la capacidad de organizar las comunidades microbianas en una gama ilimitada de geometrías. La impresión celular micro-3D también puede ser una herramienta valiosa para las investigaciones de los mecanismos y la dinámica de las respuestas adaptativas a las condiciones ambientales.