Implicaciones estructurales
El resultado de la modificación de la proteína mutante que contiene cisteína (K41C) con bromoetilamina es una enzima muy relacionada con la RNasa A de tipo salvaje. La diferencia entre las dos proteínas debe residir en las diferencias entre un grupo tioéter y un grupo metileno. Aunque los ángulos de los enlaces C-S-C tienden a ser más agudos que los de los enlaces C-CH2-C, esta diferencia se ve compensada por la mayor longitud de los enlaces C-S.3g,14 La modelización molecular indica que los grupos aminos primarios de la S-etilaminocisteína y la lisina pueden superponerse con una precisión de 0,1 Å. Una diferencia más significativa entre la S-etilaminocisteína y la lisina es su relativa preferencia por los ángulos de torsión gauche en lugar de anti.15 La conformación anti de los enlaces CC-CC se ve favorecida por aproximadamente 0,8 kcal/mol en los compuestos modelo.16 De hecho, el ángulo de torsión K41 medio es de (175 ± 3)° en el complejo de la RNasa A con el vanadato cíclico de 2′,3′-uridina (U>v), un análogo putativo del estado de transición (Figura 2). A diferencia de los enlaces CC-CC, la conformación gauche de los enlaces CS-CC se ve favorecida por 0,05-0,20 kcal/mol.17 El modelado molecular indica que el enlace CS-CC de un residuo de S-etilaminocisteína en la posición 41 puede estar en la conformación gauche sin alterar la estructura de la proteína nativa. Por lo tanto, es probable que las cadenas laterales de tioéter en la posición 41 sean menos rígidas y extendidas que las cadenas laterales de alquilo. Por lo tanto, suponemos que la catálisis de la enzima S-etilaminocisteína no es tan eficiente como la de la RNasa A de tipo salvaje debido al coste entrópico de fijar un tioéter en la conformación totalmente anti.
Estructura del sitio activo de la RNasa A unido al vanadato de uridina 2′,3′-cíclico. La estructura se refinó a 2,0 Å a partir de datos de difracción de rayos X y de neutrones recogidos de cristales cultivados a pH 5,3. La cadena lateral de fenilalanina 120 y la base de uracilo no se muestran.
La eficacia catalítica depende de la longitud de la cadena lateral del residuo 41. Las variantes de RNasa A que presentan un grupo amino al final de una cadena lateral más larga que la de la lisina son catalizadores más activos que la RNasa A K41C no modificada. Sin embargo, las enzimas en las que un grupo amino en la posición 41 está separado de la cadena principal por 4 átomos son más activas que las que están separadas por 5 átomos. Este resultado podría surgir de la entropía conformacional adicional o de los ángulos de torsión desfavorables de las cadenas laterales más largas.
No se obtiene ninguna ventaja significativa si el residuo 41 puede donar un segundo enlace de hidrógeno. Los grupos guanidino y acetamidino tienen el potencial de interactuar simultáneamente con más de un oxígeno de un grupo fosforilo. Por ejemplo, un grupo guanidino es utilizado para unir grupos fosforilo por la proteína Tat del VIH-118 y por receptores artificiales.19 Además, en la nucleasa estafilocócica y en las ribonucleasas de la familia T1, una arginina parece desempeñar el papel de K41 en la RNasa A.20 Hemos sustituido K41 por un residuo de arginina y un residuo S-acetamidino, que es un análogo corto de la arginina. Los valores de ΔΔG‡ para estas enzimas son menores que los de las enzimas análogas con sólo un grupo amino primario en la cadena lateral de la posición 41. Por lo tanto, un enlace de hidrógeno parece ser suficiente para efectuar una catálisis eficiente. Este resultado es coherente con el complejo cristalino de la RNasa A con el U>v (Figura 2). El grupo vanadilo en el U>v es una bipirámide trigonal aproximada con dos oxígenos ecuatoriales no puenteados, O1V y O3V. El oxígeno O1V acepta un enlace de hidrógeno de la cadena lateral de la glutamina 11 mientras que el O3V acepta un enlace de hidrógeno de la cadena principal de la fenilalanina 120. Sólo O1V está en posición de aceptar un enlace de hidrógeno de K41.
Implicaciones Mecánicas. El papel catalítico más comúnmente atribuido a K41 es el de estabilizar el exceso de carga negativa acumulada en los oxígenos fosforilo no puenteados durante la escisión del ARN (Figura 2). La acumulación de carga podría ocurrir en un estado de transición pentacoordinado (o intermedio fosforano) cuando el grupo hidroxilo 2′ ataca al fósforo, en el camino a desplazar el nucleósido 5′. Se ha supuesto que esta estabilización se produce por interacciones culombianas.12c,21 Pero, también se ha propuesto recientemente que la estabilización se produce por medio de un enlace de hidrógeno corto y fuerte que implica la transferencia parcial de un protón de K41.22
Las características más destacadas de un residuo de lisina son su carga positiva y su capacidad para donar enlaces de hidrógeno. Tres de las 5 enzimas semisintéticas, así como la K41R, comparten estas características. No es sencillo diferenciar entre una interacción basada únicamente en las fuerzas culombianas y otra basada en los enlaces de hidrógeno entre dos especies cargadas. Lo que sigue es la explicación más sencilla que es coherente con los datos de la Tabla 1.
La distinción entre los enlaces de hidrógeno y las fuerzas coulómbicas es más evidente en ninguna parte que en una comparación de la enzima S-etiltrimetilaminocisteína, que posee una carga positiva terminal pero no tiene capacidad para donar un enlace de hidrógeno, y la enzima S-acetamidocisteína, que tiene una amida N-H para la donación potencial de enlaces de hidrógeno pero carece de carga positiva. La baja actividad catalítica de la enzima S-etiltrimetilaminocisteína es un fuerte argumento contra la eficacia de las fuerzas culombianas en la estabilización del estado de transición. En igualdad de condiciones, la energía de una interacción carga-carga disminuye sólo como la inversa de la distancia. Los grupos metílicos imponen una mayor distancia entre la carga positiva de la cadena lateral y los oxígenos del fosforilo, en relación con la de la enzima S-etilaminocisteína. Sin embargo, es poco probable que esta distancia sea lo suficientemente grande como para causar la reducción observada de >103 veces en el kcat/Km, especialmente porque los tres grupos metilo podrían acomodarse fácilmente en la vecindad de los oxígenos fosforilo (Figura 2).
Se espera que la fuerza de un enlace de hidrógeno se correlacione inversamente con el pKa del protón que se dona, ya que el enlace de hidrógeno implica algún grado de transferencia de protones.23 Como se muestra en la Tabla 1, los aumentos de pKa se corresponden efectivamente con disminuciones de ΔΔG‡ para enzimas semisintéticas que tienen cadenas laterales de longitud comparable. Para aquellas enzimas semisintéticas en las que las longitudes de las cadenas laterales son comparables a la lisina, la correlación es, sin embargo, no lineal. Esta falta de linealidad podría deberse a que el pKa de cada cadena lateral depende de su entorno particular en la proteína nativa. De hecho, se ha determinado que el pKa de la Lys41 es de 9,0,24 y no de 10,6 como se indica para el ion butilamonio en la Tabla 1. Las diferentes cadenas laterales pueden verse afectadas en diferente medida. Otra fuente de no linealidad, quizás más significativa, es que las especies cargadas tienden a participar en enlaces de hidrógeno más fuertes que las especies no cargadas. Este fenómeno se ha observado en las proteínas25 y en las moléculas pequeñas, incluidas las aminas.26 La comparación de enzimas semisintéticas con cadenas laterales que son isostéricas pero que difieren en la carga formal debería revelar esta tendencia. Por ejemplo, en las enzimas S-acetamidinocisteína y S-acetamidocisteína, las cadenas laterales en la posición 41 son idénticas excepto por uno de los dos heteroátomos unidos al carbono terminal. Sin embargo, la diferencia en la capacidad de estas dos cadenas laterales isológicas para unirse al estado de transición es mayor que la esperada a partir de sus acidez. Aquí, el enlace de hidrógeno donado por una acetamidina cargada es 4 kcal/mol más fuerte que el de una amida no cargada. Este valor coincide con otros datos sobre la fuerza relativa de los enlaces de hidrógeno cargados y no cargados en las interacciones proteína-ligando.21 Por último, cabe destacar que aunque la cadena lateral S-acetamido carece de carga formal y tiene un pKa relativamente alto, sigue contribuyendo (aunque modestamente) a la catálisis. Este resultado proporciona más pruebas de la importancia para la catálisis de un enlace de hidrógeno donado por el residuo 41.