La acetilcolina es sintetizada a partir de la acetil coenzima A y la colina por la enzima colina acetiltransferasa. En el sistema nervioso, se cree que esta enzima existe principalmente en el citoplasma de las terminales nerviosas. La coenzima A se sintetiza en las mitocondrias y accede a la colina acetiltransferasa tras su transporte a través de la membrana mitocondrial hacia el citoplasma. Además de su síntesis en el hígado, la colina empleada en la producción de acetilcolina procede de fuentes dietéticas. Existe un sistema de transporte en las células endoteliales capilares que se encarga de transportar la colina, en sus formas libre y fosfolipídica, al cerebro. La hidrólisis de los fosfolípidos que contienen colina también puede liberar colina que se utiliza en la síntesis de acetilcolina. Como la colina acetiltransferasa no se satura con las concentraciones de acetil coenzima A y colina que se estima que están presentes en la terminal nerviosa, parece que la tasa de síntesis de acetilcolina depende de la disponibilidad de precursores. La actividad de la enzima también está regulada por la inhibición del producto; al unirse a un sitio alostérico de la colina acetiltransferasa, la acetilcolina inhibe su actividad. Además, la acción de la masa y la actividad neuronal influyen en la tasa de formación de acetilcolina. La regulación a corto plazo de la actividad enzimática se consigue en parte mediante la fosforilación inducida por las proteínas quinasas. No existen inhibidores muy específicos y potentes de la enzima y debe tenerse en cuenta que el bloqueo farmacológico de este paso (por ejemplo, con naftilvinilpiridina) en el ciclo vital de la acetilcolina produce un efecto menos profundo sobre el transmisor que la inhibición del transporte de colina.
Un transportador específico de acetilcolina de baja afinidad es responsable de la captación del transmisor desde el citoplasma hasta las vesículas. Los genes de la acetiltransferasa de colina y del transportador vesicular de acetilcolina están organizados en un único locus génico, y la transcripción de los dos genes suele estar corregida. El (±)-vesamicol es un inhibidor selectivo de este transportador, siendo el L-(-)-vesamicol más potente que el D-(+)-vesamicol. Una vez empaquetada en vesículas, la acetilcolina está sujeta a la liberación inducida por estímulos mediante exocitosis. Varias toxinas potentes influyen en la liberación de acetilcolina, especialmente la toxina botulínica, que inhibe su liberación.
La acetilcolinesterasa neuronal inactiva muy rápidamente la mayor parte de la acetilcolina liberada en el cerebro, aunque la butirilcolinesterasa contenida en las células gliales puede hidrolizar una pequeña proporción de acetilcolina en la sinapsis. En la periferia, la acetilcolinesterasa está presente en los músculos que reciben inervación colinérgica, mientras que la butirilcolinesterasa está más ampliamente distribuida. Se conocen varios inhibidores reversibles (por ejemplo, fisostigmina, BW284C51) e irreversibles (por ejemplo, iso-OMPA) de la acetilcolinesterasa, y estos fármacos tienen el efecto de prolongar los efectos sinápticos de la acetilcolina. Las anticolinesterasas reversibles de segunda generación, como el donepezilo, la rivastigmina (ENA 713), la eptastigmina y la galantamina, se están empleando como tratamientos para la enfermedad de Alzheimer. Algunas colinesterasas de segunda generación han sido retiradas del uso clínico por sus inaceptables efectos secundarios (por ejemplo, la tacrina y el metrifonato). Los inhibidores irreversibles de la acetilcolinesterasa se utilizan como insecticidas y agentes de guerra química. La colina, que es liberada de la acetilcolina por la acetilcolinesterasa, es llevada de nuevo a las terminales colinérgicas por un transportador de alta afinidad, y reutilizada en la síntesis del transmisor. El hemicolinio-3 inhibe de forma potente y reversible el transporte de colina, lo que provoca una profunda disminución de la formación de acetilcolina. A diferencia del hemicolinio-3, el A-4 (un análogo bis 4-metilpiperidina del HC-3), es activo tras su administración periférica. Los análogos de la mostaza nitrogenada de la colina son potentes inhibidores irreversibles de la captación de colina de alta afinidad.