Principios de ensamblaje aprendidos de los estudios in vitro
Las subunidades ribosomales bacterianas 30S y 50S pueden ser reconstituidas in vitro a partir del ARNr más cada una de las proteínas ribosomales. Los estudios detallados de los principios bioquímicos y biofísicos que subyacen al ensamblaje de los ribosomas in vitro han proporcionado paradigmas útiles para guiar las investigaciones de la biogénesis de los ribosomas in vivo.
Uno de los primeros principios revelados por estos experimentos es que el ensamblaje de las proteínas r en las subunidades ribosómicas se produce de forma jerárquica. Los estudios de reconstitución de las subunidades ribosómicas 30S bacterianas definieron un «mapa de ensamblaje» para el orden de asociación de cada proteína r con el ARNr. Según su orden en la jerarquía de unión, las proteínas r se designan como primarias (se unen directamente al ARNr), secundarias (la unión depende de las proteínas de unión primarias) o terciarias (la unión depende de las proteínas de unión secundarias). Aunque este mapa de dependencia ha demostrado ser un punto de partida muy útil, no proporciona ninguna información sobre la cinética de unión de las proteínas. Más bien, la vía de ensamblaje puede reflejar en gran medida el orden en el que cada proteína r se asocia de forma más estable con el ARNr. Además, el mapa de ensamblaje no tiene en cuenta ni la vía de plegado del ARNr 16S independiente de las proteínas r ni el papel que desempeña en el ensamblaje del ribosoma el procesamiento nucleolítico de los precursores del ARNr que se produce in vivo. Más recientemente, estos aspectos del ensamblaje de la subunidad 30S se han explorado con mayor detalle utilizando técnicas como el sondeo químico y de radicales hidroxilo de la conformación del ARN para ensayar los cambios en la conformación del rRNP con el tiempo, y la espectrometría de pulso/masa (PC/MS) para determinar la cinética de la unión de la proteína r al ARNr.
Una posible explicación para la observación de proteínas-r de unión primaria en el mapa de ensamblaje es que sus sitios de unión se crean al menos en parte por la conformación adoptada por el ARNr 16S independientemente de las proteínas-r. De hecho, en consonancia con esta idea y con la opinión de que los ribosomas han evolucionado a partir de un catalizador de ARN, se ha demostrado que el dominio 5′ del ARNr 16S puede plegarse y formar contactos terciarios en ausencia de todas las proteínas-r. Es de suponer que esta estructura terciaria no es completamente estable en ausencia de contactos proteicos y, por lo tanto, es muy probable que se estabilice por la unión de las proteínas-r a sitios que se crean por conformaciones transitorias adoptadas por el ARNr a medida que se pliega. Por lo tanto, el segundo principio sugiere que el plegamiento del ARNr proporciona la base de la unión de la proteína r durante el ensamblaje del ribosoma.
Un tercer principio que ha surgido de los estudios in vitro de los ribosomas bacterianos es que el fortalecimiento de la unión de la proteína r con el ARNr ocurre a medida que el ensamblaje del ribosoma progresa. Muchas proteínas r entran en contacto con múltiples nucleótidos del ARNr. La huella de radicales hidroxilo resuelta en el tiempo ha revelado que algunos de estos nucleótidos están protegidos antes que otros, lo que sugiere que a medida que avanza la biogénesis del ribosoma, las proteínas-r hacen más contactos con el ARNr, integrándose así de forma más estable en los ribosomas.
El establecimiento inicial de unos pocos contactos entre las proteínas-r y el ARNr estabiliza potencialmente ciertas conformaciones del ARN, e induce cambios en la conformación del ARNr para proporcionar sitios de unión para proteínas-r adicionales (secundarias o terciarias). Por lo tanto, la unión de la proteína r consolida las ganancias de plegado del ARN e imparte direccionalidad al proceso de ensamblaje. Esto sugiere un modelo en el que el ensamblaje procede a través de una serie alterna de cambios conformacionales del ARN y de la unión de proteínas, que estabilizan secuencialmente la estructura final del ARN. Los datos cinéticos han revelado que el ensamblaje de las subunidades 30S maduras se produce a través de múltiples vías de plegado de ARN paralelas, todas las cuales convergen en el producto final. Esto ha conducido al concepto de un paisaje de ensamblaje en contraposición a una vía única sobre la que se produce el ensamblaje de las subunidades ribosómicas.
Por último, los estudios in vitro han revelado que el ensamblaje del ribosoma se produce en la dirección 5′ a 3′. La PC/MS y el sondeo químico de la estructura secundaria del ARNr han demostrado que la unión de la proteína r al dominio 5′ del ARNr puede observarse antes de que se establezcan los contactos de la proteína con el dominio 3′ del ARNr. Por el contrario, los ensayos de huella de radicales hidroxilo mostraron una ráfaga inicial de protección de nucleótidos a lo largo del ARNr 16S, lo que indica que el plegamiento del ARN se nuclea desde muchos sitios diferentes repartidos por todo el ARN, y por lo tanto apunta a una falta de direccionalidad de 5′ a 3′ en el ensamblaje. Estas observaciones contradictorias pueden reconciliarse teniendo en cuenta la naturaleza de los diferentes montajes experimentales. La PC/MS mide la cinética de la unión de la proteína al ARNr y, por tanto, sólo pueden detectarse las interacciones estables entre la proteína y el ARNr, ya que las proteínas r que se unen débilmente durante el pulso pueden ser lavadas durante la persecución. Los ensayos de huella, por otro lado, pueden capturar la protección de los nucleótidos tanto por las proteínas-r que interactúan débilmente como por las que se asocian de forma estable. En conjunto, estos datos indican que si bien el ensamblaje del ribosoma puede nuclearse a lo largo de todo el ARNr, la asociación firme final de las proteínas-r con el ARNr se produce en la dirección 5′ a 3′.
Es importante considerar cómo estos experimentos in vitro podrían o no reflejar el ensamblaje in vivo. Por ejemplo, cuando el ensamblaje del ribosoma se produce in vivo, se acopla con la transcripción del ARNr, lo que presumiblemente también contribuye a la direccionalidad observada de 5′ a 3′ de la asociación de la proteína-r. El ARNr puede haber evolucionado para plegarse de 5′ a 3′ a medida que se sintetiza, e incorporar así las proteínas-r, acoplando así el ensamblaje con la transcripción del ARNr. Además, el requisito de un paso de calentamiento durante la reconstitución de las subunidades ribosómicas in vitro y la identificación de una serie de mutantes bacterianos que son defectuosos en la producción de ribosomas indican la necesidad de factores de acción trans durante la biogénesis de los ribosomas in vivo.