Poder diagnóstico de las pruebas de laboratorio para la esferocitosis hereditaria: un estudio comparativo en 150 pacientes agrupados según sus características moleculares y clínicas

Abstract

Antecedentes El diagnóstico de laboratorio de la esferocitosis hereditaria suele basarse en pruebas de fragilidad osmótica de los eritrocitos basadas en el NaCl o en el glicerol; más recientemente, se ha propuesto una prueba dirigida directamente al defecto molecular de la esferocitosis hereditaria (prueba de unión a eosina-5′-maleimida). Ninguna de las pruebas disponibles identifica todos los casos de esferocitosis hereditaria.Diseño y métodos Se han comparado los rendimientos de la prueba de unión a eosina-5′-maleimida, los estudios de fragilidad NaCl-osmótica en sangre fresca e incubada, la prueba de lisis en glicerol, la prueba de lisis en glicerol acidificado y la prueba de Pink en una serie de 150 pacientes con esferocitosis hereditaria agrupados según el fenotipo clínico y la proteína defectuosa, con el objetivo final de encontrar la combinación de pruebas asociada a la mayor potencia diagnóstica, incluso en los casos más leves de esferocitosis hereditaria.Resultados La prueba de unión a eosina-5′-maleimida tuvo una sensibilidad del 93% y una especificidad del 98% para detectar la esferocitosis hereditaria: la sensibilidad fue independiente del tipo y la cantidad de defecto molecular y del fenotipo clínico. La prueba de lisis con glicerol acidificado y la prueba de Pink mostraron una sensibilidad comparable (95% y 91%). La sensibilidad de las pruebas de fragilidad osmótica por NaCl, comúnmente consideradas el patrón de oro para el diagnóstico de la esferocitosis hereditaria, fue del 68% en sangre fresca y del 81% en sangre incubada, y disminuyó aún más en los casos compensados (53% y 64%, respectivamente). La combinación de la prueba de unión de eosina-5′-maleimida y la prueba de lisis de glicerina acidificada permitió identificar a todos los pacientes con esferocitosis hereditaria. La prueba de unión de eosina-5′-maleimida mostró la mayor especificidad de la enfermedad.Conclusiones Cada tipo de prueba falla en el diagnóstico de algunos casos de esferocitosis hereditaria. La asociación de una prueba de unión de eosina-5′-maleimida y una prueba de lisis de glicerol acidificado permitió identificar a todos los pacientes con esferocitosis hereditaria en esta serie y, por lo tanto, representa una estrategia de diagnóstico actualmente eficaz para la esferocitosis hereditaria, incluidos los casos leves/compensados.

Introducción

La esferocitosis hereditaria es la anemia hemolítica congénita más común en los caucásicos, afectando aproximadamente a 1 de cada 1000-2000 individuos.1,2 El defecto molecular es muy heterogéneo e implica a los genes que codifican para la espectrina, la anquirina, la banda 3 y la proteína 4.2,3 y el grado de hemólisis varía ampliamente, desde una anemia totalmente compensada hasta una anemia dependiente de transfusiones.

El sello de laboratorio típico de la esferocitosis hereditaria, aunque no es específico, es la presencia de esferocitos en un frotis de sangre periférica, que son detectables en el 97% de los pacientes.4 Sin embargo, en algunos pacientes puede haber muy pocos esferocitos4,5 y, por lo tanto, se necesitan operadores expertos para detectarlos; además, el examen microscópico de los hematíes se omite cada vez más en la era de la automatización del laboratorio. Por lo tanto, el diagnóstico de laboratorio de la esferocitosis hereditaria suele basarse en pruebas que explotan la relación superficie-volumen, típicamente reducida en los eritrocitos esféricos, en particular las pruebas de fragilidad osmótica de los eritrocitos a varias concentraciones de cloruro de sodio (NaCl) en sangre fresca e incubada,6 y los ensayos que miden el grado o la velocidad de lisis de los eritrocitos suspendidos en soluciones de glicerol tamponadas, es decir, la lisis de glicerol.es decir, la prueba de lisis con glicerol (GLT),7 la prueba de lisis con glicerol acidificado (AGLT)8 y la prueba Pink.9 Sin embargo, estas pruebas no detectan una proporción variable de casos de esferocitosis hereditaria, especialmente los más leves,6,10-12 y no diferencian la esferocitosis hereditaria de la esferocitosis secundaria asociada a otras enfermedades, principalmente las anemias hemolíticas autoinmunes.13-Más recientemente, la prueba de criohemólisis,16,17 basada en la observación de que los glóbulos rojos de pacientes con esferocitosis hereditaria son particularmente susceptibles al enfriamiento a 0° C en condiciones hipertónicas, y el análisis de citometría de flujo de glóbulos rojos intactos marcados con eosina-5′-maleimida (prueba de unión a EMA)18 se han propuesto como nuevos métodos para identificar la esferocitosis hereditaria.19 Esta última, en particular, ha demostrado ser una prueba diagnóstica sensible y específica para la esferocitosis hereditaria12,18,20-29 que se dirige directamente a la lesión estructural de esta enfermedad, ya que la sonda fluorescente, la eosina-5′-maleimida, interactúa con el complejo proteico de la banda 3.30

El rendimiento de las pruebas diagnósticas directas o indirectas disponibles se ha evaluado principalmente de forma individual y en un número limitado de casos. La sensibilidad de las pruebas varía mucho y cada método no logra identificar a varios pacientes con esferocitosis hereditaria.4,6,12 En este estudio, comparamos los rendimientos de las pruebas de unión a EMA, fragilidad osmótica inducida por NaCl de la sangre fresca e incubada, GLT, AGLT y Pink en una serie de 150 pacientes con esferocitosis hereditaria agrupados según el fenotipo clínico y la lesión molecular, con el objetivo final de encontrar la combinación de pruebas asociada con el mayor poder diagnóstico para la esferocitosis hereditaria, incluyendo los casos más leves que suelen ser difíciles de diagnosticar.

Diseño y métodos

Sujetos

Se investigaron ciento cincuenta pacientes consecutivos con esferocitosis hereditaria (79 varones y 71 mujeres, edad media de 26 años, rango de 0 a 79 años) pertenecientes a 128 familias no relacionadas. En el momento del estudio, 22 pacientes estaban esplenectomizados y 128 no lo estaban.

Todos los pacientes fueron sometidos a una evaluación clínica y física y a las siguientes pruebas de laboratorio: recuento sanguíneo completo, examen de frotis sanguíneo, recuento de reticulocitos, ensayos de concentración de bilirrubina y haptoglobina, evaluación del estado del hierro, prueba de antiglobulina directa (DAT), detección de hemoglobinas anormales o inestables, prueba de fragilidad osmótica por NaCl en sangre fresca e incubada, GLT, AGLT, prueba de Pink y prueba de unión a EMA. En algunos casos, se investigó la actividad de las enzimas más importantes de la vía glucolítica y de la vía de las pentosas fosfato. En unos pocos pacientes, también se realizó la prueba DAT31 estimulada por mitógenos para descartar el diagnóstico de anemia hemolítica DAT-negativa.

La esferocitosis hereditaria se diagnosticó sobre la base de los signos clínicos y de laboratorio de hemólisis crónica, la presencia de esferocitos en el examen de frotis de sangre periférica, la positividad de al menos una prueba de fragilidad de glóbulos rojos, los antecedentes familiares de esferocitosis hereditaria, si los hubiera, y la exclusión de otras causas de esferocitosis secundaria.19 La anemia se definió como grave (Hb<8 g/dL), moderada (Hb 8-10 g/dL), leve (Hb>10 y <11,5 g/dL para las mujeres y Hb>10 y <13,5 g/dL para los hombres) y compensada (Hb>11,5 g/dL para las mujeres y >13,5 g/dL para los hombres).

Las muestras de todos los pacientes se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) para el análisis de las proteínas de la membrana de los glóbulos rojos y se dividieron según si había deficiencia de la banda 3, de espectrina o de anquirina, deficiencia combinada de espectrina/anquirina y sin defecto detectable.4

Ciento setenta y cinco donantes de sangre sanos y 84 casos con anemia hemolítica distinta de la esferocitosis hereditaria (17 con anemia hemolítica autoinmune, 10 con trastornos enzimáticos de los eritrocitos, 10 con eliptocitosis hereditaria, 15 con anemia diseritropoyética congénita, 9 con hemoglobinuria paroxística nocturna, 3 con estomatocitosis, 3 con anemia mecánica y 17 con anemia de causa desconocida).

Ensayos hematológicos

Se extrajo sangre periférica de los pacientes y de los controles durante los procedimientos de diagnóstico tras obtener el consentimiento informado y la aprobación del Comité Institucional de Investigación Humana. Los procedimientos seguidos se ajustaron a las normas éticas internacionales de Helsinki sobre experimentación humana. La gran mayoría de las muestras se recogieron en nuestro instituto; las muestras recogidas en otros centros se enviaron manteniendo una temperatura de 4°C y siempre se procesaron en un plazo de 24 h. Todas las pruebas se realizaron en un único centro. Ninguno de los pacientes había sido transfundido en los 3 meses anteriores al estudio. Los parámetros hematológicos se determinaron en un analizador hematológico automático (Beckman Coulter LH-750, CA, USA). Las investigaciones hematológicas de rutina se llevaron a cabo según Dacie & Lewis.32 Los niveles de bilirrubina, haptoglobina y ferritina se determinaron utilizando Integra 800 (Roche, Mannheim, Alemania). El número de esferocitos en sangre periférica fue evaluado por dos operadores independientes y expertos. La fragilidad osmótica de los eritrocitos se evaluó realizando la prueba de fragilidad osmótica por NaCl tanto en sangre fresca como incubada,6 la prueba estándar GLT,7 la prueba AGLT8 y la prueba Pink9 en muestras de cada paciente.

La prueba de unión a EMA se realizó según lo descrito por King et al.18 con pequeñas modificaciones. En particular, la intensidad de la fluorescencia, expresada como fluorescencia media del canal, se determinó para 10.000 eventos en el canal FL-1, utilizando un citómetro de flujo Becton Dickinson FACSCanto II (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). La solución madre del colorante EMA se almacenó en pequeñas alícuotas a -80° C durante un período de 6 meses. La prueba se realizó una vez a la semana agrupando todos los casos en el mismo día25 después de confirmar la reproducibilidad de los resultados en muestras de sangre almacenadas hasta 6 días a 4°C.

Para disminuir la variación intraensayo, las muestras de los pacientes se compararon con las de seis controles normales. Los resultados se expresaron como el porcentaje de reducción de la fluorescencia de la muestra del paciente en comparación con la fluorescencia media de los seis controles normales, tal y como proponen Girodon et al.25 Se utilizó una curva de características operativas del receptor (ROC) basada en un análisis de regresión logística para determinar el punto de corte óptimo entre los valores de los pacientes con esferocitosis hereditaria y los de los individuos normales. Según el análisis de la curva ROC, la disminución óptima de la fluorescencia para separar a los sujetos normales de los pacientes con esferocitosis hereditaria fue del 11%. En estas condiciones, la especificidad de la prueba calculada en 575 sujetos sanos fue del 98%.

Las células rojas fantasma se prepararon en las 24 horas siguientes a la extracción de sangre utilizando el método descrito por Dodge et al.33 con ligeras modificaciones.4 Las proteínas de la membrana de las células rojas se analizaron en los 15 días siguientes a la preparación de las células fantasma mediante SDS-PAGE utilizando un gradiente de acrilamida del 4% al 12% según Fairbanks et al.34 y el sistema de tampón discontinuo de Laemmli35 con un gradiente lineal de acrilamida del 6% al 14%, tal como se ha descrito previamente.4 Las actividades de las enzimas de las vías glucolíticas y de las pentosas fosfato se ensayaron utilizando los métodos descritos por Beutler.36

Resultados

La tabla 1 muestra los datos hematológicos y bioquímicos de los pacientes con esferocitosis hereditaria agrupados según si no habían sido esplenectomizados o lo habían sido antes del momento del estudio, y según el fenotipo clínico (sólo en los pacientes no esplenectomizados). La mayoría de los sujetos no esplenectomizados tenían una hemólisis de leve a compensada; el 18% tenía muy pocos esferocitos (≤3%). Las anomalías proteicas más comunes fueron las deficiencias de espectrina y banda 3 tanto en los pacientes no esplenectomizados como en los esplenectomizados. El defecto de la proteína de membrana era indetectable en nueve (7%) sujetos no esplenectomizados, siete de los cuales tenían una historia familiar positiva de esferocitosis hereditaria; los dos restantes mostraban una anemia leve, reticulocitosis y un 5% de esferocitos, en ausencia de otras causas de anemia hemolítica crónica.

La tabla 2 compara la sensibilidad de las pruebas de laboratorio de diagnóstico para la esferocitosis hereditaria. La unión de EMA no identificó 10/150 (7%) casos (4 con deficiencia de banda 3, 5 con deficiencia de espectrina y 1 con un defecto no detectado). La disminución media de la fluorescencia fue del 27% ± 10% en los pacientes con esferocitosis hereditaria frente al 0% ± 8% en los sujetos de referencia (P<0,001). El porcentaje de reducción de la fluorescencia estaba directamente relacionado con el número de esferocitos e indirectamente con el volumen corpuscular medio; no se encontró correlación con la concentración de hemoglobina, el número absoluto de reticulocitos o la anchura de distribución de los eritrocitos. La sensibilidad de la prueba fue independiente del tipo y la cantidad de defecto molecular, aunque fue ligeramente inferior en los pacientes con defectos no detectados que presentaban la menor disminución media de la fluorescencia (15% frente a 30% y 28% en la deficiencia de banda 3 y espectrina, respectivamente). Cabe destacar que la sensibilidad de la prueba de unión a EMA fue ligeramente mayor en los pacientes esplenectomizados que en los no esplenectomizados (Figura 1).

La sensibilidad de los distintos ensayos de fragilidad eritrocitaria investigados fue muy variable y, en general, mayor en los esplenectomizados que en los no esplenectomizados con esferocitosis hereditaria, y menor (con la excepción del AGLT) en los pacientes con defectos no detectados que en aquellos con defectos detectables (Tabla 2A). En cuanto a la prueba de fragilidad osmótica por NaCl, la sensibilidad fue mayor cuando se realizó en sangre incubada que en sangre fresca. En general, las pruebas de fragilidad osmótica por NaCl (tanto en sangre fresca como incubada) tuvieron una sensibilidad menor que las pruebas más utilizadas basadas en el glicerol. Entre estos últimos ensayos, el AGLT tuvo la mayor sensibilidad, también en los casos con defectos no detectados, comparable a la de la prueba de unión a EMA.

Tabla 1.Datos hematológicos y bioquímicos de los pacientes con esferocitosis hereditaria agrupados según hubieran sido o no esplenectomizados.

Todos los pacientes con esferocitosis hereditaria fueron positivos a al menos dos pruebas diferentes con la excepción de dos pacientes (1 con deficiencia de banda 3 y 1 con deficiencia de espectrina) que fueron positivos sólo en la prueba de unión a EMA. Encontramos que la combinación de EMA y AGLT permitió identificar a todos los pacientes con esferocitosis hereditaria (Tabla 2B). En particular, 133/150 (88%) de los casos de esferocitosis hereditaria fueron EMA-positivos, AGLT-positivos, 7/150 (5%) fueron EMA-positivos, AGLT-negativos y 10/150 (7%) fueron EMA-negativos, AGLT-positivos.

Cuando se analizó el rendimiento de las distintas pruebas en pacientes no esplenectomizados en función del fenotipo clínico, la unión a EMA, el AGLT y la prueba de Pink mantuvieron una alta sensibilidad en los distintos subconjuntos clínicos, mientras que la sensibilidad de la prueba de fragilidad osmótica de NaCl en sangre fresca y tras incubación disminuyó notablemente en los casos compensados (Figura 1).

Los resultados de varias pruebas en una serie de 84 pacientes con afecciones hemolíticas distintas de la esferocitosis hereditaria se representan en la figura 2. La unión de EMA mostró la mayor especificidad de la enfermedad siendo negativa en todos los pacientes con anemia hemolítica autoinmune, incluso en presencia de una marcada esferocitosis.

Discusión

Este es el primer estudio comparativo extenso de los métodos de laboratorio más utilizados actualmente para el diagnóstico de la esferocitosis hereditaria, realizado en un gran número de pacientes agrupados según el defecto molecular, el grado de hemólisis y la presencia o ausencia del bazo. La constatación de que la mitad de los pacientes examinados presentaban una anemia leve/compensada y, por lo tanto, eran más difíciles de diagnosticar, y que el 18% tenían muy pocos esferocitos en el frotis de sangre periférica, hace que la población examinada sea especialmente adecuada para los estudios de sensibilidad. No incluimos la prueba de criohemólisis17 en este estudio, ya que la base de la susceptibilidad de los hematíes de la esferocitosis hereditaria al enfriamiento no se ha dilucidado hasta ahora, y las opiniones sobre su utilización rutinaria para el diagnóstico de la esferocitosis hereditaria son controvertidas.4,5,16,17,19,37,38

Tabla 2.(A) Sensibilidad de las pruebas individuales en pacientes con esferocitosis hereditaria (HS) agrupados según el defecto bioquímico. (B) La sensibilidad de las pruebas combinadas en el total de casos de HS. El número representa la proporción de casos positivos/casos totales con valores porcentuales entre paréntesis.

Figura 1.Sensibilidad de varias pruebas diagnósticas en 22 pacientes esplenectomizados y 128 no esplenectomizados con esferocitosis hereditaria (HS). Los pacientes no esplenectomizados con HS se dividieron según el fenotipo clínico.

Entre los métodos diagnósticos considerados, la prueba de unión a EMA, recientemente propuesta, es sin duda la más interesante, y está siendo cada vez más utilizada por los laboratorios especializados debido a su alta sensibilidad y especificidad.12,18,23-29 Este método se dirige directamente a la lesión estructural de la enfermedad, ya que la sonda fluorescente eosina-5′-maleimida interactúa con las proteínas transmembrana banda 3, proteína Rh, glicoproteína Rh y CD47, que están reducidas en los eritrocitos de los pacientes con esferocitosis hereditaria;30 los defectos de otras proteínas del citoesqueleto, como la espectrina y la proteína 42, también inducen una disminución de la intensidad de la fluorescencia, probablemente porque crean un efecto de modulación de largo alcance en el sitio de unión del colorante en la proteína de la banda 3.39 La sensibilidad de la prueba de unión a EMA en esta serie es más alta que la reportada recientemente por Crisp et al,12 y similar a la encontrada por otros;18,23-29 además, el rendimiento de la prueba parece ser independiente del tipo de deficiencia de proteína de la membrana de los glóbulos rojos, y disminuye sólo ligeramente en pacientes con esferocitosis hereditaria con un defecto indetectable, en línea con lo observado por King et al,18 y Girodon et al.25 Curiosamente, la sensibilidad es independiente del fenotipo clínico, siendo alta también en pacientes con anemia compensada. El análisis por separado de pacientes no esplenectomizados y esplenectomizados con esferocitosis hereditaria mostró que la sensibilidad aumentaba en este último grupo, un hallazgo generalmente común a todas las pruebas investigadas; esta observación señala la necesidad de definir con precisión las características clínicas de los pacientes cuando se pruebe el rendimiento de los métodos de diagnóstico para la esferocitosis hereditaria, y posiblemente limitar el análisis a los sujetos no esplenectomizados. Otra ventaja de la prueba de unión a EMA es que los resultados no se ven influenciados por el envío o el almacenamiento de hasta 6 días, como se muestra en la Figura 3, lo que permite el envío de muestras, tal y como informan Girodon et al.25 Además, los resultados no se ven afectados por las transfusiones recientes, ya que el método discrimina diferentes poblaciones de eritrocitos.20

Figura 2.Resultados de las pruebas diagnósticas individuales en pacientes con anemias hemolíticas distintas de la esferocitosis hereditaria (HS), en comparación con los que tienen HS. El área sombreada representa los intervalos de referencia normales. ADC: anemia diseritropoyética congénita; AHI: anemia hemolítica autoinmune; EH: eliptocitosis hereditaria; HNP: hemoglobinuria paroxística nocturna

En cuanto a las pruebas de fragilidad osmótica por NaCl, encontramos que éstas no identificaron a casi una cuarta parte de los pacientes con esferocitosis hereditaria, confirmando los resultados de otros investigadores,12,13,19,40,41 y que su sensibilidad fue, en general, menor que la de las otras pruebas diagnósticas de laboratorio evaluadas en esta serie. A pesar de ello, la fragilidad osmótica por NaCl incubado sigue considerándose habitualmente el patrón de oro para el diagnóstico de la esferocitosis hereditaria en pacientes con anemias hemolíticas de Coombs negativas.5,11,42 De hecho, el análisis de la literatura revela que no se han realizado estudios sistemáticos sobre la sensibilidad de esta prueba en el pasado, y que la afirmación de que es el mejor método para el diagnóstico de la esferocitosis hereditaria se basa en estudios realizados en un número limitado de pacientes con características clínicas no claramente definidas; además, la interpretación de las curvas de fragilidad osmótica del NaCl puede ser difícil en los casos menos típicos.8 El elevado número de pacientes considerados en esta serie nos permitió correlacionar el rendimiento de la prueba de fragilidad osmótica al NaCl con la expresión clínica de la enfermedad: la observación de que en los casos de esferocitosis hereditaria compensada la sensibilidad de las pruebas de fragilidad osmótica disminuye hasta casi el 60%, mucho más de lo comunicado por Korones & Pearson,13 limita aún más la utilidad de este método en los casos más leves y menos típicos. Esto también se confirma por el hallazgo de que la sensibilidad desciende al 30% en pacientes con esferocitosis hereditaria con un defecto bioquímico indetectable.

Las pruebas de fragilidad de glóbulos rojos basadas en el glicerol, con la excepción de la versión original GLT, son más sensibles que la prueba de fragilidad osmótica de NaCl; en particular, en esta serie, la AGLT tuvo una sensibilidad del 95%, similar a la encontrada por otros1,15,43,44 y superior a la informada por Cynober et al.10 y Bucx et al.45 La sensibilidad de la AGLT también fue alta en los casos compensados y en aquellos con un defecto bioquímico no detectado. Además, cabe destacar que el AGLT identificó los diez casos de esferocitosis hereditaria con EMA negativo.

La asociación de la unión a EMA y la AGLT permitió identificar todos los casos de esferocitosis hereditaria de esta serie; dado que el citómetro de flujo no está disponible en todos los laboratorios de diagnóstico, cabe mencionar que la AGLT más la prueba de fragilidad osmótica por NaCl en sangre incubada eleva la sensibilidad diagnóstica al 97%, similar a la comunicada previamente en una serie mayor de pacientes4: en cualquier caso, este valor es superior al obtenido combinando la prueba de unión a EMA y la prueba de criohemólisis, como han informado recientemente Crisp et al.12

Figura 3.(A) Valores medios de fluorescencia del canal en controles normales y pacientes con esferocitosis hereditaria (HS) a diferentes días de almacenamiento. (B-C) Resultados de la prueba de unión a EMA en muestras de 150 pacientes con HS agrupadas según el envío (B) y los días de almacenamiento antes de la prueba (C). ■ Controles, – HS no enviada, ○ HS enviada.

Figura 4.Diagrama de flujo para el diagnóstico de laboratorio de la esferocitosis hereditaria (HS).

La especificidad de la enfermedad de las pruebas de diagnóstico de la esferocitosis hereditaria se evaluó incluyendo un amplio grupo de pacientes con diferentes tipos de anemia hemolítica que pueden mostrar características morfológicas y de laboratorio similares a las de la esferocitosis hereditaria. Como se esperaba, los resultados de la unión a EMA, en términos de porcentaje de reducción de la fluorescencia, estaban directamente relacionados con el número de esferocitos sólo en los pacientes con esferocitosis hereditaria, pero no en los pacientes con anemia hemolítica autoinmune, ni siquiera en aquellos con esferocitosis marcada: esta observación está en consonancia con la alta especificidad de la enfermedad de esta prueba comunicada por otros.19-21,25 Encontramos que los otros ensayos, en particular los basados en el glicerol, son menos específicos que el de unión a EMA, ya que, como se ha informado anteriormente, 8,9,14,15,46 a menudo son positivos también en las anemias hemolíticas adquiridas. Cabe mencionar que ninguna de las pruebas diagnósticas disponibles para la esferocitosis hereditaria, ya sea directa o indirecta, diferencia la esferocitosis hereditaria de la anemia diseritropoyética congénita tipo II. Este último trastorno, aunque es menos frecuente que la esferocitosis hereditaria, puede imitar la presentación clínica, la morfología de los glóbulos rojos y el aumento de la fragilidad osmótica de los glóbulos rojos de la esferocitosis hereditaria y puede requerir un análisis de SDS-PAGE para ser identificado: Mariani et al. informaron de que el 13% de los casos remitidos a un laboratorio de referencia con la etiqueta provisional de esferocitosis hereditaria resultaron ser anemia diseritropoyética congénita de tipo II cuando se examinaron por SDS-PAGE.47

Las directrices de diagnóstico de la esferocitosis hereditaria del Comité Británico de Estándares en Hematología,19 las únicas disponibles hasta ahora, recomiendan la unión a EMA o la prueba de criohemólisis como método de cribado,16 siendo el factor decisivo para la elección la disponibilidad de un citómetro de flujo. Las directrices no especifican si, en el caso de resultados equívocos o dudosos, deben realizarse ambas pruebas. En cualquier caso, incluso la asociación de estas dos pruebas da una sensibilidad del 93%, similar a la de EMA-binding o AGLT utilizadas por separado, y mucho menor que la obtenida por la combinación de EMA-binding más AGLT.

Como se ve en la figura 4, en presencia de un paciente con hemólisis crónica DAT-negativa con esferocitos, la negatividad tanto de EMA como de AGLT permite excluir la esferocitosis hereditaria. La positividad de la unión a EMA (con un AGLT positivo o negativo) conduce al diagnóstico de esferocitosis hereditaria, excepto en aquellos casos no dominantes con reticulocitosis inadecuada11 que necesitan un análisis SDS-PAGE para excluir la anemia diseritropoyética congénita tipo II. El análisis SDS-PAGE también puede ser necesario en los raros casos EMA-negativos, AGLT-poistivos con una historia familiar negativa, debido a la menor especificidad de la enfermedad de AGLT.

En conclusión, ninguna prueba única es capaz de identificar todos los casos de esferocitosis hereditaria. La asociación de la unión a EMA, que se dirige directamente al defecto estructural de la esferocitosis hereditaria, y la AGLT, que aprovecha la relación área de superficie de los eritrocitos/volumen, nos permitió identificar a todos los pacientes con esferocitosis hereditaria en esta serie y, por lo tanto, representa una estrategia de diagnóstico muy eficaz para la esferocitosis hereditaria también en los casos leves/compensados. Sin embargo, hay que subrayar que el diagnóstico de la esferocitosis hereditaria es el paso final de un trabajo de diagnóstico basado no sólo en las pruebas de laboratorio sino también en el examen clínico, los antecedentes familiares personales y la exclusión de posibles causas de esferocitosis secundaria.

Notas al pie

• Financiación: este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico de Milán, RC2009 160/01 y el proyecto ENERCA III, CE 2008, convenio n. 210.
• Autoría y divulgaciónLa información proporcionada por los autores sobre las contribuciones de las personas que figuran como autores y en los agradecimientos está disponible con el texto completo de este trabajo en www.haematologica.org.
• Las divulgaciones financieras y de otro tipo proporcionadas por los autores utilizando el Formato Uniforme de Divulgación de Intereses en Competencia del ICMJE (www.icmje.org) también están disponibles en www.haematologica.org.

• Recibido el 4 de agosto de 2011.
• Recibida la revisión el 11 de octubre de 2011.
• Aceptada el 26 de octubre de 2011.

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