En la producción de 1,3-propanediol o 3-HP a partir de glicerol, el ácido láctico es el principal subproducto que reduce significativamente el rendimiento del producto. Por ello, se ha intentado reducir la producción de lactato mediante la deleción del gen que codifica la lactato deshidrogenasa (Kumar et al. 2013b; Zhong et al. 2014). Dado que ambas reacciones que forman 1,3-propanediol y 3-HP compiten por su sustrato común 3-hidroxialdehído (3-HPA), la deleción de la propanediol oxidorreductasa favorece la producción de 3-HP (Ashok et al. 2011). Por lo tanto, en este estudio, se eliminaron los genes ldhA y dhaT para mejorar la producción de 3-HP.
Efecto de la deficiencia de ldhA en la producción de 3-HP
Se construyó la cepa JJQ01 deficiente en ldhA y se confirmó la eliminación de ldhA como se muestra en la Figura S2A. Se construyeron las cepas recombinantes Kp4(pUC18-kan-aldH) y JJQ01(pUC18-kan-aldH) y se llevaron a cabo fermentaciones por lotes alimentados en el biorreactor de 5 L. Los perfiles de crecimiento celular, consumo de glicerol y producción de metabolitos se muestran en la Fig. 2a, b. Kp4(pUC18-kan-aldH) produjo 18.3 g/L de 3-HP con un rendimiento de 0.21 mol/mol en 38 h, mientras que el ácido láctico alcanzó 32.2 g/L con un rendimiento mayor de 0.34 mol/mol. Además, se produjeron 17,6 g/L de 2,3-butanediol, 6,1 g/L de 1,3-propanediol y 10,7 g/L de ácido acético. La formación de lactato aumenta no sólo el coste, sino también la dificultad para recuperar el 3-HP, que es un isómero del lactato. Además, el lactato es un inhibidor principal de la biosíntesis de 3-HP y 1,3-propanediol (Xu et al. 2009b; Kumar et al. 2013b). La deficiencia de ldhA eliminó efectivamente la formación de lactato y la producción de 3-HP alcanzó 48,3 g/L con un rendimiento de 0,28 mol/mol, como se muestra en la Fig. 2b. La concentración y el rendimiento de 3-HP en esta cepa deficiente en ldhA aumentaron 1,64 veces y 33,3%, respectivamente, en comparación con la cepa Kp4(pUC18-kan-aldH). Excepto la pequeña cantidad de formación de etanol (alrededor de 4 g/L), no se detectó la acumulación de piruvato y formiato por parte de la cepa mutante ldhA, que casi no se observaron en el caso de utilizar la cepa de tipo salvaje.
Los perfiles de densidad celular, 3-HP y otros metabolitos por las cepas diseñadas en la fermentación por lotes alimentados en un biorreactor de 5 L. a Kp4(pUC18-kan-aldH); b JJQ01(pUC18-kan-aldH); c JJQ02(pUC18-kan-aldH). OD650 (triángulo que apunta hacia arriba); 3-HP (círculo negro); PDO: 1,3-propanediol (triángulo que apunta hacia abajo); BDO: 2,3-butanediol (triángulo posterior que apunta a la izquierda); acetato (diamante negro); lactato (triángulo posterior que apunta a la derecha)
Estos resultados indicaron claramente que el bloqueo de la producción de ácido láctico redirigió en gran medida el flujo de carbono hacia la producción de 3-HP. La asimilación de glicerol a través de DhaB mejoró significativamente, casi 0,4 mol/mol de glicerol se dirigió a través de DhaB a 3-HPA, lo que fue consistente con otros estudios (Kumar et al. 2013b; Xu et al. 2009b). La reducción del lactato pudo disminuir la toxicidad para las células, favoreció el crecimiento celular y la productividad de 3-HP. Sin embargo, la reducción del lactato también aumentó la formación de 2,3-butanediol y 1,3-propanediol, que alcanzaron 21,9 g/L con un rendimiento de 0,13 mol/mol y 18,5 g/L con un rendimiento de 0,12 mol/mol, respectivamente. Debido a la deleción de ldhA, el exceso de NADH derivado de la mayor acumulación de 3-HP podría promover la producción de 2,3-butanediol y 1,3-propanediol en lugar de lactato para regenerar NAD+ y mantener el equilibrio redox. De hecho, la formación de etanol también apoyó la regeneración de NAD+, lo que resultó en un mayor flujo de piruvato a etanol que el flujo a piruvato.
Efecto de la deficiencia de dhaT en la producción de 3-HP
La supresión de ldhA impulsó dramáticamente la producción de 3-HP, al mismo tiempo, la producción de 1,3-propanediol también aumentó a 18,5 g/L. Ko et al. (2017) informaron que se obtuvieron 43 g/L de 3-HP y 21 g/L de 1,3-propanediol mediante la reducción de acetato y otros subproductos. Aunque la formación de 1,3-propanediol beneficia la utilización del glicerol al regenerar el cofactor, representa una parte sustancial del flujo de carbono del glicerol. Dado que el 1,3-propanediol y la 3-HP compiten por el mismo precursor, el 3-HPA, para limitar el flujo de 1,3-propanediol, se construyó la cepa de doble eliminación de ldhA y dhaT (mostrada en el archivo adicional 1: Figura S2B) JJQ02(pUC18-kan-aldH). Los resultados de la fermentación por lotes alimentados en el reactor de 5 L se muestran en la Fig. 2c. Inesperadamente, la supresión concomitante de ldhA y dhaT sólo dio lugar a 44,5 g/L de 3-HP, aunque el rendimiento aumentó a 0,32 mol/mol de glicerol. La supresión de dhaT dio lugar a una reducción del título de 1,3-propanediol y del rendimiento a 9,9 g/L y 0,07 mol/mol, respectivamente. Pero el 1,3-propanediol se siguió produciendo en la reacción catalizada por YqhD y otras oxidorreductasas (Ashok et al. 2013). Además, en comparación con JJQ01(pUC18-kan-aldH), la producción de 2,3-butanediol aumentó de 21,9 a 23,4 g/L ligeramente, lo que indica que el flujo hacia la vía del 2,3-butanediol se incrementó para consumir el exceso de NADH derivado de la reacción catalizada por ALDH. La síntesis de 1,3-propanediol desempeña un papel clave en la regulación del equilibrio redox en K. pneumoniae. Dentro de la vía de oxidación, la formación de una molécula de acetato a partir del glicerol produce tres moléculas de NADH, al mismo tiempo que se forma una molécula de ATP. En consecuencia, la deleción tanto de ldhA como de dhaT redujo en gran medida la capacidad de regeneración de NAD+, y se oxidó más NADH a través de la formación de 2,3-butanediol, lo que resultó en un aumento del 2,3-butanediol. La reducción de la tasa de aireación (limitando el suministro de oxígeno) podría mejorar la producción de acetato para proporcionar más ATP, pero al mismo tiempo se formó más NADH, lo que resultó en un aumento adicional de la producción de 2,3-butanediol. Sin embargo, el NAD+ regenerado parecía ser menor que el formado en la reacción catalizada por DhaT, lo que conducía a una menor producción de 3-HP. Por lo tanto, el suministro de una cantidad adecuada de oxígeno para generar NAD+ sin afectar a la actividad de DhaB y a la disimilación del glicerol es fundamental para la producción de 3-HP en la fermentación microaeróbica.
En este estudio, no se ha conseguido mejorar la producción de 3-HP mediante la supresión del gen dhaT. La disimilación del glicerol está regulada por la glicerol deshidrogenasa DhaD, la glicerol quinasa GlpK, la glicerol deshidratasa DhaB y las 1,3-propanediol oxidoreductasas 1,3-PDORs. La rigidez del punto de ramificación del glicerol implica que la mejora de la producción de 3-HP mediante la deleción de genes implicados en la partición del flujo de glicerol es difícil. Ashok et al. (2011) habían determinado las actividades inherentes de DhaD, DhaB, ALDH y 1,3-PDORs después de suprimir el gen dhaT. Encontraron que la actividad de DhaD mejoró ligeramente, la actividad de ALDH disminuyó ligeramente, y la actividad de DhaB disminuyó significativamente. Zhang et al. (2008) también analizaron la robustez en los puntos de ramificación de la vía de disimilación del glicerol. Se demostró que la partición del flujo de carbono entre la rama reductora y la oxidativa era robusta frente a las condiciones ambientales.
Efecto de la aireación en la producción de 3-HP
Nuestros estudios anteriores mostraron que la condición micro-aeróbica era favorable para la producción de 3-HP. En comparación con el proceso anaeróbico, en la fermentación micro-aeróbica la producción de 3-HP fue significativamente mayor debido al mayor nivel de expresión de la aldehído deshidrogenasa, y al mismo tiempo, la producción de 1,3-propanediol se redujo (Huang et al. 2013). Wang et al. (2011) informaron de que la actividad específica de la glicerol deshidratasa en K. pneumoniae a una tasa de aireación de 0,04 vvm era un 59% mayor que en ausencia de suministro de aire. Pero, se ha reportado que la glicerol deshidratasa puede ser rápidamente inactivada por el oxígeno (Toraya 2000; Ruch y Lin 1975), y afectó significativamente la producción de 3-HP (Xu et al. 2009a; Huang et al. 2013; Niu et al. 2017). Además, la coenzima B12, el cofactor de la DhaB, no se sintetiza suficientemente en condiciones de alta aireación en la mayoría de los productores naturales de 3-HPA, como K. pneumoniae. Huang et al. (2013) y Ko et al. (2017) también demostraron que las condiciones altamente aeróbicas no eran beneficiosas para la producción de 3-HP. Por lo tanto, llevamos a cabo experimentos preliminares de alimentación por lotes bajo diferentes condiciones de aireación y también encontramos que mantener una alta tasa de aireación era desfavorable para la producción de 3-HP después de que el crecimiento celular cesara (datos no mostrados). En el cultivo alimentado por lotes de JJQ02(pUC18-kan-aldH), adoptamos una tasa de aireación de la mitad de la tasa inicial cuando la DO650 se cerró al valor máximo. Los perfiles de crecimiento, glicerol y metabolitos se muestran en la Fig. 3, y la flecha negra indicó el punto de tiempo para bajar la tasa de aireación (0,5 vvm).
Los perfiles de densidad celular, 3-HP y otros metabolitos de la cepa JJQ02(pUC18-kan-aldH) en fermentación por lotes alimentados en un biorreactor de 5 L. OD650 (triángulo que apunta hacia abajo); 3-HP (círculo negro); PDO: 1,3-propanediol (triángulo que apunta hacia abajo); BDO 2,3-butanediol (triángulo que apunta hacia la izquierda); acetato (diamante negro); la flecha negra representa el punto de tiempo para reducir la tasa de aireación
El título final de 3-HP alcanzó 61.La concentración de 3-HP y el rendimiento de JJQ02(pUC18-kan-aldH) fueron 3,3 y 2,76 veces mayores que los de Kp4 (pUC18-kan-aldH), y 1,28 y 2,07 veces mayores que los de JJQ01(pUC18-kan-aldH). Los resultados mostraron que la producción tanto de 1,3-propanediol como de 2,3-butanediol se detuvo a las 20 h. Sin embargo, el título de 3-HP siguió aumentando aunque la tasa de producción disminuyó a partir de este punto de tiempo. En la última parte de la fermentación microaeróbica, aunque se regeneró poco NADH a través de la formación de 1,3-propanediol y 2,3-butanediol, todavía se pudo regenerar algo de NADH a través de la cadena de transporte de electrones, porque la forma más eficiente de regenerar NAD+ es a través de la cadena de transporte de electrones en presencia de oxígeno (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b), lo que resulta en el aumento de 3-HP sin el aumento obvio de 1,3-propanediol y 2,3-butanediol.
Fermentación a escala de 300-L
Para examinar la viabilidad de la cepa JJQ02(pUC18-kan-aldH) para la producción de 3-HP en un biorreactor más grande, se llevó a cabo la fermentación por lotes alimentados en un biorreactor de 300-L siguiendo las condiciones de fermentación establecidas en el fermentador de 5-L. Se adoptó una estrategia de aireación en dos etapas; la tasa de aireación se redujo a la mitad en el punto de tiempo de la flecha negra, como se muestra en la Fig. 4. El 3-HP alcanzó 54,5 g/L con un rendimiento de 0,43 mol/mol, y la concentración y el rendimiento fueron de 12,2 g/L y 0,11 mol/mol para el 1,3-propanediol, 21,3 g/L y 017 mol/mol para el 2,3-butanediol, y 9,3 g/L y 0,11 mol/mol para el acetato en 51 h (Fig. 4).
Los perfiles de densidad celular, 3-HP y otros metabolitos por la cepa JJQ02(pUC18-kan-aldH) en un biorreactor de 300 L. OD650 (triángulo que apunta hacia arriba); 3-HP (círculo negro); PDO: 1,3-propanediol (triángulo que apunta hacia abajo); BDO: 2,3-butanediol (triángulo posterior apuntando a la izquierda); acetato (diamante negro); la flecha negra representa el punto de tiempo para reducir la tasa de aireación
En comparación con los resultados obtenidos en el reactor de 5 L, el título y el rendimiento molar del 2,3-butanediol en el reactor de 300 L aumentaron de forma evidente, siendo similares a los de la misma cepa en el reactor de 5 L a una tasa de aireación constante de 1 vvm. Esto implica que la transferencia de oxígeno en el reactor de 300 L podría ser algo mayor que en el reactor de 5 L con una tasa de aireación reducida, ya que algunas investigaciones han indicado que la producción de 2,3-butanediol requiere una tasa de aireación adecuada (Cheng et al. 2004; Shi et al. 2014; Xu et al. 2014). Bajo la condición de aireación en el reactor de 300 L, la expresión de las enzimas relacionadas con la formación de 2,3-butanediol y el pool de NADH o la relación NADH/NAD+ promovieron la producción de 2,3-butanediol, y la expresión de DhaB y AldH podría verse ligeramente afectada.
Con vistas al equilibrio redox, en la cepa ldhA dhaT doblemente mutante, el NADH formado en la reacción catalizada por ALDH se regeneró en parte a través de la formación de 2,3-butanediol y otros metabolitos reducidos como el etanol y el succinato, y en parte por la cadena de transporte de electrones (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b). Por lo tanto, la tasa de aireación en la fermentación por microaireación afectó significativamente a los productos finales. En la fermentación en el reactor de 300 L, aunque la tasa de aireación se redujo a la mitad de la inicial, la situación de la transferencia de oxígeno podría seguir siendo muy diferente de la del reactor de 5 L debido a las diferentes características de transferencia de oxígeno, que era un tema tradicional en el escalado de bioprocesos. Las diferencias en la distribución de los productos en los distintos reactores indicaban la importancia de un control preciso del suministro de oxígeno, mientras que la sola reducción de la tasa de aireación parecía demasiado aproximada. Sin embargo, aunque el título y el rendimiento de la 3-HP diferían ligeramente de los del reactor de 5 L, el escalado tuvo éxito. Dado que el rendimiento de la transferencia de oxígeno en el reactor de 300 L era diferente al del reactor de 5 L, se esperaba que una regulación más precisa de la tasa de aireación en el reactor de 300 L podría mejorar el nivel de 3-HP.