Un hidrogel de ADN productor de ARN como plataforma para un sistema de interferencia de ARN de alto rendimiento

Síntesis y caracterización del I-gel

Los cuatro oligonucleótidos de ADN-X (hebras de ADN X01-X04) fueron sintetizados comercialmente por Integrated DNA Technologies (Skokie, IL, USA). Las secuencias de ADN-X (Tabla Suplementaria 5) se diseñaron, prepararon y caracterizaron siguiendo los mismos procedimientos descritos en la literatura con ligeras modificaciones10,13. Las hebras de ADN liofilizadas en escala de 1 μmol se recogieron por centrifugación a 14.000 g durante 15 s a temperatura ambiente. Cada hebra de ADN se resuspendió a una concentración de 1,0 mM en tampón TE 1x (pH 8,0). Cada tubo se agitó y mezcló utilizando MULTI-THERMTM (Benchmark Scientific, NJ, USA) a 1500 rpm durante ~3 h para disolver completamente los oligonucleótidos liofilizados. En total, se combinaron 0,05 μmol (50 μl) de cada cadena de ADN en un tubo de 1,5 ml, y se añadió agua libre de nucleasas con el volumen total de la mezcla de oligonucleótidos a 500 μl. Se distribuyeron 100 μl de la mezcla de oligonucleótidos en tubos de 0,5 ml. Los tubos se colocaron en un termociclador (Bio-Rad, CA, EE.UU.). Los cuatro tipos de oligonucleótidos (X01 ~04) se recocieron con las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 min; y 65 °C durante 2 min, 60 °C durante 5,5 min, disminución de 1 °C manteniendo 1 min a esa temperatura, 20 °C durante 30 s, y disminución a 4 °C para la estabilización y almacenamiento del ADN-X. A continuación, para el intercambio de tampón, la solución de ADN-X recocida (500 μl) en una unidad de filtrado (corte de Mw de 3 kDa) para la microcentrifugación se centrifugó durante 6 h a 15.000 g y 4 °C para reducir el volumen de disolvente. La unidad de filtrado se transfirió a un tubo de centrífuga nuevo. En total, se añadieron 100 μl de agua libre de nucleasas a 4 °C a la unidad de filtrado. La unidad de filtrado se centrifugó durante 4 h a 15.000 g y 4 °C para enjuagar el ADN-X de las sales restantes. El módulo de filtrado se colocó boca abajo en el tubo y se centrifugó a 2.000 g durante 3 minutos a 4 °C. La adición de agua libre de nucleasas y la centrifugación se realizaron dos veces más utilizando el mismo tubo de centrífuga para eliminar completamente la sal residual del ADN-X. El volumen final de la solución de ADN-X será de ~300 μl. El plásmido de expresión de ARNsi (plásmido I) fue adquirido y preparado al máximo por Cosmo Genetech (Seúl, Corea del Sur). Para construir los geles I, los plásmidos I se linealizaron utilizando la enzima de restricción BamHI. El tamaño del gen del ARNsi era de 66 pb con el espaciador (o de 498 pb con el promotor T7) (véase la figura suplementaria 4 para el mapa del plásmido I). Las cantidades de ADN de las muestras se determinaron a partir de su valor de absorción UV/Vis utilizando un BioSpectrometer (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). El ADN-X y los plásmidos lineales se mezclaron primero en una proporción molar predeterminada en presencia de ADN ligasa T4 (Promega, Madison, WI, EE.UU.) para sintetizar el Dgel. Para una relación ADN-X:plásmido I de 1500:1, utilizamos 10,5 μL de 75 μM de ADN-X y 5,25 μL de 100 nM de plásmido en un volumen de reacción de 30 μL. Para el experimento de gel en blanco, se ligó la misma cantidad de material de ADN-X que en el gel-I con ADN ligasa T4. Se mezclaron 10 µl de cada muestra con 2 µl de tampón de carga de gel y se electroforizaron en un gel de agarosa al 0,7 o al 2% a 100 V durante 60 minutos. Todos los ADN (ADN-X, plásmido-I, gel-blanco y gel-I) se confirmaron mediante electroforesis en gel de agarosa (Figuras suplementarias 3, 11, 18). Los Dgels sintetizados se desalaron dos veces utilizando filtros centrífugos microtubulares Amicon de 3-kDa Mw de corte. Para la obtención de imágenes por microscopía electrónica de barrido (SEM), las muestras se liofilizaron en un liofilizador FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, EE.UU.) hasta eliminar toda el agua. Las muestras secadas se rompieron para revelar sus superficies frescas. Después de recubrirlas con una capa de Pt de 2~ 3 nm durante 100 s, se observaron las morfologías de las superficies de estos hidrogeles con un aumento de ~50.000× utilizando un microscopio electrónico de barrido S-3500N (Hitachi, Tokio, Japón) a un voltaje de aceleración de 15 kV (Figura suplementaria 19).

Prueba de estabilidad del I-gel

Se prepararon siete muestras para cada uno de los plásmidos I libres y el I-gel. En cada muestra, se diluyeron 2 µl del plásmido I libre (57 ng) o del gel I (gel 1:1500 que contenía 57 ng de plásmido I) en 12 µl de agua destilada y, a continuación, se añadieron 4 µl de tampón de transcripción optimizado 5 × y se trataron con 3,33 × 10-5 unidades de DNasa I (nº M6101; Promega) hasta 20 µl de volumen final, seguido de una incubación a 37 °C durante 0, 1, 4, 12, 24 y 48 h, respectivamente. Tras la incubación, las muestras de 20 µl se separaron en dos alícuotas de 10 µl, una para la electroforesis y otra para la siguiente transcripción. En cada una de las alícuotas, la reacción de desnaturalización se terminó mediante la adición de 1 µl de solución de parada de DNasa RQ1 y la incubación durante 10 minutos a 65 °C. A continuación, se mezclaron 10 µl de cada muestra con 2 µl de tampón de carga de gel y se electroforizaron en un gel de agarosa al 2% a 100 V durante 60 minutos (Figura suplementaria 13). Otra alícuota de cada muestra se utilizó para la reacción de transcripción para demostrar la eficiencia de transcripción del I-gel después de la reacción de digestión. Los ARNhc se transcribieron a partir del I-gel o de las plantillas de plásmidos I libres (0, 24, 48 h) utilizando el kit de transcripción (Riboprobe; Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ARNhc obtenidos se cuantificaron mediante RT-qPCR como se describe en las secciones Preparación del ARN total y transcripción inversa y PCR en tiempo real y análisis de datos (Tabla Suplementaria 4).

Análisis de expresión e inhibición de proteínas

Los kits de transcripción y traducción acoplados (1-Step Human Coupled IVT Kit – DNA, Catálogo nº 88882) se compraron a Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA), y las reacciones se llevaron a cabo siguiendo los procedimientos sugeridos por el fabricante. En resumen, el lisado de células HeLa, las proteínas accesorias, la mezcla de reacción y el plásmido pcDNA3.1( + ) IRES GFP (0,5 μg/μL; nº 51406; Addgene, Cambridge, MA, USA) se mezclaron en una proporción de 12,5:25:5:2 (v/v) y se incubaron a 30 °C durante 1, 2, 4 y 6 h. Tras los tiempos de reacción indicados, las soluciones de muestra se incubaron durante 24 h a 4 °C tanto para detener la reacción como para garantizar un tiempo suficiente de plegado de la proteína. Para evaluar la eficacia de la interferencia, se añadió plásmido I libre o gel I al lisado celular en presencia de 1000 ng de plásmido GFP. En los experimentos de control para la condición optimizada de I-gel que contenía 57 ng de plásmido I (17,5 nmol), ARNhc mezclado (17,5 nmol y 1,75 μmol; 1 eq y 100 eq a la cantidad de plásmido I, respectivamente) (SN-1003; Bioneer, Seúl, Corea), mezcla de plásmido mezclado (17.5 nmol; mezcla de plásmido de expresión de ARNhc mezclado; Cosmo Genetech), gel de plásmido mezclado (mezcla de plásmido mezclado reticulado enzimáticamente con ADN-X), el componente de gel-I (sólo ADN-X, sólo plásmido-I, o esta mezcla sin reticulación enzimática; es decir, sin formación de gel), o gel-Blanco (reticulación enzimática de ADN-X solamente) se añadieron directamente a la solución de reacción de expresión de GFP. Todas las reacciones se realizaron al menos tres veces. A menos que se indique lo contrario, el volumen de reacción se mantuvo en 25 μL. Los espectros de fluorescencia se analizaron con un espectrofluorofotómetro (FluoroMate FS-2; SCINCO Co., Ltd., Seúl, Corea) para determinar el nivel de expresión de GFP en la solución de lisado celular.

Preparación de ARN total y transcripción inversa

Como control de pico, se añadieron 3 µl de cel-miR-39 (33 fmol/µl; nº 59000; Norgen Biotek Corp., Thorold, ON, Canadá) a todos los lisados celulares preexpresados (20 µl) antes de la extracción de ARN. A continuación, se extrajo el ARN total de 23 µl del lisado utilizando el reactivo TRIzol (Ambion, Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. El ARN total extraído se disolvió en 10 µl de agua tratada con DEPC (Ambion, Thermo Fisher Scientific). A continuación, se poliadenilaron 2 µl de ARN total con 1 mM de ATP en un tampón de poli(A) polimerasa de 1 × que contenía 5 U de poli(A) polimerasa de Escherichia coli (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.) a 37 °C durante 30 minutos en una mezcla de reacción de 20 µl. Para la transcripción inversa, se mezclaron 4 µl del ARN de cola con 1 pmol de cebador RT y una mezcla de dNTP de 0,5 mM y se completó hasta un volumen de 13 µl con agua tratada con DEPC. La mezcla se calentó a 65 °C durante 5 minutos y luego se enfrió rápidamente en hielo. A continuación, la mezcla de reacción se completó hasta un volumen final de 20 µl mediante la adición de 5 mM de ditiotreitol, 1 × de tampón de primera cadena, 40 U de inhibidor de la RNasa y 200 U de transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se incubó a 50 °C durante 1 h, seguida de la inactivación de la enzima a 70 °C durante 15 min. Se diseñaron las secuencias de los cebadores RT (véase la Tabla Suplementaria 5) para la síntesis del ADNc a partir de la secuencia del ARN. El cebador utilizado fue el adaptador 3′ RACE, que se proporciona en el kit FirstChoice RLM-RACE (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Todos los cebadores fueron sintetizados por Cosmo Genetech, excepto el cebador forward cel-miR-39 (Norgen Biotek Corp.). La tasa de recuperación de ARN en cada solución de lisado se estimó a partir de la diferencia entre el valor de TC del control de pico obtenido y el del cel-miR-39 de referencia (no se procedió al proceso de extracción).

PCR en tiempo real y análisis de datos

Las cantidades de ARNhc y ARNm de GFP se cuantificaron mediante qPCR utilizando el sistema de PCR en tiempo real StepOne (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). La qPCR de cada muestra se llevó a cabo en un volumen total de 20 µl con 2 µl de ADNc, 10 µl de 2 × Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) y 10 pmol de cada cebador. La amplificación se realizó con las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 minutos; y 30 ciclos de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s. La qPCR también se realizó con cel-miR-39 como ARN de referencia para obtener la tasa de recuperación del ARN total en cada muestra. El protocolo de qPCR fue el mismo que el descrito anteriormente en esta sección, excepto por los cebadores utilizados, que fueron 10 pmol de un cebador inverso común (el mismo que el cebador inverso del ARNhc) y el cebador directo del cel-miR-39. La curva de fusión de cada producto de ADN amplificado se obtuvo midiendo el cambio de intensidad de la fluorescencia del colorante SYBR Green durante seis veces por muestra mientras se aumentaba la temperatura de 60 °C a 95 °C a un ritmo de + 0,3 °C/s tras la finalización de la qPCR. Los cebadores específicos para la qPCR se diseñaron utilizando el programa Primer3 (http://primer3.ut.ee/) (Tabla suplementaria 5). La expresión relativa de las dianas se determinó mediante el método comparativo 2-ΔΔCT. La cantidad relativa de ARNm de GFP también se confirmó mediante la medición de la intensidad de la banda en el gel de agarosa al 2%. La amplificación del ADNc se llevó a cabo con las mismas condiciones y programa de PCR que se utilizaron para la qPCR descrita anteriormente, a excepción del número de ciclos de PCR (20 para el ARNm de GFP).

Calibración y cuantificación de la cantidad absoluta de ARN

Se obtuvieron curvas estándar para la concentración de ARN y el valor de CT utilizando cada material estándar de ARN. Para el ARNhc, la curva estándar se obtuvo utilizando ARNhc sintetizados adquiridos en Integrated DNA Technologies. Para el ARNm de la GFP, la curva se obtuvo utilizando el ARNm de la GFP extraído de un kit de transcripción (Riboprobe; Promega) según las instrucciones del fabricante. La cantidad de ARN del ARNhc estándar fue informada por Integrated DNA Technologies, mientras que la del ARNm de GFP estándar extraído se determinó a partir de su valor de absorción UV/Vis utilizando el Bioespectrómetro. Los ARN estándar obtenidos se convirtieron en ADNc por transcripción inversa, como se describe en la sección «Preparación del ARN total y transcripción inversa». A continuación, el ADNc se diluyó 10, 100, 1000 y 10.000 veces, y luego se repitió la qPCR tres veces, y los valores de CT obtenidos se utilizaron para obtener una curva estándar. Los valores de CT obtenidos de la RT-qPCR se convirtieron en las concentraciones iniciales de ARN en los lisados celulares mediante un proceso de calibración (Figura suplementaria 6). La cantidad absoluta final de ARN se determinó multiplicando cada tasa de recuperación de ARN (%) y el valor de la cantidad de ARN de la curva de calibración (Tablas suplementarias 1, 2).

Etiquetado celular con Cy5-I-gel

Las células de Riñón Canino de Madin-Darby (MDCK) se obtuvieron del Banco de Líneas Celulares de Corea (Seúl, Corea) y se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina en un incubador humedecido y mantenido con CO2 (5%). Las células MDCK que expresan GFP (MDCK-GFP) se prepararon transfectando el vector pEGFP-N1 en las células con el uso de reactivos Lipofectamine (Thermo Fisher Scientific) según el protocolo del fabricante. A continuación, se clasificaron las células emisoras de GFP mediante el sistema FACSCanto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.). A lo largo de toda la investigación, las células dieron negativo en las pruebas de contaminación por micoplasma. Las células MDCK-GFP cultivadas en placas de 24 pocillos con cubreobjetos (50.000 células por cada pocillo) se coincubaron con el gel Cy5-I (gel I conjugado con Cy5) que contenía hebras de secuencia de ADN X01 conjugadas con Cy5 (correspondientes a 2,625 μM de ADN-X; Integrated DNA Technologies) en medio libre de suero durante 4 h. Para preparar el plásmido Cy5-I, se preparó primero el Cy5-dsDNA (dsDNA conjugado con Cy5) mediante el recocido del X01 conjugado con Cy5 (con un extremo pegajoso adicional 5′-p-GATC) y su contra-cadena complementaria (5′-CGA GTA GGT ACG GAT CTG ACC GCT ATT CAT CGG TCG-3′). A continuación, el Cy5-dsDNA y el plásmido I se mezclaron y ligaron en una proporción molar de 5000:1. El exceso de Cy5-dsDNA no unido se eliminó por centrifugación (12.400 g, 4 °C, 60 min) utilizando filtros centrífugos microtubulares Amicon (50 kDa Mw cutoff) durante 4-5 veces. El Cy5-shRNA (shRNA conjugado con Cy5) fue sintetizado comercialmente (Integrated DNA Technologies). Para los conjuntos de plásmido Cy5-I y Cy5-shRNA, las células se coincubaron con 2,625 nM de cada muestra en medio libre de suero durante 4 h. Para los conjuntos de Lipofectamina-Cy5-I-plasmídica y Lipofectamina-Cy5-shRNA, la Lipofectamina y la muestra conjugada con Cy5 se acomplejaron electrostáticamente mezclándolas en una proporción molar de 1:1 hasta alcanzar una concentración de solución final de 2,625 μM de Lipofectamina y 2,625 μM de sustrato. A continuación, las células se coincubaron con el plásmido Lipofectamine-Cy5-I de 2,625 μM o Lipofectamine-Cy5-shRNA en medio libre de suero durante 4 h, respectivamente. En el caso del control de sólo células, las células se coincubaron con DMEM libre de suero que contenía 1% (v/v) de penicilina (HyClone). Tras 4 h de coincubación, todas las muestras se lavaron dos veces con tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (0,1 M, pH 7,4) y las células se incubaron además durante 6 h en un medio de crecimiento que contenía un 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS; HyClone) y un 1% de penicilina para garantizar un tiempo suficiente de recuperación y captación celular. Las células cultivadas se fijaron con formaldehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con tampón PBS (0,1 M, pH 7,4). Para la obtención de imágenes al microscopio, los cubreobjetos con las células adheridas se montaron en portaobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje acuoso con un agente antidecoloración. Las imágenes de fluorescencia se registraron con un microscopio Zeiss Axioplan 2, y las fotografías se tomaron con una cámara Zeiss Axiocam HR.

Experimento de silenciamiento del gen GFP utilizando el I-gel

En primer lugar, el I-gel que contenía 262,5 µM de ADN-X y 175 nM de plásmido I se incubó con 300 U de ARN polimerasa T7 (Thermo Fisher Scientific) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, la muestra de I-gel se diluyó hasta 100 veces en DMEM sin suero que contenía un 1% de penicilina. A continuación, se añadió 1/6 veces el volumen del complejo I-gel/polimerasa a cada pocillo de una placa de 24 pocillos con cubreobjetos que había sido preplateada con células MDCK-GFP (20.000 células por pocillo) durante 24 h. Para los conjuntos de gel de plásmidos I, mezcla de plásmidos revueltos y plásmidos revueltos, las células MDCK-GFP se co-cultivaron con la misma cantidad molar de cada plásmido y ARN polimerasa T7 que en el caso del I-gel. Para medir el efecto de ARNi del ARNhc desnudo y de la lipofectamina-ARNhc, se utilizó una cantidad 100 veces mayor de cada muestra de ARN en relación con el número de plantilla de plásmido I, teniendo en cuenta la tasa de expresión de ARNhc del gel I calculada a partir del experimento de lisado celular. Para los conjuntos de ARNhc desnudo y ARNhc revuelto, las células MDCK-GFP se coincubaron con 175 nM de la muestra de ARN. Las muestras complejas con Lipofectamina se prepararon según las instrucciones del fabricante. Para los conjuntos de mezclas de Lipofectamina-I-plásmido y Lipofectamina-plásmido revuelto, la Lipofectamina y cada muestra de plásmido se acomplejaron electrostáticamente mezclándolos en una proporción molar de 5:1 para obtener una concentración de solución final de 8,75 nM de Lipofectamina y 1,75 nM de sustrato de plásmido. Para el conjunto Lipofectamina-ARNh, la Lipofectamina y el ARNh libre se acomplejaron electrostáticamente mezclándolos en una proporción molar de 5:1 para obtener una concentración final de solución de 875 nM de Lipofectamina y 175 nM de ARNh. Las células MDCK-GFP se incubaron con las muestras complejas con Lipofectamina preparadas en medio libre de suero durante 4 h. Para el conjunto de sólo células, sólo se incubaron las células MDCK-GFP en el medio libre de suero durante 4 h, sin ninguna muestra. Todas las muestras se lavaron después del periodo de coincubación de 4 h, y las células se incubaron adicionalmente durante 48 h con el medio de crecimiento (DMEM que contenía 10% (v/s) de FBS y 1% de penicilina) para evaluar el efecto de silenciamiento del ARN a 37 °C bajo 5% de CO2. A continuación, las células se fijaron con formaldehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente y se lavaron con tampón PBS (0,1 M, pH 7,4). Para la obtención de imágenes al microscopio, las células fijadas con cubreobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje acuoso con un agente antidecoloración.

Análisis de la expresión génica mediante PCR cuantitativa en células vivas

Todas las muestras se trataron y se incubaron en cada medio celular en la misma cantidad y en las mismas condiciones que se utilizaron en el experimento de silenciamiento del gen GFP descrito anteriormente utilizando la sección I-gel. Después de la incubación, se aspiró el medio celular de las placas de cultivo celular, y las células MDCK-GFP se lavaron una vez con tampón PBS y se trataron con tripsina para desprender las células de cada pocillo de la placa. Las células desprendidas se diluyeron con tampón PBS para desactivar la tripsina, y a continuación se recogieron en un microtubo de 1,5 mL y se pelaron por centrifugación (180 g, 5 min). Se eliminó el sobrenadante y las células se diluyeron con 20 µl de tampón PBS. La solución de suspensión celular (20 µL) se trató con 1 mL de reactivo TRIzol, 3 µL de cel-miR-39 (33 fmol/µL) y 200 µL de solución de cloroformo. La posterior extracción de ARN se realizó según las instrucciones del fabricante. Para cuantificar la cantidad relativa de ARNm de GFP y ARNhc a nivel celular, todas las qPCR de las preparaciones de muestras se llevaron a cabo con el mismo método descrito en las secciones «Preparación del ARN total y transcripción inversa» y «PCR en tiempo real y análisis de datos».

Análisis de imágenes de células para la cuantificación de la intensidad de los píxeles

Por el procesamiento de la imagen de células, los datos se llevaron a cabo utilizando el programa MATLAB (The MatWorks, Inc., Beltsville, MD, USA). Las imágenes de fluorescencia en bruto se importaron a MATLAB, y cada píxel de las imágenes se convirtió en cada componente de la matriz. La distribución de las intensidades de fluorescencia de cada componente se representó gráficamente mediante un histograma. El conjunto de datos se dividió en 256 intervalos.

Análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia

Las células se lavaron una vez con 1 mL de PBS y luego se aspiró el medio de crecimiento de las placas de cultivo celular. A continuación, las células se desprendieron de la placa mediante un tratamiento con tripsina. Las células desprendidas se recogieron en un tubo de 15 mL seguido de una centrifugación que dio como resultado un pellet (180 g, 3 min). El sobrenadante de la solución de tripsina se eliminó y el pellet celular se lavó dos veces con 2 mL de PBS. Las células se resuspendieron en PBS hasta alcanzar una concentración de 50.000 células/mL. A continuación, se prepararon las muestras fijando las células en una solución de formaldehído al 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se analizaron para determinar la intensidad de la fluorescencia de la GFP utilizando el sistema FACSCanto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.).

Niveles de viabilidad relativa en condiciones de oscuridad

Se dispensó una suspensión de células MDCK-GFP (5000 células por pocillo) en una placa de 96 pocillos (Corning Inc., Corning, NY, EE.UU.) y se incubó durante 1 día a 37 °C bajo un 5% de CO2. Una vez que las células se adhirieron a la placa, se coincubaron con diferentes concentraciones del I-gel (correspondientes a la concentración de X-ADN) en el medio de crecimiento (DMEM con 10% (v/v) de FBS y 1% de penicilina) en la oscuridad. El I-gel estaba compuesto por una relación molar X-ADN:I-plásmido de 1500:1. Estas muestras se incubaron durante 6, 24 y 48 horas a 37 °C bajo un 5% de CO2. Al final de cada tiempo de incubación, se añadió a las muestras la solución Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japón) según las instrucciones del fabricante. Tras una incubación adicional de 1 h, se midió la absorbancia a 450 nm mediante un lector de microplacas. Los resultados de esta medición se expresaron como la relación entre la absorbancia de la muestra y la de las células de control negativo sin incubación de la muestra.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con el software Prism 7.05 (GraphPad Software) para la prueba t de Student, ANOVA de una vía con la prueba posterior de comparaciones múltiples de Bonferroni. La prueba posterior de comparaciones múltiples de Holm-Bonferroni se realizó utilizando los resultados de la prueba posterior de comparaciones múltiples de Bonferroni del software Prism 7.05 (GraphPad Software)30. La prueba de normalidad se calculó mediante el test de Shapiro-Wilk. En los resultados de la prueba de Shapiro-Wilk, los datos se distribuyeron de forma aproximadamente normal. La significación estadística se indica como *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.