Dado que la cuantificación precisa de proteínas es esencial para todos los experimentos relacionados con los estudios de proteínas, se han desarrollado diferentes métodos para medir la concentración de proteínas en un ensayo determinado. Algunos de los métodos más tradicionales de cuantificación de proteínas totales incluyen la medición de la absorbancia UV a 280 nm (A280), los ensayos de ácido bicinconínico (BCA) y Bradford, y otros métodos alternativos como el de Lowry y otros ensayos novedosos.
Dado que las proteínas absorben la luz a una longitud de onda específica, la medición puede obtenerse utilizando un espectrofotómetro. En concreto, los aminoácidos tirosina y triptófano tienen una absorción muy específica a 280 nm, lo que permite la medición directa de la concentración de proteínas en A280.
La absorbancia UV a 280 nm se utiliza de forma rutinaria para estimar la concentración de proteínas en los laboratorios debido a su simplicidad, facilidad de uso y asequibilidad. Las mediciones son rápidas y altamente reproducibles ya que no hay necesidad de incubación. Además, este método también requiere un volumen de muestra extremadamente pequeño, ya que los espectrofotómetros modernos utilizan un sistema de retención de la muestra durante la medición.
Sin embargo, hay que tener cuidado para asegurarse de que la muestra de proteínas no contenga ningún componente no proteico (por ejemplo, ácidos nucleicos) con el mismo espectro de absorción, ya que puede conducir a resultados erróneos. Además de determinar las concentraciones de proteínas, los valores de absorbancia también pueden utilizarse para detectar cambios conformacionales y la unión de ligandos y para seguir las reacciones enzimáticas.
El efecto del triptófano y la tirosina en la cuantificación de proteínas
Debido a la presencia de tirosina y triptófano, las proteínas y los péptidos que contienen estos aminoácidos aromáticos absorben la luz UV a una longitud de onda de 280 nm. Cada uno de estos residuos tiene distintas longitudes de onda de absorción y emisión y varía su rendimiento cuántico. La fenilalanina y los enlaces disulfuro también contribuyen en la absorción a esta longitud de onda, pero como es relativamente insignificante, sólo puede observarse en ausencia de triptófano y tirosina.
Muchos cofactores enzimáticos que contienen estructuras de anillos aromáticos (por ejemplo, FMN, FAD, NAD y porfirinas) también absorben la luz UV para su excitación y, por tanto, se suman a la intensidad de la fluorescencia resultante. Las proteínas especiales, como la proteína verde fluorescente, también tienen una secuencia interna de serina-tirosina-glicina que se modifica postraduccionalmente y es fluorescente en la región de la luz visible.
Triptófano
El triptófano es significativamente más fluorescente que la tirosina y la fenilalanina. Sin embargo, sus propiedades fluorescentes dependen del disolvente, es decir, el espectro se desplaza a longitudes de onda más cortas y aumenta su intensidad a medida que disminuye la polaridad del disolvente. Así, los residuos de triptófano enterrados en los dominios hidrofóbicos de las proteínas plegadas presentan un desplazamiento espectral de 10 a 20 nm.
Debido a su mayor absorción, mayor rendimiento cuántico y transferencia de energía por resonancia, el espectro de fluorescencia de una proteína que contiene los tres aminoácidos suele parecerse al del triptófano.
Tirosina
La tirosina puede ser excitada a longitudes de onda similares a las del triptófano pero emitirá a una longitud de onda claramente diferente. Si bien es cierto que la tirosina es menos fluorescente que el triptófano, puede proporcionar una señal significativa, ya que suele estar presente en grandes cantidades en muchas proteínas. Se ha observado que la fluorescencia de la tirosina se apaga por la presencia de restos de triptófano cercanos, ya sea a través de la transferencia de energía de resonancia o de la ionización de su grupo hidroxilo aromático.
Aquí hay algunos puntos importantes que hay que recordar cuando se miden péptidos utilizando el método A280.
- Las proteínas de peso molecular similar pueden tener valores de absorbencia diferentes debido a la diferencia en el contenido de triptófano y tirosina.
- La absorbencia UV también se ve afectada por la estructura de la proteína. Así, las condiciones que afectan a la estructura (como la temperatura, el pH, la fuerza iónica o la presencia de detergentes) pueden afectar a la capacidad de los residuos aromáticos para absorber la luz a 280 nm, y cambiar el valor del coeficiente de extinción de la proteína.
- El entorno local de los aminoácidos aromáticos puede tener un efecto sobre sus espectros. Esto significa que el triptófano tendrá un pico de emisión a longitudes de onda más bajas cuando esté enterrado dentro de las regiones internas hidrofóbicas de una proteína, mientras que la tirosina suele transferir su energía a los aminoácidos triptófanos adyacentes. El tirosinato ionizado, que se forma cuando los protones se pierden de la tirosina como resultado del aumento del pH, mostrará longitudes de onda similares a las del triptófano.