Orejas biónicas impresas en 3D | CDhistory

El diseño y la implementación de órganos y dispositivos biónicos que mejoran las capacidades humanas, conocidos como cibernéticos, ha sido un área de creciente interés científico.1,2 Este campo tiene el potencial de generar partes de reemplazo personalizadas para el cuerpo humano, o incluso crear órganos que contengan capacidades más allá de lo que la biología humana proporciona ordinariamente. En particular, el desarrollo de enfoques para la integración directa y multidimensional de componentes electrónicos funcionales con tejidos y órganos biológicos podría tener un enorme impacto en la medicina regenerativa, las prótesis y las interfaces hombre-máquina.3,4 Recientemente, varios informes han descrito el acoplamiento de la electrónica y los tejidos mediante dispositivos planares flexibles y/o estirables y sensores que se ajustan a las superficies de los tejidos, lo que permite aplicaciones como la detección bioquímica y el sondeo de las actividades eléctricas en las superficies del corazón,5 de los pulmones,6 del cerebro,7 de la piel8 y de los dientes.9 Sin embargo, conseguir componentes electrónicos tridimensionales entrelazados sin fisuras con los tejidos y órganos biológicos es bastante más difícil.4

La ingeniería tisular se rige por el principio de que es posible inducir a diversos tipos de células a sintetizar nuevos tejidos si se las siembra en un andamio tridimensional de hidrogel adecuado dentro de un entorno de crecimiento acorde.10-15 Tras el cultivo in vivo o in vitro, se forman estructuras tisulares que poseen la morfología del andamio original.16 Sin embargo, uno de los principales retos de los enfoques tradicionales de la ingeniería tisular es la generación de implantes sembrados de células con estructuras que imitan el tejido nativo, tanto en las geometrías anatómicas como en las distribuciones celulares intratisulares.17 Se han utilizado técnicas como la siembra de células en moldes no adhesivos o andamios autoplegables para fabricar construcciones tisulares tridimensionales con geometrías 3D complejas.18,19 Sin embargo, las técnicas existentes siguen siendo incapaces de crear fácilmente piezas de órganos o tejidos con las heterogeneidades espaciales y las geometrías anatómicas precisas necesarias para hacer frente a la escasez de órganos de donantes para trasplantes.20-22 Por ejemplo, la reconstrucción total de la oreja externa con cartílago autógeno -con el objetivo de recrear una oreja de aspecto similar al pabellón auricular contralateral- sigue siendo uno de los problemas más difíciles en el campo de la cirugía plástica y reconstructiva.23

Las técnicas de fabricación aditiva, como la impresión 3D, ofrecen una posible solución gracias a la capacidad de crear rápidamente modelos de diseño asistido por ordenador (CAD) cortándolos en capas y construyendo las capas hacia arriba utilizando células biológicas como tintas, en las geometrías anatómicas precisas de los órganos humanos.24-27 Se han utilizado variaciones de la impresión 3D como métodos de fabricación de formas libres sólidas, aunque su uso se ha limitado principalmente a la creación de piezas mecánicas pasivas.24,28 La impresión 3D basada en la extrusión se ha utilizado para diseñar andamios de tejido duro como meniscos de rodilla y discos intervertebrales completos con células encapsuladas.29-Esta técnica ofrece la posibilidad de crear estructuras multimateriales espacialmente heterogéneas mediante la utilización de herramientas de deposición que pueden extruir una amplia gama de materiales.32 Además, los bloques de construcción funcionales a nanoescala permiten un montaje versátil de abajo arriba de componentes a macroescala que poseen funcionalidades ajustables. Esto podría permitir la impresión simultánea de materiales nanoelectrónicos y células biológicas para producir tejidos y órganos cibernéticos integrados tridimensionalmente que presenten capacidades únicas.33,34

Aquí presentamos un enfoque conceptualmente nuevo que aborda los desafíos mencionados al entrelazar completamente los componentes electrónicos funcionales con el tejido biológico a través de la impresión 3D de materiales nanoelectrónicos e hidrogeles viables sembrados de células en las geometrías anatómicas precisas de los órganos humanos. Dado que los circuitos electrónicos son el núcleo de los dispositivos sensoriales y de procesamiento de la información35 , el cultivo in vitro de la arquitectura híbrida impresa permite el crecimiento de «órganos cibernéticos» que presentan funcionalidades mejoradas respecto a la biología humana. Nuestro enfoque ofrece la posibilidad de definir y crear construcciones espacialmente heterogéneas mediante la extrusión de una amplia gama de materiales en un proceso capa por capa hasta completar la geometría estereolitográfica final. Este concepto de impresión en 3D de células vivas junto con componentes electrónicos y su cultivo para convertirlas en órganos funcionales representa una nueva dirección en la fusión de la electrónica con los sistemas biológicos. De hecho, estos órganos cibernéticos son distintos de los tejidos de ingeniería o de la electrónica conformada plana/flexible y ofrecen una forma única de lograr una fusión tridimensional de la electrónica con el tejido.

Como prueba de concepto de este enfoque, evaluamos la capacidad de la impresión 3D para crear un pabellón auditivo viable que también contiene componentes electrónicos que permiten capacidades alternativas a la audición humana. Los órganos humanos compuestos predominantemente por tejido cartilaginoso, como el pabellón auricular, representan candidatos prototipos adecuados para investigar la viabilidad de nuestro enfoque. Esto se debe a: 1) la complejidad inherente a la geometría anatómica de la oreja, que dificulta la bioingeniería a través de los enfoques tradicionales de ingeniería de tejidos, así como 2) la simplicidad de su estructura a nivel de tejido cartilaginoso debido a la falta de vasculatura.23,36 Además, el ensamblaje ascendente de matrices nanoelectrónicas proporciona la capacidad de generar jerárquicamente componentes electrónicos funcionales a macroescala. En concreto, demostramos la impresión en 3D de una matriz de hidrogel de alginato sembrada de condrocitos con una antena de bobina inductiva infundida de nanopartículas de plata (AgNP) eléctricamente conductora, que se conecta a electrodos con forma de cóclea soportados en silicona. En conjunto, el resultado es la integración tridimensional de componentes electrónicos funcionales dentro de la compleja y precisa geometría anatómica de un oído humano (Fig. 1).

El proceso consta de los siguientes pasos. En primer lugar, se utiliza un dibujo CAD de la oreja biónica (Fig. 1A) para prescribir la geometría anatómica y la heterogeneidad espacial de los distintos materiales funcionales. Como se ha descrito anteriormente, tres materiales componen los tres componentes funcionales (estructural, biológico y electrónico) de la oreja biónica. Estos materiales se introducen en una impresora 3D Fab@Home basada en la extrusión con jeringa (The NextFab Store, Albuquerque, NM) (Fig. 1B). A continuación, la construcción de la oreja híbrida bioelectrónica impresa se cultiva in vitro para permitir el crecimiento del tejido cartilaginoso y formar una oreja cibernética con la capacidad de detectar señales electromagnéticas en el rango de la radiofrecuencia (RF) por medio de una bobina inductiva que actúa como antena receptora (Figura 1C).

Para demostrar nuestro enfoque, imprimimos la construcción de la oreja biónica de la siguiente manera. Para el andamio, presembramos una matriz de hidrogel de alginato con condrocitos viables a una densidad de ~60 millones de células/mL (véase la información de apoyo). La matriz de alginato es tridimensionalmente estable en cultivo, no es tóxica, es compatible con la pre-siembra y la extrusión, y es un vehículo adecuado para el suministro de células porque la reticulación puede iniciarse antes de la deposición.37 Los condrocitos utilizados para la impresión se aislaron del cartílago articular de terneros de un mes de edad (Astarte Biologics, Redmond, WA). Se utilizó un dibujo CAD de un pabellón auricular humano en formato de estereolitografía (STL) con una antena de bobina circular integrada conectada a electrodos con forma de cóclea para definir las trayectorias de impresión cortando el modelo en capas de contorno y trayectorias de relleno de trama. La reticulación se inició en la matriz de hidrogel de alginato presembrada con condrocitos viables, que luego se imprimió en 3D junto con soluciones de silicona conductoras (infundidas con AgNP) y no conductoras (Película 1). En conjunto, este método produjo los componentes biológicos, electrónicos y estructurales del órgano biónico en un solo proceso.

La figura 2A muestra la oreja biónica impresa en 3D inmediatamente después de la impresión. En particular, se observa que reproduce fielmente el dibujo CAD, en la espacialidad precisa para cada material según lo dictado por el diseño. La construcción de la oreja impresa se sumergió en un medio de cultivo de condrocitos que contenía un 10% o un 20% de suero bovino fetal (FBS), que se refrescaba cada 1-2 días (véase la información de apoyo). La oreja híbrida mostró una buena integridad estructural y una buena retención de la forma durante el cultivo (Fig. 2B). Con el tiempo, la construcción se volvió gradualmente más opaca; esto fue más evidente después de cuatro semanas de cultivo, y es groseramente consistente con el desarrollo de una matriz extracelular (ECM). La morfología general de la oreja biónica tras 10 semanas de cultivo in vitro se muestra en la información de apoyo.

La viabilidad se comprobó inmediatamente antes y durante las distintas fases del proceso de impresión. La viabilidad inicial de las células se determinó tras el cultivo utilizando un ensayo de exclusión celular con azul de Tripán (Corning Cellgrow, Mediatech, VA) y se comprobó que era del 96,4 ± 1,7% (Fig. 2C) (véase la información de apoyo). La oreja de alginato impresa y sembrada de células también se probó con un ensayo de viabilidad LIVE/DEAD® (Molecular Probes, Eugene, OR) y mostró una viabilidad celular del 91,3 ± 3,9% con una distribución homogénea de los condrocitos. Este resultado sugiere que el proceso de impresión, incluyendo la encapsulación y la deposición de las células, no tiene un impacto apreciable en la viabilidad de los condrocitos.

En particular, este enfoque de impresión de una matriz de hidrogel presembrada elimina los principales problemas asociados con las limitaciones de la profundidad de siembra y la siembra no uniforme en los métodos tradicionales de siembra de andamios 3D premoldeados. La siembra de condrocitos en una matriz de alginato bioabsorbible y su conformación mediante impresión 3D localiza las células en una geometría deseada, lo que permite la producción de nueva ECM en lugares definidos cuando se cultiva en medios nutritivos. A medida que el tejido se desarrolla, el andamio polimérico se reabsorbe (Fig. 2D), de modo que el nuevo tejido conserva la forma del polímero en el que se sembraron las células. El andamio biodegradable proporciona a cada célula un mejor acceso a los nutrientes y una eliminación de residuos más eficiente.

A continuación, se utilizó la evaluación histológica para comparar la morfología de los condrocitos en el neocartílago de la oreja biónica con la del tejido cartilaginoso nativo. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) reveló una distribución uniforme de los condrocitos en las construcciones (Fig. 2E) (véase la información de apoyo). La histología del tejido auricular con tinción de Safranin O indicó una acumulación relativamente uniforme de proteoglicanos en el tejido auricular cultivado (Fig. 2F). Estos datos bioquímicos son coherentes con el desarrollo de un nuevo cartílago.38 Por último, se utilizaron mediciones fluorescentes para determinar la viabilidad del tejido auricular biónico impreso en 3D tras 10 semanas de cultivo in vitro utilizando tinciones de diacetato de fluoresceína (FDA) y yoduro de propidio (PI). Las figuras 2G y 2H muestran el tejido que cubre la antena de la bobina y el tejido interno que está en contacto con el electrodo que atraviesa perpendicularmente el tejido, respectivamente. En ambos casos, el cartílago cultivado mostraba una excelente morfología y viabilidad a nivel de tejido. En particular, este enfoque de cultivo de tejido en presencia de materiales electrónicos abióticos podría minimizar la respuesta inmunitaria del tejido cultivado.

A continuación, caracterizamos las propiedades mecánicas del cartílago en varias etapas de crecimiento, ya que el desarrollo de la ECM está fuertemente correlacionado con las propiedades mecánicas del tejido en desarrollo.39 En primer lugar, se realizaron amplias caracterizaciones bioquímicas e histológicas. Se extrajeron muestras de los cultivos que contenían un 10% y un 20% de FBS a las 2, 4, 6, 8 y 10 semanas y se congelaron para medir el contenido de ADN del neocartílago y para la evaluación bioquímica de la MEC (véase la información de apoyo). La acumulación de ECM en las construcciones se evaluó cuantificando la cantidad de dos componentes importantes de la ECM: 1) hidroxiprolina (HYP) como marcador del contenido de colágeno, y 2) glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) como marcador de proteoglicanos. En la semana 10, el contenido de HYP aumentó a 1,2 ± 0,1 μg/mg y 1,4 ± 0,2 μg/mg para los cultivos que contenían 10% y 20% de FBS, respectivamente (Fig. 3A). Los valores correspondientes del contenido de GAG para la semana 10 fueron de 10,6 ± 0,6 μg/mg y 12,2 ± 1,0 μg/mg (Fig. 3B). Este aumento en el contenido de GAG e HYP indica que los condrocitos están vivos y metabólicamente activos en el cultivo.