La respuesta ocular a una inyección intracameral
Se ha sugerido que las células monocíticas F4/80+ centrales para la inducción de la ACAID eran células residentes del iris y del cuerpo ciliar que emigraban del iris a través del canal de Schlemm1,6,10 hacia la circulación. Dado que el antígeno está presente en el ojo durante al menos 24 horas, el antígeno podría tener un efecto de «depósito», aunque parte del antígeno está en la circulación rápidamente después de la inyección intracameral del antígeno.8 Dado que la inyección intracameral del antígeno induce la aparición de PBMC inductoras de ACAID, es probable que sean estas células monocíticas, y no el antígeno circulante por sí solo, las que induzcan la ACAID.
Una inyección intravítrea de antígeno induce una infiltración de células monocíticas en la retina como fase inicial de la uveítis.11,12 Además, la infección ocular induce un fuerte infiltrado inflamatorio en la cámara posterior o anterior.12-14 En consonancia con dicha inflamación, se produce un aumento de las citoquinas inflamatorias en los fluidos oculares, como el humor acuoso. En consecuencia, una inyección intracameral de antígeno particulado induce un aumento del ARNm del TNF-α, lo que sugiere una respuesta inflamatoria temprana en la cámara anterior.14,15 Además, la supresión sistémica de la hipersensibilidad de tipo retardado no se induce en los ratones que reciben una inyección intracameral de anticuerpos contra el TNF-α junto con el antígeno, lo que sugiere que el TNF-α es necesario durante la inducción de la ACAID. Además, la inducción de la ACAID en estas investigaciones dependía del calibre de la aguja utilizada para la inyección intracameral de proteínas solubles y de si el antígeno estaba en forma particulada o soluble.15 Estos autores sugirieron que la inyección intracameral de antígenos particulados y/o el tamaño de la aguja utilizada para las inyecciones intracamerales induce un traumatismo necesario para inducir la ACAID. Los macrófagos y las células dendríticas que expresan el marcador de células dendríticas CD11c residen en el iris, el cuerpo ciliar y la coroides del segmento anterior.8,10,16,17 El antígeno inyectado en la cámara anterior es absorbido rápidamente por estas células. Además, los macrófagos y las células dendríticas se encuentran cerca del canal de Schlemm17,18 y se cree que es el lugar de salida de las células F4/80+ de la cámara anterior a la circulación.1 Sin embargo, se ha cuestionado la salida de las células residentes del iris que absorben el antígeno a la circulación.16 El antígeno soluble sale rápidamente de la cámara anterior a través de la circulación y se distribuye de forma similar al antígeno intravenoso.8 Parte del antígeno que sale del ojo podría estar en forma tolerogénica.19 Sin embargo, es probable que el antígeno intracameral sea presentado en el timo y el bazo por las llamadas «células presentadoras de antígeno tolerogénicas» que salieron del ojo con el antígeno. Además, el TGF-β en el humor acuoso o producido por las células F4/80+ del iris induce un fenotipo supresivo en las células F4/80+ periféricas10,20,21 lo que sugiere que la inducción de un fenotipo supresivo en las células F4/80+ se produce en la cámara anterior.
De forma similar al tratamiento de las células F4/80+ periféricas con humor acuoso y antígeno, la incubación de las células F4/80+ del exudado peritoneal con antígeno y TGF-β in vitro impone un fenotipo supresivo en las células. Cuando estas células se inyectan iv en ratones ingenuos, inducen células T reguladoras esplénicas específicas de antígeno similares a las obtenidas mediante la inyección intracameral de antígeno.21 La ACAID es inducida por muy pocas células F4/80+ tratadas de esta manera1 lo que sugiere que las células (indetectables) que emigran del iris y del cuerpo ciliar pueden inducir la ACAID. Además, las células F4/80+ del iris recuperadas de ratones que recibieron una inyección intracameral de antígeno inducen la inducción de ACAID o confieren a las PBMC F4/80+ un fenotipo supresor similar al de las células circulantes recuperadas de ratones que recibieron una inyección intracameral de antígeno.9,21 Es probable que el antígeno captado y procesado por las células presentadoras de antígeno del iris pueda ser transferido a las PBMC que se infiltraron en la cámara anterior del mismo modo que el antígeno es transferido a las células B inductoras de ACAID en el bazo por las células del exudado peritoneal tratadas con TGF-β.22 En conjunto, estas observaciones sugieren que los eventos que ocurren dentro de la cámara anterior podrían inducir un fenotipo supresivo en las células inflamatorias no residentes que se infiltran en la cámara anterior.
Basado en las consideraciones anteriores, investigamos la posibilidad de que la inyección intracameral de antígeno induzca una afluencia de PBMC circulantes a la cámara anterior debido al traumatismo de la inyección. Estas células infiltradas estarían expuestas al TGF-β inmunosupresor del humor acuoso y a las células dendríticas residentes del iris/cuerpo ciliar que podrían presentar el antígeno inyectado a las PBMC infiltradas. En consonancia con esta hipótesis, las células que fueron reclutadas a la cámara anterior debido a la lesión causada por la inyección luego recirculan y se dirigen al timo y al bazo donde inducen a las células T reguladoras.
Dentro de las 3 horas posteriores a la inyección intracameral de ovoalbúmina (OVA) también encontramos un aumento de TNF-α en el humor acuoso como lo describen Ferguson et al.15 Además, hemos observado un aumento de la quimiocina MCP-1 en el humor acuoso seis horas después de la inyección intracameral (Fig. 1). Un pinchazo de aguja sin inyección de PBS indujo la aparición de TNF-α en el humor acuoso y la inyección de PBS sólo aumentó la cantidad de TNF-α cinco veces más que la obtenida por un pinchazo de aguja. El TNF-α en el humor acuoso disminuye rápidamente y no se detecta 12 horas después de la inyección intracameral de ovoalbúmina (OVA) (datos no mostrados). El MCP-1 se mantiene en el humor acuoso durante más tiempo. Sin embargo, a diferencia del TNF-α, los niveles máximos de MCP-1 se alcanzan en el humor acuoso a las 12 horas y se mantienen hasta 16 horas después de la inyección intracameral de OVA (datos no mostrados). Este aumento de los niveles de TNF-α y MCP-1 en el humor acuoso tras la inyección intracameral del antígeno sugiere el inicio de una respuesta inflamatoria en la cámara anterior. Además, el TNF-α no aumenta en el humor acuoso ni se induce ACAID si la aguja utilizada para la inyección intracameral es demasiado pequeña y/o el antígeno no es inflamatorio.15
La inyección intracameral de antígeno eleva el TNF-a y el MCP-1 en el humor acuoso. Tres-6 horas después de que los ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad recibieran por vía intravenosa 5 × 106 – 1 × 107 PBMC marcadas con CFSE, los ratones fueron anestesiados con una inyección ip de ketamina/xilazina7 y recibieron una inyección intracameral de PBS, PBS + 50 μg de OVA o un pinchazo sólo con una aguja de 24 g. Seis horas después de que los ratones ingenuos recibieran una inyección intracameral, se recuperó el humor acuoso de los ratones eutanasiados y se analizaron 10 μl mediante ELISA para TNF-α y MCP-1. Los datos representan la media +/- S.E.M. pg detectados a partir de 4-6 réplicas/grupo en 2-3 experimentos.
Para determinar si hay una afluencia concomitante de células inflamatorias en la cámara anterior tras la inyección intracameral de antígeno, los ratones inyectados iv con PBMC marcadas con el colorante fluorescente CFSE también recibieron una inyección intracameral. Utilizando este enfoque, observamos una afluencia significativa de células monocíticas F4/80+ marcadas con CFSE y no marcadas (huésped) que expresan los receptores de quimiocinas CCR2 y CCR5, como lo demuestra la recuperación de estas células de los iris de los ratones 24 horas después de que los ratones recibieran una inyección intracameral de antígeno. No hubo aumento de estas células en los controles que recibieron PBMC marcadas con CFSE iv pero que no recibieron una inyección intracameral de antígeno.23 Aproximadamente 48 h después de la inyección intracameral de antígeno, el número de células infiltradas en el iris disminuye y aumenta en el timo y el bazo (Fig. 2). Este aumento de las células monocíticas circulantes en el iris se debe probablemente a una infiltración de monocitos circulantes en respuesta al traumatismo de la inyección intracameral +/- el irritante de PBS y/o antígeno/PBS porque el número de células monocíticas infiltradas aumentó cuando los ratones recibieron el antígeno intracameral: la infiltración de PBMC marcadas con CFSE inducida sólo por la inyección fue <inyección de PBS <inyección de TNP-BSA/PBS. Las células monocíticas reclutadas al iris tras la inyección intracameral de antígeno expresan tanto CCR2 como CCR5.23 La migración de las células al iris requiere la expresión de CCR2 pero no de CCR5 porque las PBMC CCR2 -/- no se dirigen al iris pero las PBMC CCR5 -/- se dirigen al iris tras la inyección intracameral de antígeno. Además, la inyección intracameral de OVA en ratones CCR2 -/ no induce células monocíticas circulantes que transfieran la supresión de la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) al OVA cuando se inyecta por vía intracameral en receptores de tipo salvaje.23
Migración de las PBMC tras la inyección intracameral. Ratones BALB/c anestesiados recibieron una inyección intracameral de albúmina bovina trinitrofenilada seis horas después de que los ratones recibieran por vía iv 5 × 106 -1 × 107 PBMC marcadas con CFSE. Veinticuatro horas después de la inyección intracameral, los ratones fueron eutanasiados por inhalación de CO2 y se les extrajo el iris, el bazo y el timo, se agruparon y se prepararon suspensiones de células individuales. Las células se marcaron con ficocianina-anti-F4/80 y se analizaron por citometría de flujo. El incremento porcentual de células CFSE, F480+ se calculó mediante: