Regulación de acetato y acetil-CoA durante el crecimiento en acetato y/o glucosa en la arquea halófila Haloarcula marismortui

Abstract

Haloarcula marismortui formó acetato durante el crecimiento aeróbico en glucosa y utilizó acetato como sustrato de crecimiento. En las mezclas de glucosa/acetato se observó un crecimiento diauxico con la glucosa como sustrato preferido. Se analizó la regulación de las actividades enzimáticas relacionadas con el metabolismo de la glucosa y el acetato. Se descubrió que tanto la glucosa deshidrogenasa (GDH) como la acetil-CoA sintetasa formadora de ADP (ACD) estaban reguladas al alza durante los períodos de consumo de glucosa y formación de acetato, mientras que la acetil-CoA sintetasa formadora de AMP (ACS) y la malato sintasa (MS) estaban reguladas a la baja. Por el contrario, durante los periodos de consumo de acetato se observó una regulación al alza de la ACS y la MS y una regulación a la baja de la ACD y la GDH. La MS también se reguló al alza durante el crecimiento con péptidos en ausencia de acetato. A partir de los datos concluimos que una ACD inducible por glucosa cataliza la formación de acetato mientras que la activación del acetato es catalizada por una ACS inducible por acetato; tanto la ACS como la MS son aparentemente inducidas por el acetato y reprimidas por la glucosa.

1 Introducción

Varias arqueas halófilas, entre ellas Haloarcula marismortui, crecen con glucosa, que se degrada a través de una vía Entner-Doudoroff (ED) modificada y semifosforilada. Se ha demostrado que durante el crecimiento exponencial en glucosa se forman cantidades significativas de acetato . Estudios recientes indican que la formación de acetato a partir de acetil-CoA en las arqueas halófilas está catalizada por una acetil-CoA sintetasa formadora de ADP (ACD) (acetil-CoA + ADP + Pi⇆ acetato + ATP + CoA). Esta inusual sintetasa se encontró en todas las arqueas formadoras de acetato, incluidos los hipertermófilos anaerobios, y representa un mecanismo novedoso en procariotas de formación de acetato y síntesis de ATP. En las arqueas anaerobias hipertermófilas, por ejemplo Pyrococcus furiosus, la ACD representa la principal reacción de conservación de energía durante el metabolismo de los azúcares, el piruvato y los péptidos. En contraste con el mecanismo de una enzima de las arqueas, todas las bacterias utilizan el mecanismo «clásico» de dos enzimas para la conversión de acetil-CoA en acetato, en el que intervienen la fosfato acetiltransferasa (PTA) y la acetato quinasa (AK).

Se ha informado de que varias haloarchaea, incluyendo H. marismortui, Haloferax volcanii y Halorubrum saccharovorum crecen con acetato como sustrato. El metabolismo del acetato se inicia con su activación a acetil-CoA. Recientemente, hemos aportado las primeras pruebas de que la activación del acetato a acetil-CoA en las haloarchaea está catalizada por una acetil-CoA sintetasa formadora de AMP (ACS) (acetato + ATP + CoA → acetil-CoA + AMP + PPi) . La ACS es la principal enzima de activación del acetato para la mayoría de los organismos que utilizan el acetato de los tres dominios de la vida . Sólo unas pocas bacterias, por ejemplo Corynebacterium glutamicum, y también la arquea metanogénica acetoclástica Methanosarcina ssp. activan el acetato a acetil-CoA a través del par AK/PTA . Así, la vía AK/PTA puede operar de forma reversible in vivo, es decir, tanto en el sentido de la formación de acetato como en el de su activación. Por el contrario, los primeros análisis sugieren que en las haloarqueas la ACD, la contraparte arquea del par AK/PTA, opera in vivo en la dirección de la formación de acetato, aunque la enzima cataliza una reacción reversible in vitro.

Para dilucidar aún más el papel fisiológico y obtener los primeros conocimientos sobre la regulación dependiente del sustrato de las enzimas convertidoras de acetato y acetil-CoA en haloarchaea, llevamos a cabo experimentos de cambio de sustrato con H. marismortui, y analizamos el crecimiento en glucosa, acetato, mezclas de glucosa/acetato y péptidos. Durante el crecimiento se analizaron los perfiles de actividad de las enzimas convertidoras de acetato y acetil-CoA, ACD y ACS, así como de la glucosa deshidrogenasa, la primera enzima en la degradación de la glucosa a través de la vía ED modificada. Además, se determinaron las actividades de la malato sintasa, una enzima clave del ciclo del glioxilato, que se ha propuesto que sea operativa en las haloarchaea.

2 Materiales y métodos

2.1 Crecimiento de H. marismortui en glucosa, acetato, mezclas de glucosa/acetato y en péptidos

Haloarcula marismortui se cultivó aeróbicamente a 37 °C en un medio complejo que contenía extracto de levadura, casaminoácidos y, además, glucosa y/o acetato, tal como se ha descrito anteriormente . Para el crecimiento en la mezcla de glucosa/acetato, este medio se complementó con 12,5 mM de glucosa y 30 mM de acetato. El crecimiento en péptidos se realizó en el medio complejo en ausencia de acetato y glucosa. Los experimentos de crecimiento se llevaron a cabo en fermentadores de 2 l (fairmen tec, Alemania) con una velocidad de agitación de 500 rpm y un caudal de aire comprimido de 600 ml por minuto. El crecimiento se siguió midiendo la densidad óptica a 578 nm (ΔOD578). Un ΔOD578 de 1 correspondía a un contenido de proteínas de 0,5-0,6 mg/ml. La glucosa y el acetato se determinaron enzimáticamente como se describe en .

2.2 Preparación de extractos celulares

En varias fases de crecimiento se cosecharon células de H. marismortui (100-200 ml del cultivo) y se prepararon extractos celulares como se describe en . La proteína se determinó por el método de Bradford utilizando albúmina de suero bovino como estándar.

2.3 Determinación de las actividades enzimáticas

Todos los ensayos enzimáticos se realizaron en condiciones aeróbicas a 37 °C en cubetas llenas de 1 ml de mezcla de ensayo. Las enzimas auxiliares se añadieron generalmente poco antes del inicio de la reacción y se aseguró que estas enzimas no fueran limitantes de la tasa. Una unidad (1 U) de actividad enzimática se define como 1 μmol de sustrato consumido o producto formado por minuto.

• La acetil-CoA sintetasa (formadora de ADP) (ACD) (C.E. 6.2.1.13) se midió como se describe en .

• La acetil-CoA sintetasa (formadora de AMP) (ACS) (C.E. 6.2.1.13).C. 6.2.1.1.) se monitorizó la liberación de HSCoA dependiente de PPi y AMP a partir de acetil-CoA según Srere et al. con el reactivo tiol de Ellman, 5′5-ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), midiendo la formación de anión tiofenolato a 412 nm (ε412= 13,6 mM-1 cm-1). La mezcla de ensayo contenía 100 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1,25 M de KCl, 2,5 mM de MgCl2, 0,1 mM de DTNB, 1 mM de acetil-CoA, 2 mM de AMP, 2 mM de PPi y extracto.

• La malato sintasa (C.E. 4.1.3.2.) se monitorizó en un ensayo modificado según Serrano et al. con DTNB. La mezcla de ensayo contenía 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 3 M de KCl, 30 mM de MgCl2, 0,1 mM de DTNB, 0,2 mM de acetil-CoA, 0,5 mM de glioxilato y extracto.

• La glucosa deshidrogenasa (C.E. 1.1.1.47) se midió según Johnsen et al. .

• La acetato quinasa (C.E. 2.7.2.1.) se midió como se describe en .

• La fosfotransacetilasa (C.E. 2.3.1.8.) se monitorizó como liberación de HSCoA dependiente de Pi a partir de acetil-CoA con DTNB . La mezcla de ensayo contenía 100 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 3 M de KCl, 30 mM de MgCl2, 0,1 mM de DTNB, 1,5 mM de acetil-CoA, 5 mM de KH2PO4 y extracto.

3 Resultados

Para investigar la función fisiológica y la regulación de las enzimas relacionadas con el metabolismo del acetato y del acetil-CoA, se utilizaron células de H. marismortui precrecidas en diferentes sustratos se cambiaron a un medio que contenía acetato y/o glucosa y péptidos, respectivamente, y se analizaron los perfiles de actividad de ACD, ACS, GDH y MS.

3.1 Crecimiento de células adaptadas al acetato en glucosa

Después de una fase de latencia las células crecieron exponencialmente y la glucosa se consumió por completo. Paralelamente al consumo de glucosa se formaron cantidades significativas de acetato. En este periodo aumentaron las actividades de GDH y ACD, mientras que las actividades de ACS y MS, que eran activas en las células adaptadas al acetato, se redujeron completamente. En la fase estacionaria, el acetato excretado se reconsumió completamente y las actividades de ACS y MS aumentaron, mientras que las actividades de GDH y ACD disminuyeron (Fig. 1).

3.2 Crecimiento de células adaptadas a la glucosa en acetato

Las células adaptadas a la glucosa crecieron en un medio que contenía acetato inicialmente (unas 30 h) con un tiempo de duplicación de 10 h hasta una densidad óptica (ΔOD578) de 1. En esta fase de crecimiento no se observó consumo de acetato y las células crecieron sobre los péptidos presentes en el medio. Tras este periodo, las células crecieron con una tasa de crecimiento reducida hasta una ΔOD578 de 1,8 y el acetato se consumió por completo. Durante el consumo de acetato las actividades ACD y GDH disminuyeron, mientras que las actividades ACS y MS, que no pudieron detectarse en las células adaptadas a la glucosa, aumentaron. El aumento de la actividad MS comenzó durante el crecimiento en péptidos, mientras que el aumento de la actividad ACS fue paralelo al consumo de acetato (Fig. 2).

3.3 Crecimiento en mezclas de glucosa/acetato

Células de H. marismortui adaptadas al extracto de levadura y a los casaminoácidos se transfirieron a un medio que contenía tanto glucosa como acetato. Las células mostraron un crecimiento diauxico con utilización secuencial de la primera glucosa y del segundo acetato. En la primera fase de crecimiento las células crecieron hasta un ΔOD578 de 4,0 y se consumió la glucosa. Tras el consumo de glucosa y una breve fase de latencia, las células entraron en la segunda fase de crecimiento, en la que se metabolizó el acetato y las células crecieron hasta un ΔOD578 final de 5,2. En la primera fase de crecimiento, paralela al consumo de glucosa, aumentaron las actividades de ACD y GDH, mientras que la actividad de ACS no pudo detectarse y la de MS se redujo completamente. En la segunda fase de crecimiento paralela a la utilización de acetato, las actividades ACS y MS aumentaron y las actividades ACD y GDH disminuyeron (Fig. 3).

3.4 Células adaptadas a la glucosa sobre péptidos

Las células adaptadas a la glucosa se trasladaron a un medio que contenía 0,25% de extracto de levadura y 0,5% de casaminoácidos en ausencia tanto de glucosa como de acetato. Las células crecieron con un tiempo de duplicación de 13 h hasta un ΔOD578 de 2,5. No se pudo detectar la formación de acetato. Durante el crecimiento exponencial disminuyeron la ACD (de 60 a 20 mU/mg) y la GDH (de 80 a 40 mU/mg), y la actividad de la EM, que inicialmente no pudo detectarse, aumentó hasta 20 mU/mg. La actividad de ACS no pudo detectarse durante la fase de crecimiento exponencial, pero aumentó durante la fase estacionaria (13 mU/mg).

4 Discusión

En este trabajo analizamos el papel fisiológico de las enzimas convertidoras de acetato y acetil-CoA (ACD, ACS) en H. marismortui y damos la primera evidencia de la regulación específica de sustrato de estas enzimas, así como de GDH y MS. Los datos se discuten en comparación con sistemas bacterianos conocidos.

4.1 La formación de acetato en H. marismortui es catalizada por la ACD como parte del metabolismo de «desbordamiento»

Durante el crecimiento en glucosa y en mezclas de glucosa/acetato, las actividades tanto de la ACD como de la GDH aumentaron paralelamente a las fases de consumo de glucosa y formación de acetato (Figs. 1 y 3). Por el contrario, ambas actividades disminuyeron durante el crecimiento con acetato o péptidos. Estos datos y la ausencia de AK/PTA indican que la formación de acetato en Haloarcula es catalizada por la ACD. El papel fisiológico de la formación de acetato en H. marismortui y su regulación durante el crecimiento aeróbico en glucosa no se entiende; la formación de acetato podría ser parte de un metabolismo de «desbordamiento», que se ha estudiado con cierto detalle en varias bacterias, por ejemplo, Escherichia coli y Bacillus subtilis. Al igual que en H. marismortui, ambas bacterias excretan acetato durante el crecimiento aeróbico sobre el exceso de glucosa y lo reutilizan en la fase estacionaria . Se ha especulado que la excreción de acetato se produce en condiciones en las que la tasa de glucólisis supera la de las vías posteriores, por ejemplo, el ciclo del ácido cítrico y la respiración necesaria para la oxidación completa de la glucosa . En estas condiciones, el acetil-CoA se convierte en acetato y se excreta. De acuerdo con este punto de vista, los análisis transcripcionales realizados tanto en E. coli como en B. subtilis indican una inducción específica de la glucosa en los genes glucolíticos y una represión de los genes del ciclo del ácido cítrico y de la respiración. Recientemente se ha informado de una regulación transcripcional similar, específica de la glucosa, es decir, la regulación al alza de los genes glucolíticos de la vía Entner-Doudoroff modificada, y la regulación a la baja de algunos genes del ciclo del ácido cítrico y de la respiración en la arquea halófila H. volcanii. Por lo tanto, en las haloarqueas es probable un metabolismo de desbordamiento específico de la glucosa que da lugar a la formación de acetato. La formación de acetato en E. coli y B. subtilis implica el mecanismo bacteriano de dos enzimas a través de PTA y AK, mientras que en Haloarcula la formación de acetato es catalizada por ACD, el mecanismo arqueal de una enzima. Tanto en E. coli como en B. subtilis, se encontró que la glucosa induce la codificación de los genes pta y ack, lo que indica una regulación coordinada de la glucólisis y la formación de acetato. Hasta ahora, no se ha analizado la regulación transcripcional de la DAC formadora de acetato en la arquea H. marismortui. Sin embargo, la regulación coordinada de GDH y de la actividad de ACD sugiere una regulación transcripcional glucosa-específica similar de ambos glycolysis por la vía de Entner-Doudoroff modificada y de la formación del acetato por ACD.

Durante el crecimiento aeróbico en los péptidos H. marismortui no formó el acetato y la actividad de ACD fue downregulated. En este aspecto, Haloarcula difiere de la bacteria E. coli, que forma cantidades significativas de acetato durante el crecimiento aeróbico en péptidos en el curso de un metabolismo de «desbordamiento» . H. marismortui también se diferencia de la arquea anaerobia hipertermofílica P. furiosus y de otras arqueas anaerobias hipertermofílicas, que forman altas cantidades de acetato mediante ACD durante el crecimiento anaerobio tanto en azúcares como en péptidos. Durante la fermentación anaeróbica de péptidos y azúcares de P. furiosus, la formación de acetato por ACD representa el principal sitio de formación de ATP a través de la fosforilación a nivel de sustrato; en cambio, durante la degradación aeróbica de azúcares y péptidos por H. marismortui la mayor parte de la energía es conservada por la fosforilación del transporte de electrones en la cadena respiratoria y, por lo tanto, la formación de acetato por ACD es menos importante o prescindible. Así, la formación de acetato por ACD en Haloarcula parece estar restringida al metabolismo de azúcar en el curso de un metabolismo de «desbordamiento».

4.2 La activación de acetato a acetil-CoA en H. marismortui es catalizada por ACS

Esto fue concluido del upregulation de la actividad de ACS paralela al consumo de acetato (Figs. 1, 2, 3). Un papel del ACD en la activación del acetato podría ser descartado ya que el ACD fue regulado a la baja durante los períodos de consumo de acetato. Así, el ACD en Haloarcula está operando in vivo sólo en dirección a la formación de acetato. El ACD es también el mecanismo más común de activación del acetato en las bacterias, donde está estrictamente regulado; por ejemplo, en E. coli y B. subtilis, el gen acs es inducido por el acetato y reprimido por la glucosa . En Haloarcula, la regulación al alza de la actividad de ACS por el acetato y la regulación a la baja por la glucosa sugieren una regulación similar a nivel transcripcional a la reportada para las bacterias. Debe notarse que a diferencia de E. coli y B. subtilis, la bacteria C. glutamicum activa el acetato por una vía AK/PTA inducida por el acetato.

La actividad de la EM, una enzima clave del ciclo del glioxilato, se reguló al alza durante los períodos de consumo de acetato en H. marismortui junto con la ACS, lo que sugiere una regulación coordinada específica del acetato de la ACS y el ciclo del glioxilato anaplerótico. Tanto la actividad de MS como la de ACS fueron reguladas a la baja por la glucosa. La inducción coordinada específica del acetato de los genes de las enzimas de activación del acetato (véase más arriba) y de la vía del glioxilato se ha notificado en varias bacterias, incluidas E. coli y C. glutamicum. Recientemente, la primera evidencia para la inducción de ambos genes de sintasa de malato y liasa de isocitrato por el acetato se ha dado para el arqueo halófilo H. volcanii.

Sin embargo, la actividad de EM en vez de la actividad de ACS también se subió durante el crecimiento exponencial en péptidos en la ausencia de acetato que indica que la regulación de EM es más compleja y no se restringe al acetato. El papel de la EM (y del ciclo del glioxilato) en el metabolismo de los péptidos podría explicarse por el hecho de que muchos aminoácidos se degradan a acetil-CoA, lo que requeriría una vía funcional del glioxilato para el anabolismo. El aumento de la actividad de ACS, observado en la fase estacionaria durante el crecimiento en péptidos, no puede explicarse hasta ahora, podría deberse a una respuesta general al estrés de las células en fase estacionaria .

4.3 Represión catabólica específica de la glucosa en H. marismortui

Haloarcula marismortui mostró un crecimiento diauxico en mezclas de glucosa/acetato con la glucosa como sustrato preferido indicando algún tipo de represión catabólica de la utilización del acetato por la glucosa. La represión catabólica específica de la glucosa no se ha analizado hasta ahora en las arqueas. En las bacterias se ha estudiado en detalle la base molecular de la represión de los catabolitos de carbono por la glucosa, por ejemplo en E. coli y B. subtilis. Durante el crecimiento de C. glutamicum en mezclas de glucosa/acetato se ha descrito un crecimiento monofásico con consumo simultáneo de acetato y glucosa, mientras que en Azotobacter vinelandii el acetato es el sustrato preferido. Los principios reguladores que subyacen a estas características se están investigando actualmente.

Se necesitan más estudios para corroborar la propuesta de regulación específica del sustrato de las enzimas formadoras de acetato y activadoras de acetato, ACD y ACS, en relación con el metabolismo del acetato y la glucosa a nivel transcripcional. Estos estudios, que requieren la purificación y la identificación de los genes que codifican la ACD y la ACS de H. marismortui están en curso.

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Notas del autor