Prueba de activación de basófilos: ¿provocación de alimentos en un tubo de ensayo o herramienta de investigación especializada?

El estándar de oro para el diagnóstico de la alergia alimentaria es la provocación oral de alimentos (OFC). Sin embargo, la prueba oral requiere la ingestión del alimento sospechoso y puede provocar una reacción alérgica aguda, que puede ser grave. Por este motivo, la prueba oral de alimentos debe realizarse en un entorno supervisado con las instalaciones y los conocimientos necesarios para tratar las reacciones alérgicas y la anafilaxia, en caso de que se produzcan. La OFC puede provocar una gran ansiedad en los pacientes, los padres e incluso el personal clínico, ya que implica un riesgo considerable. Por lo tanto, siempre que sea posible, el diagnóstico de alergia alimentaria se establece mediante una historia reciente y convincente de una reacción alérgica mediada por IgE al alimento culpable, combinada con pruebas de sensibilización a IgE al mismo alimento mediante una prueba de punción cutánea (SPT) y/o IgE específica en suero (sIgE) . Las OFC se reservan para los casos en los que los resultados de la SPT y/o la sIgE son equívocos. Con el aumento de la concienciación y de la prevalencia de la alergia a los alimentos y de la sensibilización a los mismos, cada vez más pacientes se someten a pruebas de alergia alimentaria. La ausencia de una historia de exposición oral a alimentos alergénicos, que haya dado lugar a una reacción alérgica o en ausencia de síntomas clínicos, puede hacer que la interpretación de los resultados de la SPT y la sIgE sea especialmente difícil. Los lactantes y los niños pequeños que nunca han tomado ciertos alimentos alergénicos constituyen una proporción considerable de los pacientes atendidos en las clínicas de alergia y a menudo necesitan una prueba OFC para aclarar su estado alérgico. Esto hace que aumente la demanda de realización de OFC. Los servicios de alergia tienen dificultades para responder a esta demanda y los pacientes pueden tener que esperar varios meses antes de que se les ofrezca un diagnóstico exacto de alergia alimentaria o de tolerancia a los alimentos por parte de la OFC, lo que puede dar lugar a restricciones dietéticas innecesarias y a una importante ansiedad asociada a la incertidumbre del diagnóstico. La OFC es también el estándar de oro para evaluar la resolución de la alergia alimentaria, para determinar la dosis umbral y para controlar la respuesta clínica a los tratamientos inmunomoduladores para la alergia alimentaria. En los estudios de investigación, los pacientes alérgicos suelen tener que someterse a repetidas OFC para evaluar si ha habido alguna mejora clínica.

La BAT, al ser un ensayo funcional, tiene el potencial de asemejarse más al fenotipo clínico de los pacientes que las pruebas de alergia que se limitan a detectar la presencia de IgE específica del alérgeno. En términos sencillos, el BAT puede considerarse como un OFC en un tubo de ensayo, en el que en lugar de dar el alimento a un niño por la boca, los basófilos implicados en las reacciones alérgicas agudas se exponen a un extracto de alimento en un tubo de ensayo. A pesar de la analogía, se pueden señalar diferencias entre los dos procedimientos y sus aplicaciones clínicas y aquí se plantea la cuestión de si la MTD puede imitar fielmente la OFC estándar de oro, es decir, si la MTD puede reproducir in vitro la reacción alérgica que ocurre in vivo durante una OFC positiva.

La prueba de activación de basófilos

La BAT es un ensayo basado en la citometría de flujo en el que se mide la expresión de marcadores de activación en la superficie de los basófilos tras la estimulación con alérgenos -Fig. 1. Una prueba de activación de basófilos positiva puede considerarse un sustituto in vitro de una reacción alérgica aguda in vivo. En un estudio de pacientes alérgicos al veneno de himenópteros, se observó una regulación al alza de los marcadores de activación de los basófilos tanto in vitro tras la estimulación con veneno de chaqueta amarilla o abeja melífera como ex vivo tras una prueba de picadura positiva. En el mismo estudio, hubo una concordancia general entre la presentación clínica (reacción sistémica frente a reacción local amplia) y los resultados del MTD, lo que sugiere que el MTD es un biomarcador potencial de anafilaxia. También en los pacientes alérgicos a alimentos se encontró una buena concordancia entre los resultados del MTD y el resultado de la OFC. En los pacientes alérgicos al alfa-gal con reacciones alérgicas retardadas de tipo inmediato a la carne roja, la activación de los basófilos ex vivo en la sangre recogida en diferentes puntos temporales coincidió con el desarrollo de reacciones alérgicas sistémicas in vivo durante la OFC . Los resultados de este estudio refuerzan el papel de los basófilos en las reacciones alérgicas mediadas por IgE inducidas por alimentos y en la anafilaxia.

Pueden utilizarse diferentes marcadores de la superficie celular para identificar los basófilos en sangre total, incluyendo IgE, CD123 (con HLA-DR), CCR3 o CRTH2 (con CD3) o CD203c .

En la sangre periférica, la IgE se detecta en los basófilos, las células dendríticas, los eosinófilos, los monocitos, los macrófagos, las células B y las plaquetas, por lo que no es específica para los basófilos. El CD123 es la subunidad de baja afinidad (α) del receptor de la IL-3. Se expresa en altos niveles en las células dendríticas plasmocitoides y en los basófilos, y en bajos niveles en los monocitos, los eosinófilos, las células dendríticas mieloides y los subconjuntos de células progenitoras hematológicas. La tinción adicional con HLA-DR discrimina entre basófilos HLA-DR negativos y células dendríticas y monocitos HLA-DR positivos. CCR3 es el receptor de las quimiocinas de tipo C-C (por ejemplo, eotaxina, MCP y RANTES) y se expresa en gran medida en los basófilos y eosinófilos, pero también en las células Th1 y Th2. CRTH2 es otro marcador que expresan los basófilos, los eosinófilos y las células T y, por tanto, al igual que CCR3, requiere un marcador de células T, como CD3, para distinguir los basófilos de las células T. CD203c se expresa de forma constitutiva y específica en los basófilos y, por lo tanto, puede utilizarse como marcador de identificación único o en combinación con otros marcadores.

Después de la estimulación con alérgenos, la expresión de diferentes proteínas se regula al alza en la superficie de los basófilos, concretamente CD63 y CD203c. CD63 es una proteína de membrana asociada a los lisosomas (LAMP), que no se expresa en la superficie de los basófilos en reposo, sino sólo en la membrana de los gránulos del interior de las células. Cuando los gránulos se fusionan con la membrana plasmática de los basófilos durante la degranulación, CD63 se expresa en la superficie de los basófilos . CD203c es una enzima que escinde los enlaces fosfodiéster y fosfosulfato, eliminando hidrolíticamente los 5′-nucleótidos sucesivamente de los 3′-hidroxi-terminales de los oligonucleótidos. Se expresa exclusiva y constitutivamente en niveles bajos en la superficie de basófilos y mastocitos y su expresión aumenta con la activación celular. Los marcadores de activación de los basófilos parecen formar dos grupos distintos de marcadores que se regulan al alza de forma concomitante: uno que incluye CD63, CD107a y CD107b y otro que incluye CD203c, CD13 y CD164. CD63 y CD203c son los marcadores de activación de basófilos más utilizados.

El procedimiento de laboratorio del MTD consta de tres etapas: estimulación celular, tinción celular y citometría de flujo-Fig. 1. La sangre debe procesarse lo antes posible tras la extracción de sangre, ya que los basófilos pierden su viabilidad y reactividad con el tiempo. Sin embargo, se han realizado estudios con muestras almacenadas a +4 °C hasta 24 h . Se requiere un pequeño volumen de sangre (c.a. 1-2 ml dependiendo del número de condiciones) para la MTD. Para la estimulación celular se pueden utilizar extractos de alérgenos crudos o alérgenos purificados o recombinantes. Deben utilizarse diferentes concentraciones de alérgenos, ya que la sensibilidad de los basófilos a la estimulación de alérgenos específicos varía entre los pacientes.

Los resultados de la MTD pueden determinarse en términos de porcentaje de basófilos que expresan el marcador de activación definido o en términos de intensidad media de fluorescencia (IMF) calculando el índice de estimulación, es decir, la relación entre la IMF de la condición seleccionada y la IMF del control negativo. El primero se suele utilizar para el CD63, ya que éste no se expresa en las células en reposo y su expresión tras la activación es bimodal. La segunda suele utilizarse para el CD203c, que ya se expresa en las células en reposo y su aumento tras la estimulación con alérgenos es unimodal-Fig. 2.

En los pacientes alérgicos, la activación de los basófilos inducida por el alérgeno suele dar lugar a una curva dosis-respuesta en forma de campana, en la que las concentraciones crecientes del alérgeno (normalmente 5-6 log de diferencia) conducen a un aumento progresivo de la expresión de los marcadores de activación de los basófilos hasta alcanzar una meseta-Fig. 3.

Hay un gran grado de variabilidad en la respuesta de los basófilos al alérgeno entre individuos. Para expresar esta heterogeneidad y comparar las respuestas de los basófilos entre diferentes pacientes, se pueden determinar varios parámetros basados en la curva dosis-respuesta, como la CD-max y la EC50 (50 % de concentración efectiva) o CDsens. CD-max es la activación máxima y corresponde a la proporción máxima de basófilos activados a cualquier concentración de alérgeno . La EC50 es la dosis efectiva al 50 % de la activación máxima, y también puede representarse como CDsens. Descrita por primera vez por Johansson, la CDsens es la inversa de la concentración efectiva semimáxima, es decir, la concentración a la que la activación de los basófilos es la mitad de la activación máxima, multiplicada por 100, y puede calcularse mediante la fórmula CDsens = 1/EC50 × 100. CDmax y CDsens son medidas de la reactividad de los basófilos y de la sensibilidad de los basófilos, respectivamente. La reactividad de los basófilos puede definirse como el grado de activación de los basófilos, es decir, la proporción de basófilos activados, y también puede medirse como el porcentaje de basófilos CD63 positivos a diferentes concentraciones de alérgenos o como la relación del porcentaje de CD63 positivos tras la estimulación con alérgenos y con anti-IgE. La sensibilidad de los basófilos se refiere a la concentración de alérgeno a la que los basófilos se activan y puede expresarse como un porcentaje de la dosis efectiva máxima (por ejemplo, EC5, EC10) aparte de la EC50 y la CDsens, mencionadas anteriormente. La figura 3 representa la respuesta de los basófilos de dos individuos diferentes, uno con mayor reactividad y sensibilidad de los basófilos (azul) y el otro con menor reactividad y sensibilidad de los basófilos (rojo), es decir, con una menor proporción de basófilos que se activan en respuesta a concentraciones más altas del alérgeno. Shreffler y Patil han propuesto un nuevo parámetro para medir las respuestas de los basófilos, el área bajo la curva dosis-respuesta, que tiene la ventaja de combinar la reactividad y la sensibilidad de los basófilos.

Utilización de la prueba de activación de los basófilos para diagnosticar alergias alimentarias

En un estudio publicado recientemente, se evaluó la utilidad de la BAT para diagnosticar la alergia al cacahuete en una población bien caracterizada de niños alérgicos al cacahuete, sensibilizados y no sensibilizados. La BAT mostró una alta precisión (97 %) en el diagnóstico de la alergia al cacahuete y permitió reducir el número de OFC requeridas en un 66 %. Validamos los puntos de corte diagnósticos en una población reclutada de forma prospectiva e independiente y el rendimiento diagnóstico del MTD siguió siendo muy bueno en esta segunda población de estudio. En los últimos años, otros estudios han evaluado el rendimiento del MTD en el diagnóstico de la alergia a diferentes alimentos, como el cacahuete, la leche de vaca, el huevo, el trigo, la avellana, el marisco y el melocotón, así como en el diagnóstico de los síndromes polínico-alimentarios (tabla 1). Informes de casos y pequeñas series de casos han sugerido que el MTD también puede ser útil para diagnosticar la alergia al sésamo y a elicitores menos comunes de reacciones alérgicas alimentarias mediadas por IgE, como el arroz y los galactooligosacáridos de cadena corta presentes en los prebióticos . Un documento de posición recientemente publicado por la Academia Europea de Alergia e Inmunología Clínica revisa las aplicaciones clínicas de la MTD.

Varios factores pueden influir en el rendimiento diagnóstico y en los valores de corte de la MTD en diferentes estudios, algunos relacionados con la población estudiada, otros con el diseño del estudio, otros con el procedimiento de laboratorio y con la metodología adoptada para los análisis de datos-Tabla 2. Los estudios existentes son heterogéneos en la mayoría de estos aspectos, lo que limita su comparabilidad y una aplicación más amplia de los puntos de corte diagnósticos determinados en estudios específicos. El criterio para diagnosticar cada alergia alimentaria es específico para cada alérgeno y la precisión diagnóstica puede no ser la misma para diferentes alérgenos. Además, los puntos de corte definidos en una población no son necesariamente transferibles de forma directa a otra población de una ubicación geográfica diferente evaluada en un centro de Alergia diferente. Una limitación del MTD es el hecho de que una pequeña proporción de pacientes evaluados tienen basófilos no respondedores (es decir, basófilos que responden a un control positivo no mediado por IgE pero no a los estimulantes mediados por IgE) y, por tanto, tienen un resultado no interpretable para la prueba. Los retos adicionales para trasladar el MTD de un método de investigación a una prueba diagnóstica en la clínica están relacionados con la estandarización del ensayo y su reproducibilidad y también con la rentabilidad de incluir el MTD en el enfoque diagnóstico de los pacientes con sospecha de alergia alimentaria. Estos aspectos aún no se han establecido y requieren más investigación.

La metodología adoptada para realizar el procedimiento de laboratorio y para analizar los datos de la citometría de flujo puede tener un impacto significativo en los resultados obtenidos para la MTD y, en consecuencia, en su precisión diagnóstica. Por ejemplo, la identificación de basófilos mediante un anticuerpo anti-IgE puede activar las células y alterar los resultados obtenidos con un método diferente para identificar los basófilos. La expresión de ciertos marcadores de identificación de basófilos, como CCR3 y CD123, puede cambiar tras la activación de los basófilos. En un estudio reciente, describimos que en aproximadamente una cuarta parte de los pacientes, la expresión de CD123, detectada por citometría de flujo, puede reducirse tras la activación de los basófilos y, por lo tanto, dar lugar a una pérdida significativa en los análisis de las células activadas utilizando métodos que se basan en este marcador para identificar a los basófilos. Esto podría dar lugar a un mayor número de diagnósticos erróneos, especialmente de falsos negativos, con importantes consecuencias para los pacientes individuales. La adición del marcador específico de basófilos CD203c a la estrategia de gating conservó el número de células y permitió reducir el número de falsos negativos (del 5 al 1 %). La estrategia de separación modificada mejoró tanto la sensibilidad (del 88 al 98 %) como la especificidad (del 94 al 96 %) del MTD, lo que dio como resultado una mejora general de la precisión del MTD para diagnosticar la alergia al cacahuete del 91 al 97 % (Fig. 4). Para realizar e interpretar la MTD con éxito, «el diablo está en los detalles»; por lo tanto, es muy importante considerar cuidadosamente los aspectos metodológicos de la MTD.

En general, como prueba diagnóstica, BAT ha mostrado una alta especificidad y valor predictivo positivo. Hemos validado los puntos de corte diagnósticos determinados para la alergia al cacahuete en una población independiente reclutada prospectivamente y la especificidad y el valor predictivo positivo de la MTD alcanzaron el 100 %. La alta especificidad es un complemento importante a las pruebas de alergia existentes, como la SPT y la sIgE, que tienen una alta sensibilidad pero no son muy específicas. La alta especificidad implica que una BAT positiva confirma con seguridad el diagnóstico de alergia alimentaria, pero una BAT negativa no excluye necesariamente el diagnóstico. Dependiendo de la relación coste-beneficio y de los aspectos de seguridad, la OFC puede realizarse en pacientes en los que la MTD proporciona un resultado no concluyente (es decir, pacientes con basófilos no respondedores) o en pacientes en los que la MTD proporciona un resultado no concluyente y en pacientes en los que la MTD fue negativa.

El enfoque para decidir sobre la necesidad de la OFC tras la MTD también depende de cómo se considere el resultado de la MTD en el contexto de los resultados de otras pruebas de alergia, ya sea de forma combinada, cuando todos los resultados disponibles se consideran simultáneamente, o de forma secuencial, cuando la MTD se realiza sólo en pacientes que tuvieron resultados equívocos o discordantes en las otras pruebas de alergia. En nuestro estudio sobre el cacahuete citado anteriormente, comparamos el rendimiento de la MTD con el de otras pruebas de alergia realizadas en paralelo. La BAT obtuvo mejores resultados que la SPT, la IgE específica al cacahuete y la IgE específica al Ara h 2 y otros componentes del cacahuete. Considerando las pruebas individuales, la prueba diagnóstica más precisa fue la MTD. Para aprovechar al máximo la información disponible, los resultados del MTD pueden utilizarse en combinación con los resultados de otras pruebas . Sin embargo, en general, cuantas más pruebas se utilicen, mayor será la incertidumbre diagnóstica (y mayor el número de OFC) dado que las diferentes pruebas pueden proporcionar resultados contradictorios . Mejor que combinar los resultados de las pruebas de alergia de forma simultánea puede ser utilizar las MTD de forma secuencial en el trabajo de diagnóstico de la alergia alimentaria, en los pacientes que tuvieron un resultado no concluyente en las otras pruebas de alergia . Este enfoque puede ser ventajoso también desde el punto de vista de la viabilidad, teniendo en cuenta los aspectos prácticos que conlleva la realización de la MTD, a saber, la necesidad de sangre fresca y los recursos y conocimientos técnicos necesarios. No sería práctico, ni siquiera necesario, realizar la MTD en todos los pacientes que se investigan por sospecha de alergia alimentaria. La MTD puede reservarse para casos seleccionados, en particular los casos en los que no hay antecedentes de exposición oral al alimento o la historia clínica no está clara y los resultados de SPT e IgE específica no son concluyentes . La MTD podría utilizarse como segundo paso en el trabajo diagnóstico, tras la historia clínica y la SPT y/o la sIgE, en los casos difíciles, antes de decidir si se requiere una OFC -Fig. 5-. La precisión diagnóstica y la superioridad de la MTD sobre la prueba de punción cutánea y la IgE específica deben evaluarse con otros alérgenos y en otros entornos clínicos.

Además de distinguir a los pacientes alérgicos a los alimentos de los que los toleran, los resultados de la BAT pueden proporcionar información adicional sobre las características de las reacciones inducidas por los alimentos que puede ser útil en el tratamiento de los pacientes alérgicos . Se ha demostrado que diferentes parámetros de la MTD reflejan diferentes características de las reacciones alérgicas; la proporción de basófilos activados (reactividad de los basófilos) refleja la gravedad de los síntomas alérgicos y la dosis a la que los basófilos reaccionan al alérgeno in vitro (sensibilidad de los basófilos) refleja la dosis de proteína alimentaria a la que los pacientes reaccionaron durante la OFC . Estos resultados en la alergia al cacahuete se han reproducido en un estudio publicado posteriormente y pueden ser aplicables a otras alergias alimentarias. En cualquier caso, el resultado de la MTD debe tomarse en el contexto de otras características clínicas y factores de riesgo de gravedad, al evaluar a los pacientes alérgicos a los alimentos.

Utilización de la prueba de activación de basófilos para monitorizar la adquisición de tolerancia a los alimentos y la respuesta clínica a los tratamientos inmunomoduladores para la alergia alimentaria

Refleja estrechamente el fenotipo clínico de los pacientes alérgicos y tolerantes, El MTD puede ser útil para evaluar la resolución natural de las alergias alimentarias que suelen superarse con el tiempo, como las alergias a la leche de vaca, al huevo y al trigo, y para determinar cuándo hay que volver a desafiar a los pacientes para evaluar si el alimento puede reintroducirse en la dieta. El MTD ha demostrado distinguir diferentes fenotipos de pacientes con alergias a la leche de vaca y al huevo, es decir, pacientes que toleran formas muy calentadas de estos alimentos pero que siguen reaccionando a los alimentos no calentados, de pacientes que reaccionan tanto a la leche o al huevo muy calentados como a los no calentados.

El MTD también se ha utilizado para monitorizar la respuesta clínica a los tratamientos inmunomoduladores para la alergia alimentaria en estudios de investigación. En general, en los estudios de inmunoterapia para alimentos como el cacahuete , la leche de vaca y el huevo , la BAT ha mostrado una disminución de la reactividad de los basófilos a los respectivos alérgenos alimentarios con el tratamiento, que es particularmente evidente en las concentraciones más bajas del alérgeno, lo que refleja la disminución de la sensibilidad de los basófilos. Curiosamente, Thyagarajan et al. demostraron que, durante la IOT del cacahuete, la reducción de la activación de los basófilos no sólo se producía en respuesta al cacahuete, sino también al alérgeno del huevo (en los pacientes alérgicos al huevo) y al anti-IgE, pero no al control positivo no mediado por el IgE, el fMLP (formil-metionil-leucil-fenilalanina), lo que sugiere que la vía descendente del receptor de IgE se ha vuelto anérgica. En un estudio sobre el omalizumab en pacientes alérgicos al cacahuete, la expresión de CD203c en el MTD disminuyó durante el tratamiento y volvió a los niveles previos al mismo tras el cese de esta terapia. Por último, el medicamento chino a base de hierbas FAHF-2 también mostró un efecto inhibidor significativo en la respuesta de los basófilos en pacientes con alergia a diferentes alimentos en paralelo con la mejora clínica.

En conjunto, estos estudios ilustran que el MTD puede repetirse en los mismos pacientes a lo largo del tiempo para evaluar los cambios en la respuesta inmunitaria a los alérgenos alimentarios con algún tipo de intervención, ya sea inmunoterapia oral, inmunoterapia sublingual, omalizumab u otras estrategias terapéuticas o preventivas inmunomoduladoras.

Perspectivas de futuro

Con vistas a la aplicación de la MTD al diagnóstico de la alergia alimentaria en la práctica clínica, es necesario seguir investigando para definir y validar los puntos de corte diagnósticos para alérgenos específicos y en diferentes poblaciones de pacientes. La estandarización de los procedimientos de laboratorio sería importante para permitir la comparabilidad de los resultados de la MTD entre centros. Esto requeriría la estandarización del protocolo para el ensayo in vitro y de los métodos de citometría de flujo y análisis de datos. El uso de una metodología similar para la MTD permitiría comparar los resultados de la MTD en diferentes centros, tanto con fines clínicos como de investigación, incluso en estudios multicéntricos.

Una vez validada adecuadamente para el diagnóstico de alergias alimentarias específicas, la MTD puede utilizarse para monitorizar la respuesta clínica a tratamientos inmunomoduladores como la inmunoterapia específica con alérgenos y los productos biológicos. La MTD también tiene un enorme potencial para realizar estudios mecanísticos que mejoren nuestra comprensión del papel de los basófilos en los mecanismos inmunitarios de la alergia alimentaria y la tolerancia a los alimentos.