- Abstract
- 1. Introducción
- 2. Resultados y discusión
- 2.1. Síntesis de derivados de 4-hidroxicumarina
- 2.1.1. Síntesis de arilmetileno-β-cetoésteres
- 2.1.2. La adición Michael de arilmetileno-β-cetoésteres y arilmetileno-2,4-pentanediones a 4-hidroxicumarina
- 2.2. Docking molecular
- 2.3. Actividad Biológica en Cultivo Celular (Células MT-4)
- 3. Conclusión
- 4. Parte experimental
- 4.1. Síntesis de derivados de 4-hidroxicumarina
- 4.1.1. Materiales y métodos
- 4.1.2. Procedimiento general para la preparación de arilmetileno-β-cetoésteres
- 4.1.3. Procedimiento para la preparación de 3-(4-Hidroxi)-fenilmetileno-2,4-pentandiona (6)
- 4.1.4. Procedimiento general para la preparación de productos de condensación con 4-hidroxicumarina
- 4.1.5. La adición de Michael entre 3-(4-hidroxibencilideno)-2,4-pentanediona (SS-23) y 4-hidroxicumarina
- 4.2. Docking molecular
- 4.3. Líneas celulares y virus
- 4.4.1. Actividad endógena de la RT y efecto directo de los compuestos sobre la RT
- 4.4.2. Detección de la actividad antiproteasa mediante pruebas que utilizan la proteasa viral nativa
Abstract
Se sintetizaron racionalmente seis nuevos derivados de la 4-hidroxicumarina, que se verificaron y caracterizaron mediante acoplamiento molecular utilizando cristales de proteasa del VIH-1. Los estudios de acoplamiento molecular predijeron la actividad antiproteasa de (7) y (10). Los grupos funcionales más significativos, responsables de la interacción con la proteasa del VIH-1 mediante la formación de enlaces de hidrógeno, son el oxígeno del pirano, el átomo, el oxígeno del carbonilo de la lactona y uno de los grupos hidroxilos. Los compuestos recién sintetizados fueron probados biológicamente en células MT-4 para inhibir la replicación del VIH-1, explorando la protección de las células del efecto citopático del VIH medido por la supervivencia celular en la prueba MTT. Un derivado -7 mostró una inhibición del 76-78% de la infectividad del virus con IC50 = 0,01 nM, mucho menos que la concentración máxima no tóxica (1 mM). Se detectó que la actividad antiproteasa de 7 en dos concentraciones diferentes era del 25%. No obstante, los resultados del estudio de (7) animan a utilizarlo como farmacóforo para una mayor síntesis y evaluación de la actividad anti-VIH.
1. Introducción
La proteasa retroviral (PR) del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) es una de las enzimas clave para la replicación del virus. Escinde precursores de proteínas y glicoproteínas para producir enzimas virales activas y proteínas estructurales. La RP inactiva del VIH-1 da lugar a viriones no infecciosos. Este hecho estimuló la búsqueda de sustancias potentes con actividad antiproteasa que inhibieran la replicación del VIH-1. Durante los últimos 12 años, se han introducido clínicamente varios análogos peptidomiméticos -inhibidores de la RP del VIH-1 (IP)-, pero la mayor parte de ellos presentan características farmacológicas deficientes, como una mala biodisponibilidad oral, un aclaramiento rápido y problemas de tolerabilidad -a menudo asociados a la lipodistrofia y la dislipidemia-. Además, al ser peptidomiméticos, los aislados virales demuestran rápidamente un alto grado de resistencia y de resistencia cruzada, incluso cuando se utilizan los miembros del grupo antes de que los IP salieran al mercado.
El desarrollo de nuevos IP no peptídicos, como el Tipranavir y el Darunavir, mostraron una potencia impresionante contra los mutantes resistentes a los IP, por lo que siguen siendo una opción importante para los pacientes que albergan dicha resistencia . Esta es la razón para buscar nuevas sustancias no peptídicas inhibidoras de la proteasa del VIH-1. Los datos experimentales sobre algunas sustancias no peptídicas -4-hidroxicumarinas (Figura 1) y derivados de 4-hidroxipiranos que inhiben la PR del VIH-1, apoyan esta idea.
Estructura de la 4-hidroxicumarina.
Estando durante largos años interesados en la síntesis y evaluación de una serie de sustancias no peptídicas como los derivados de la 4-hidroxicumarina , nos animamos a ampliar estos experimentos. Aquí se presenta una serie de nuevas síntesis, acompañadas de experimentos de acoplamiento molecular mediante enzimas cristalinas y la evaluación de la actividad biológica de novedosos y prometedores derivados de la 4-hidroxicumarina.
2. Resultados y discusión
2.1. Síntesis de derivados de 4-hidroxicumarina
2.1.1. Síntesis de arilmetileno-β-cetoésteres
Para la síntesis de arilmetileno-β-cetoésteres mediante la reacción de Knoevenagel con acetoacetato de etilo en presencia de piperidina como agente básico y ácido acético glacial se utilizan aldehídos aromáticos con diferentes sustituciones. Estos arilmetileno-β-cetoésteres pueden presentarse como en la figura 2.
Estructura química general y síntesis de arilmetileno-β-cetoésteres.
También se realizó una reacción de 4-hidroxibenzaldehído y 2,4-pentanediona en las mismas condiciones mencionadas anteriormente. El producto aislado fue 3-(4-hidroxi)fenilmetileno-2,4-pentanediona (6) , véase la figura 3.
Síntesis de 3-(4-hidroxi)fenilmetileno-2,4-pentanediona (6).
2.1.2. La adición Michael de arilmetileno-β-cetoésteres y arilmetileno-2,4-pentanediones a 4-hidroxicumarina
El segundo paso de la reacción es una adición de los arilmetileno-β-cetoésteres obtenidos con 4-hidroxicumarina a través de la reacción Michael, mediante el uso de metóxido de sodio o piperidina como agente básico . Esta reacción puede expresarse como en la figura 4.
La adición de Michael de la 4-hidroxicumarina y los arilmetileno-β-cetoésteres.
La adición Michael de 4-hidroxicumarina y 3-(4-hidroxi)fenilmetileno-2,4-pentanediona (6).
2.2. Docking molecular
Se investigó la interacción de la proteasa del VIH-1 mediante docking molecular con algunos nuevos derivados de 4-hidroxicumarina sintetizados. Se utilizaron datos experimentales de la actividad de algunas 4-hidroxicumarinas para su comparación.
Se realizó un acoplamiento molecular preliminar basado en derivados de 4-hidroxicumarina conocidos, que tienen actividad inhibidora de la proteasa del VIH-1 (Tabla 1) . La cuadrícula se elige para sobredimensionar el ligando que está previamente unido a la enzima (en este caso se eligió el tamaño de 7 Å de la cuadrícula).
Los valores de las funciones 𝐺-score y E-model se han obtenido mediante este método. Se denominan función de puntuación y son equivalentes abstractos de Δ𝐺bind. Estas funciones tienen en cuenta la energía libre debida a los efectos del disolvente, los cambios conformacionales de la proteína y el ligando, las interacciones entre la proteína y el ligando (enlaces de hidrógeno, interacción iónica y fuerzas de van der Waals), la pérdida de energía libre de la congelación de la rotación interna de la proteína y el ligando, la pérdida de energía libre en la energía traslacional y rotacional, causada por la asociación de las dos moléculas, y la energía libre debida a los cambios en el modo vibracional (normalmente ignorada). Si estos valores son más negativos para un ligando, significa que la capacidad de unión de este ligando es mejor. Cuando el ligando muestra capacidad de unión en una conformación determinada, el programa muestra esto como una «buena pose».
Esta enzima está formada por dos cadenas polipeptídicas y pertenece a la familia de las aspartil proteasas con dos residuos de aspartato en la parte inferior del sitio activo. Hemos utilizado la estructura cristalográfica de la proteasa retroviral del VIH-1, unida a un inhibidor peptidomimético BEA369 del Protein Data Bank con el código pdb 1EBY.
Se puede concluir que el ligando (1) tiene la capacidad de unión más fuerte a la proteasa del VIH-1. Los resultados del acoplamiento molecular confirman los datos experimentales sobre el ligando (1).
Con respecto a los ligandos (1)-(5), la puntuación 𝐺 y los valores del modelo E del acoplamiento molecular, para el grupo de compuestos ensayados, se muestran en la Tabla 2.
Las interacciones entre los derivados de 4-hidroxicumarina investigados y los sitios activos de la enzima VIH-1 proteasa se realizan mediante enlaces de hidrógeno y las interacciones de van der Waals. El compuesto más activo, por ejemplo, con la mejor actividad de unión, es el compuesto (10), de acuerdo con los ligandos (1)-(4) (basado en los valores de las funciones de puntuación). Este hecho probablemente se debe a la formación de enlaces de hidrógeno entre el átomo de oxígeno del pirano, el oxígeno del carbonilo de la lactona y uno de los grupos hidroxilos (en la metaposición) unido al anillo aromático de la cadena lateral. Las fuerzas de atracción de Van der Waals también contribuyen a una buena unión. Según el ligando (5), el más activo es el compuesto (7). Hay dos enlaces de hidrógeno para el compuesto (7) con la participación del átomo de oxígeno del pirano, el átomo de oxígeno del carbonilo del anillo de lactona y uno y los fragmentos de proteína correspondientes. Las interacciones de atracción de Van der Waals, en las que probablemente participa el grupo m-nitro con uno de sus átomos de oxígeno, son sustanciales para la unión. El compuesto (7) parece ser más activo que los ligandos experimentales.
2.3. Actividad Biológica en Cultivo Celular (Células MT-4)
Después de demostrar la actividad de algunos derivados de la 4-hidroxicumarina hacia el VIH-PR aislado en experimentos de acoplamiento molecular, sería de interés probarlos además en células MT-4 infectadas por el VIH-1. La evaluación del efecto anti-VIH se realizó mediante un ensayo de infección in vitro, rápido y sensible, basado en la cuantificación de la citolisis por captación del colorante vital (MTT) como punto final de la infección. Además, se consideró el efecto de los inhibidores sobre la actividad endógena de la transcriptasa inversa (RT) de los sobrenadantes de MT-4 infectados con VIH-1 III B como marcador de la capacidad de bloqueo de la replicación del VIH-1. Se infectaron células MT-4 y se incubaron con cada inhibidor durante 72-96 horas, y luego se midió la actividad de la RT en los sobrenadantes celulares según las directrices del ensayo HS-Lenti Kit-RT (Cavidi, Suecia). También se realizó un estudio del efecto directo de las 4-hidroxicumarinas recién sintetizadas sobre la RT recombinante exógena (rRT). Además, todos los compuestos se sometieron a pruebas de actividad anti-RT del VIH-1. La Tabla 3 representa los resultados del ensayo de infección en microtitulación utilizando MTT y la inhibición de la actividad de la RP del VIH-1. Los experimentos se llevaron a cabo en la concentración máxima no tóxica (MNC) para cada compuesto.
En primer lugar, se observa que los compuestos (8), (7) y (12) tienen una mayor MNC, lo que significa que son más citotóxicos que los otros tres compuestos. Sólo dos de ellos (10) y (7) inhibieron la replicación viral en las células MT-4, siendo notable la inhibición inducida por (7) (78%). Utilizando diluciones virales 10x, se estableció que el IC50 era de 0,01 nM. Ningún compuesto mostró efecto tanto sobre la RT endógena como sobre la exógena. Esto significa que la RT no era el objetivo de la acción antiviral. Como se predijo en los estudios de acoplamiento molecular, la actividad de la RP del VIH-1 fue inhibida en un 24-25% por (7) (se hicieron 5 evaluaciones separadas). La discordancia encontrada para (7) entre los datos relativos a la inhibición de la infectividad (alrededor del 75%) y la actividad de la proteasa (25%) podría explicarse por otra actividad, como la anti-integrasa. Es bien sabido que algunos derivados de la 4-hidroxicumarina son inhibidores de la integrasa.
Los experimentos descritos en este trabajo amplían los comunicados anteriormente de que los derivados de la 4-hidroxicumarina podrían servir como nuevos IP no peptídicos. Al igual que el tipranavir y el darunavir, podrían ser eficaces en pacientes con resistencia desarrollada a los IP péptidos. Especialmente, (7) podría utilizarse como farmacóforo para sintetizar nuevos derivados más activos frente a la proteasa del VIH-1.
3. Conclusión
Se sintetizaron seis compuestos de 4-hidroxicumarina mediante una síntesis en dos pasos. El primer paso es la reacción de Knoevenagel entre aldehídos aromáticos y acetoacetato de etilo o acetilacetona. El segundo paso es la adición Michael del arilmetileno-β-cetoéster obtenido o de la arilmetileno-2,4-pentanediona con la 4-hidroxicumarina. Los productos se identifican y caracterizan mediante RMN-1H, EI-EM, FTIR y análisis de elementos.
El estudio de su actividad de unión a la RP del VIH-1 se realizó mediante docking molecular. Se utilizó el cristal del VIH-1 PR, unido al inhibidor peptidomimético BEA369. La mayor actividad de unión la muestra el compuesto (10), según los ligandos experimentales (1), (2), (3) y (4) y el compuesto (7), según el ligando 5. Este hecho se debe probablemente a la formación de enlaces de hidrógeno entre el átomo de oxígeno del pirano, el oxígeno del carbonilo de la lactona y uno de los grupos hidroxilos (en la metaposición) unido al anillo aromático de la cadena lateral. Las fuerzas de atracción de Van der Waals también contribuyen a una buena unión.
Todos los seis compuestos se sometieron a prueba para comprobar la actividad anti-VIH-1 PR en células MT4 infectadas por el VIH-1. La supervivencia celular se evaluó mediante el ensayo MTT y también se midió el % de inhibición de la RP del VIH-1. El compuesto (7) demostró la mayor inhibición de la RP del VIH-1 (25%) y la mayor supervivencia de las células MT4 (78%). El compuesto (7) podría seguir utilizándose como farmacóforo para sintetizar nuevos derivados más activos frente a la RP del VIH-1.
4. Parte experimental
4.1. Síntesis de derivados de 4-hidroxicumarina
4.1.1. Materiales y métodos
Todos los materiales de partida se adquirieron en Merck, Sigma-Aldrich y Fluka. Se utilizan sin más purificación. Los puntos de fusión se midieron en tubos capilares abiertos en un aparato de punto de fusión Büchi 535. Los espectros IR se registraron en el espectrómetro Shimadzu FT-IR 8101 M en nujol, y las frecuencias se expresan en cm-1. Los espectros de RMN 1H se registraron en Brucker 250 MHz en DMSO-d6 o acetona utilizando TMS como patrón interno (los desplazamientos químicos se indican en unidades ppm, las constantes de acoplamiento (𝐽) en Hz). Las abreviaturas son las siguientes: s: singlete, d: doblete, dd: doblete, dq: doble cuarteto, dqui: doble quinteto, t: triplete, y m: multiplete.
El análisis espectral de masas se realizó por ionización de electrones en el espectrómetro de masas Hewlett-Packard 5973 a 70 eV.
4.1.2. Procedimiento general para la preparación de arilmetileno-β-cetoésteres
Se mezclan en un matraz de fondo redondo el aldehído aromático y el etilacetoacetato en cantidades equimolares. También se añaden a la mezcla de reacción piperidina (0,03 mol) y ácido acético glacial (0,04 mol). Esta última se agita a temperatura ambiente durante 90 minutos. Después de añadir 20 mL de éter y/o 150 mL de agua destilada a la mezcla de reacción, se forman cristales de diferentes colores. Estos cristales se filtran y se lavan. A continuación, se secan a temperatura ambiente y se recristalizan en disolventes apropiados, principalmente alcoholes (etanol, propanol y 2-propanol) y agua.
4.1.3. Procedimiento para la preparación de 3-(4-Hidroxi)-fenilmetileno-2,4-pentandiona (6)
4-Hidroxibenzaldehído (3,66 g, 0,03 mol) y acetilacetona (5,14 mL, 0,05 mol) se mezclan en un matraz de fondo redondo. También se añaden a la mezcla de reacción piperidina (0,03 mol) y ácido acético glacial (0,04 mol). Esta última se agita a temperatura ambiente durante 120 minutos. Después se añaden 150 mL de agua destilada a la mezcla de reacción. Se forman cristales de diferentes colores. Estos cristales se filtran y se lavan. Después se secan a temperatura ambiente y se recristalizan en cloruro de metileno.
4.1.4. Procedimiento general para la preparación de productos de condensación con 4-hidroxicumarina
Se mezclan en cantidades equimolares el arilideno-β-cetoéster, obtenido en la reacción anterior, y la 4-hidroxicumarina en 25-30 mL de metanol (utilizado como disolvente). También se añade a los reactivos metóxido de sodio (0,003 mol) como agente básico. La mezcla de reacción se hierve y se agita durante 60 horas a reflujo. La reacción se controla mediante TLC (hexano : acetona = 2 : 1 o hexano : acetona : cloroformo : metanol = 5 : 3 : 2 : 1). Cuando se agotan las cantidades de reactivos, se interrumpe el calentamiento. El residuo de la mezcla de reacción se filtró y se lavó con agua caliente para eliminar la 4-hidroxicumarina que no había reaccionado. Después, el residuo se secó a temperatura ambiente y se recristalizó en el disolvente apropiado (metanol, etanol o 2-propanol).
4.1.5. La adición de Michael entre 3-(4-hidroxibencilideno)-2,4-pentanediona (SS-23) y 4-hidroxicumarina
3-(4-hidroxibencilideno)-2,4-pentanediona (1,02 g, 0,005 mol) y 4-hidroxicumarina (0,81 g, 0,005 mol) se mezclan en ligero exceso de 4-hidroxicumarina en 15-25 mL de metanol. También se añade a los reactivos piperidina (0,003 mol) como agente básico. La mezcla de reacción se hierve y se agita durante 60 horas a reflujo. La reacción se controla mediante TLC (hexano : cloroformo : ácido acético = 10 : 10 : 4, hexano : cloroformo : ácido acético = 10 : 10 : 2, hexano : acetona = 2 : 1). Cuando se agotaron las cantidades de reactivos, se detuvo el calentamiento. El residuo de la mezcla de reacción se filtró y se lavó con agua caliente para eliminar la 4-hidroxicumarina que no había reaccionado. Después, el residuo se secó a temperatura ambiente y se recristalizó en acetona.
4.2. Docking molecular
Todos los cálculos de docking molecular se realizan con los programas Maestro Macromodel Glide del paquete Schrodinger. Todas las estructuras (probadas experimentalmente y nuevas) se minimizan con el programa Macromodel, utilizando el campo de fuerza OPLS2005 y 5000 iteraciones. La estructura de rayos X de la enzima proteasa del VIH-1, junto con el inhibidor BEA369, se obtiene del Protein Data Bank con el código PDB 1EBY.
4.3. Líneas celulares y virus
La línea celular de suspensión linfoblastoide humana MT-4, amablemente proporcionada por Gianfranco Pancino- Instituto Pasteur, (Unite de Regulation des Infections Retrovirales, París, Francia) representa un modelo clásico para la infección productiva experimental con la cepa III B del VIH-1 y se utiliza como objetivo de rutina para el estudio del efecto de los inhibidores putativos del VIH en cultivo celular .
Como fuente de VIH-1, se utilizaron sobrenadantes de la línea H9/HTLV III B, un regalo del Dr. R. Gallo (NIH, Estados Unidos). Se recogieron los sobrenadantes y se centrifugaron para eliminar las células, y se prepararon reservas de virus con contenido de antígeno p24 conocido (460 pg/mL, prueba de antígeno del VIH mAB de Murex), actividad RT (565,3 pg RT/mL, kit de actividad RT HS-Lenti, Cavidi, Suecia), e infectividad (2 × 106 viriones infecciosos/mL, ensayo de infección en microtitulación) . Las células MT-4 y H9/HTLV III B se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con un 10% de FCS (invitrogen). Pruebas de citotoxicidad y ensayos antivirales en cultivo celular
Los compuestos en estudio se disolvieron primero en DMSO y se diluyeron posteriormente en medio de crecimiento celular sin suero fetal. Todas las soluciones se prepararon ex tempore.
Se estudiaron los siguientes parámetros: concentración citotóxica 50-CC50, cuando fue posible (la concentración que impide la muerte del 50% de las células MT-2), concentración máxima no tóxica-MNC, y concentración inhibitoria 50-IC50 (concentración que inhibe en un 50% la replicación viral). La CC50 y la MNC se detectaron mediante el ensayo de captación de MTT . La IC50 se estudió en las células MT-4 mediante el ensayo de infección en microtitulación, explorando la protección de las células frente al efecto citopático del VIH medido mediante el ensayo MTT . Los experimentos en condiciones de infección aguda se realizaron en microplacas de 96 pocillos con 6-8 paralelos/experimento. En cada experimento se realizaron controles celulares (células MT-4 sólo con medio) y controles virales (células MT-4 infectadas por el virus). Para los ensayos antivirus, se añadió el VIH a cada pocillo para obtener una multiplicidad de infección de 0,1, excepto en los controles celulares. Se dejó que el virus se adhiriera durante una hora a 37°C/5% de CO2. Las placas se incubaron durante 72-96 horas a 37°C/5% de CO2. Después, se realizó el ensayo MTT como se ha descrito y la absorbancia de las células viables se midió colorimétricamente a A540 nm. Para todos los experimentos, se calculó el valor medio de cada columna (sólo si los valores en A540 no diferían en ±10%). Para los ensayos antivirales, se compararon los valores medios de las filas experimentales y de control y se trazó el porcentaje de células protegidas (supervivencia celular) bajo la concentración adecuada de la sustancia frente a la concentración de la misma para obtener el IC50. La supervivencia celular (% de protección celular) se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: =% de protección celularA540𝑋-A540ControlHIVA540CellControl-A540ControlHIV×100,(1) donde 𝑋 es el valor medio de A540 de las células infectadas por el VIH tratadas con la concentración apropiada del compuesto en estudio; control VIH es el valor medio de A540 de las células infectadas por el VIH sin ningún compuesto añadido; control celular es el valor medio de A540 de las células no infectadas y no tratadas con el inhibidor.
Como sustancia de referencia, se utilizaron ABC (Abacavir, conocido inhibidor de la transcriptasa inversa nucleósido-NRTI) y pepstatina.
4.4.1. Actividad endógena de la RT y efecto directo de los compuestos sobre la RT
Se comprobó mediante el ensayo HS-Lenti Kit-RT (Cavidi, Suecia). El kit contiene RT recombinante (rRT) como estándar, lo que hace posible la cuantificación de RT. Para el ensayo de RT endógena, se analizaron los sobrenadantes de las células MT-4 infectadas/no infectadas por el VIH después de la incubación con/sin compuestos, de acuerdo con las directrices del fabricante. El nivel de actividad de RT en el sobrenadante se calculó (en pg/mL) a partir del estándar de rRT del VIH-1 establecido en cada kit. El efecto directo de los compuestos sobre la actividad de la rRT se midió con el mismo kit y tenía como objetivo demostrar que la RT es un objetivo de la acción antiviral. Se prepararon diluciones escalonadas adecuadas del inhibidor en tampón de control y se añadieron a la mezcla de reacción. La reacción se llevó a cabo durante 3 horas a 33°C.La actividad de RT de las diluciones estándar se comparó con la que se añadió a los compuestos o con los controles (en los que sólo se añadió la mezcla de incubación sin compuestos).
Un método descrito anteriormente por Broglia et al., 2006 , para la detección de la actividad de la proteasa recombinante se modificó para utilizar la proteasa viral nativa . Como fuente de proteasa nativa del VIH-1, se utilizó de nuevo una suspensión de stock viral concentrado (50x) procedente de sobrenadantes de células H9/HTLV IIIB infectadas crónicamente. La lisis de las partículas virales y la liberación de la enzima activa (proteasa) se realizó utilizando un tampón de disrupción (lisis) que contenía un 2,5% de Triton X-100 en tampón fosfato. La concentración del líquido de cultivo tisular que contenía el virus se realizó por ultracentrifugación en Biofuge Stratos, Heraeus, durante 1 hora, a 4°C y 35000 rev/min. El pellet se resuspendió para obtener un concentrado 50x en tampón de disrupción.
Se preparó la siguiente mezcla de reacción para cada experimento: 1000 𝜇L de tampón fosfato (20 mM, pH 6.0); 20 𝜇L de sustrato de proteasa del VIH III (1 𝜇g/mL, 760 𝜇M; Bachem, Suiza) en DMSO, preparado ex tempore; 20 μL de enzima (stock de VIH) tomado de una solución que contenía 25 𝜇L de tampón de disrupción (lisis) + 100 μL de stock de VIH, incubado 40 min a 37°C antes del experimento.
La actividad de la RP del VIH-1 se midió mediante la lectura espectrofotométrica directa de la utilización del sustrato de la reacción enzimática a 300 nm, a temperatura ambiente y 1 cm de longitud de recorrido, utilizando el espectrofotómetro T80 + UV-Vis (PG instruments). La velocidad de reacción inicial (V0) se ajustó a 0,0020-0,0030 ΔAbs/min variando la actividad enzimática (concentración viral). El compuesto ensayado y el inhibidor de referencia (pepstatina utilizado aquí) se añadieron a la mezcla de reacción antes de la enzima, para realizar el cribado del efecto inhibidor. El IC50 se definió como la concentración del compuesto ensayado que disminuye la velocidad de la reacción en un 50% de la velocidad inicial sin el compuesto ensayado (de referencia).